一种多环芳烃完全抗原,多环芳烃单克隆抗体和分泌该抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗多环芳烃完全抗原，多环芳烃单克隆抗体和分泌该抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法。本发明采用活性酯法将半抗原芘丁酸与BSA偶联获得完全抗原PAB-BSA，用完全抗原PAB-BSA免疫小白鼠，达到理想效价后进行细胞融合，筛选到特异性较高，稳定性较好的单克隆细胞株并进行保藏，该细胞株可以持续分泌单克隆抗体，该单克隆抗体可用于多环芳烃ELISA检测试剂盒的研制。
【专利说明】一种多环芳烃完全抗原，多环芳烃单克隆抗体和分泌该抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法
【技术领域】
[0001]本 发明涉及多环芳烃的完全抗原包括免疫原和包被原，由免疫原免疫实验动物制备的杂交瘤细胞株和该杂交瘤细胞株产生的抗多环芳烃单克隆抗体。
【背景技术】
[0002]多环芳经(PolycyclicAromatic Hydrocarbons, PAHs)是一大类广泛存在于环境中的有机污染物，由两个或多个芳香环构成。主要由煤，石油等有机物的不完全燃烧而产生。许多种类的PAHs及其代谢物可通过呼吸道和皮肤接触进入人体，对人体产生较强的致
癌作用。
[0003]多环芳烃的监测和分析技术主要包括以下几个方面:
[0004]1、由于PAHs对环境造成的污染及对人类健康的威胁，一些国家都通过书面法律和法令规定了对多环芳烃的检测限值要求，包括欧盟76/769/EEC，德国GS认证，LFGB。美国国家环保局(USEPA)将16种PAHs (芘、荧蒽、苯并(b、k)荧蒽、芴、苯并芘、萘、菲、二苯并蒽、苯并蒽、苊、苯并茈、蒽、苊烯、屈、茚并芘)列为优先控制污染物，对其进行严格的监管和控制。我国国家标准(GB3092-1996、GB16297-1996、GB5749-85、GB4284-84、GB7104-94)中规定了空气、食品、饮用水等环境介质中多环芳烃的浓度限量。
[0005]2、不论是土样，水样，还是大气样，环境样品中PAHs的分析主要包括以下几个步骤:样品采集，PAHs提取，净化和浓缩，仪器分析。最常用的提取方法包括液液萃取，固液萃取，超临界萃取等，仪器分析方法主要是气相色谱法或高效液相色谱法。整个过程步骤繁琐，耗时较长，仪器设备昂贵，不适合对大量样品在短时间的分析和监测，并且在此过程中需要用到甲醇，二氯甲烷，丙酮等有机溶剂。除以上两种主要的仪器分析方法外，用于测定PAHs的方法还有荧光法和酶联免疫吸附分析法。与其它方法相比，酶联免疫吸附分析法具有特异性好，灵敏度高，操作简便快捷，且可同时处理大批量样品等忧点。
【发明内容】
[0006]本发明针对目前多环芳烃检测的不足之处，提供一种特异性和亲和力高的单克隆抗体与产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞。
[0007]本发明的思路在于采用多环芳烃完全抗原免疫动物，达到理想效价后进行细胞融合，从而筛选特异性较高的单克隆细胞株，该细胞株可以持续分泌单克隆抗体，便于进行多环芳烃的检出，从而为检测多环芳烃的试剂盒研发奠定了基础。
[0008]本发明的目的之一是提供一种特异性分泌多环芳烃单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株于2013年6月18日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所内的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC N0.7718，分类名为多环芳烃单克隆抗体杂交瘤细胞株。
[0009]本发明的目的之二是提供一种用于免疫实验动物的多环芳烃完全抗原的制备方法，该方法包括如下的步骤:
[0010]1、采用活性酯法将芘丁酸(PBA)分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联，按照1:1:1的比例称取芘丁酸、NHS、DCC溶解于N，N-二甲基甲酰胺(N，N-Dimethylformamide) DMF 中，室温放置过夜，12000rpm,离心 15min,取上清液。
[0011]2、4°C搅拌，将上清液缓慢加入8ml BSA溶液(碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液配制成浓度为15mg/ml的BSA溶液)中继续搅拌5h，
[0012]3、将溶液装入透析袋中，用蒸馏水透析2d，后用pH7.40.01mor/L PBS缓冲液继续透析，每天更换透析液，直到用紫外分光光度计检测不到PBA的特征吸收峰为止。
[0013]4、离心分离出上清液即作为免疫原PBA-BSA，用同样的方法合成PBA-OVA结合物作为ELISA的包被原。
[0014]本发明的目的之三是提供一种用于制备抗多环芳烃单克隆抗体杂交瘤细胞株的方法，该方法包括如下的步骤:
[0015]1、动物免疫
[0016]免疫用小鼠为18g左右的BALB/C，7_8周；免疫之前眼眶取阴性血清。取60 μ g免疫原“PBA-BSA”，用生理盐水稀释到200 μ 1，再加入等体积弗氏完全佐剂进行皮下注射免疫。此后，每隔两周，进行一次加强免疫，免疫量为30yg蛋白/只小鼠。共进行四次加强免疫后，眼眶取血，测定抗血清效价。选择效价较高的小鼠腹腔冲击免疫，免疫量为50 μ g蛋白/只小鼠。效价达到1:10000即可做细胞融合。
[0017]2、细胞融合
[0018]取免疫小鼠的脾脏细胞与状态良好的骨髓瘤细胞SP2/0，采用PEG法进行融合。融合后的细胞用含15%血清的IMDM培养基培养。
[0019]3、阳性细胞株筛选
[0020]用包被原“PBA-OVA”包板，对培养于96孔细胞培养板的细胞采用酶联免疫吸附分析(ELISA)方法做第一次筛选。得到阳性杂交瘤细胞株后，再用“PBA-0VA及BSA”再次包板，采用ELISA方法，做第二次筛选，得到的阳性杂交瘤细胞株进行亚类鉴定，选择IgGl类型的阳性杂交瘤细胞株。最后，对已筛选的阳性克隆采用竞争ELISA法进行复筛，选择具有明显竞争反应的细胞株进行后续操作。
[0021]4、抗体纯化和鉴定，杂交瘤细胞株的筛选
[0022]进一步将步骤3中筛选到的阳性杂交瘤细胞株接种小鼠BALB/C腹腔，制备腹水，采用protein G进行纯化，纯化后的抗体用竞争ELISA法检测效价，选择亲和性较强的抗体进行热稳定性试验，最终筛选出产生热稳定性良好，亲和性较强抗体的杂交瘤细胞株进行保藏。
[0023]更进一步的，上述步骤3和4中，所述竞争ELISA方法包括如下步骤: [0024]以PBA-OVA包被酶标板，100 μ I/孔，4°C过夜；洗涤2次，用2%脱脂奶粉，37°C封闭2h，200 μ I/孔，加入竞争物(按照设计比例加入竞争物(芘)，50μ1/孔；加入一抗(抗血清纯化抗体按照选定比例稀释后加入)，50μ1/孔，37°C孵育lh。设置空白对照和不抑制对照，洗涤2次。加入已稀释的羊抗鼠酶标二抗，100 μ I/孔，37°C孵育lh，洗涤2次。加入TMB底物显色液显色15min，100 μ I/孔。再加入0.5mol硫酸终止显色，双波长(450，630)测定吸光值，记录保存数据。[0025]本发明的再一个目的是提供由上述保藏号为CGMCC N0.7718的杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，该抗体具有高度的亲和性和特异性，能够与多环芳烃进行结合，从而进行检测。
具体实施方案
[0026]下面通过具体实施方案对本发明做进一步说明，但不意味着对本发明保护范围的限制。
[0027]下述方案中所述方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业渠道购买。
[0028]实施方案
[0029]实验I多环芳烃免疫抗原制备
[0030]1、分别称取0.0288g PBA,0.0115g NHS,0.0206g DCC，溶解于2mlDMF中，室温放置过夜，12000rpm,离心15min,分离上清液。
[0031]2、称取0.15g BSA溶于IOml0.05mol/L, pH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中。
[0032]3、在4°C条件下，将步骤I中制备的上清液缓慢加入8ml步骤2所述溶液中，继续搅拌5h
[0033]4、将步骤3中所得的反应混合物装入透析袋中，用蒸馏水透析2d后，用pH7.4，0.01mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液继续透析，每天更换透析液。
[0034]5、每天对上述透析液进行吸收光谱扫描，直到检测不到PBA的特征吸收峰为止
[0035]6、离心分离步骤5中的透析液，上清液即为免疫原PBA-BSA
[0036]实验2多环芳烃包被抗原制备
[0037]1、分别称取0.0288g PBA,0.0115g NHS,0.0206g DCC，溶解于2mlDMF中，室温放置过夜，12000rpm,离心15min,分离上清液。
[0038]2、称取0.15g OVA溶于IOml0.05mol/L, pH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中。
[0039]3、在4°C条件下，将步骤I中制备的上清液缓慢加入8fl步骤2所述溶液中，继续搅拌5h
[0040]4、将步骤3中所得的反应混合物装入透析袋中，用蒸馏水透析2d后，用pH7.4，0.01mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液继续透析，每天更换透析液。
[0041]5、每天对上述透析液进行吸收光谱扫描，直到检测不到PBA的特征吸收峰为止
[0042]6、离心分离步骤5中的透析液，上清液即为包被原PBA-OVA
[0043]实验3保藏号为C6MCC N0.7718杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体制备
[0044]用实验I中制备的免疫原PBA-BSA免疫4只BALB/C小鼠，免疫之前眼眶取阴性血清。免疫方法如下:取60μ g免疫原，用生理盐水稀释到200μ 1，再加入等体积弗氏佐剂，用混匀仪器将溶液和佐剂混匀，形成油包水。将混匀好的免疫原进行皮下注射免疫，打6-8个点。每隔两周进行一次加强免疫，免疫量为30yg蛋白/只小鼠。第四次加强免疫后，ELISA法检测效价，选择效价较高的两只小鼠，免疫剂量为50 μ g蛋白/只小鼠，腹腔冲击免疫一次。
[0045]最后一次免疫后一周，取小鼠脾细胞与SP2/0细胞,采用PEG法进行融合；融合后的细胞用含15%血清的IMDM培养基培养细胞。[0046]用包被原“PBA-OVA”包板，对培养于96孔细胞培养板的细胞采用酶联免疫吸附分析(ELISA)方法做第一次筛选。得到阳性杂交瘤细胞株后，再用“PBA-0VA及BSA”再次包板，采用ELISA方法，做第二次筛选，得到的阳性杂交瘤细胞株进行亚类鉴定，选择IgGl类型的阳性杂交瘤细胞株。最后，对已筛选的阳性克隆采用竞争ELISA法进行复筛，选择具有明显竞争反应的细胞株进行后续操作。
[0047]将以筛选到的阳性杂交瘤细胞株接种小鼠BALB/C腹腔，制备腹水，采用proteinG进行纯化，得到抗多环芳烃单克隆抗体，并用竞争ELISA法检测各抗体的效价，选择亲和性较强的抗体进行热稳定性试验，最终筛选出产生热稳定性良好，亲和性较强抗体的杂交瘤细胞株PYR#6-B7进行保藏。
[0048]实验4单克隆抗体性能测定
[0049]单克隆抗体最低检测限值(LOD)和半数抑制量(IC5tl)的检测
利用方阵滴定法确定 前述多环芳烃单克隆抗体和实验中制备的包被抗原的最适工作浓度，采用不同浓度的芘标准品作为竞争物，其浓度如下:30、10、3.33,0.37,0.12,0.041、
0.014,单位μ g/ml,设置五组平行。
[0050]间接竞争酶联免疫吸附(ELISA)法:将上述实验2制备的包被原PBA-OVA用包被液稀释至2.5 μ g/ml，每孔加100 μ I包被酶标板，4°C，过夜；PBS_T洗涤2次，用2%脱脂奶粉，37°C封闭2h，200 μ I/孔；将竞争物稀释液50 μ I/孔和单克隆抗体稀释溶液50ul/孔混匀后加入酶标板孔中，同时设置零标准对照孔(稀释液中不加竞争物)和空白对照孔(将抗体溶液换为稀释液)，37°C孵育Ih ；PBS-T洗涤2次后，加入已稀释的羊抗鼠酶标二抗，100 μ I/孔，37°C孵育Ih ;PBS-T洗涤2次，加入TMB底物显色液显色15min，100 μ I/孔。再加入0.5mol硫酸终止显色，双波长(450，630)测定吸光值，记录保存数据。以吸光度为纵坐标，以标准浓度的LOG值为横坐标，绘制半对数标准曲线。
[0051]根据标准曲线得出最低检测限值(LOD)和半数抑制量(IC5tl)，检测灵敏度，抑制率
计算公式如下
【权利要求】
1.一种用于免疫实验动物的多环芳烃免疫原芘丁酸-牛血清白蛋白偶联物(PBA-BSA)和包被原芘丁酸-卵清白蛋白偶联物PBA-OVA。
2.权利要求1所述的免疫原和包被原的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: . 1)采用活性酯法将芘丁酸分别与BSA和OVA偶联，按照1:1:1的比例称取(PBA)、N-羟基琥拍酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide, NHS)、N, N- 二环己基碳二亚胺(Dicyclohexylcarbodiimide,DCC)、溶解于 N,N- 二甲基甲酸胺(N,N-Dimethylformamide、DMF)中，室温放置过夜，12000rpm，离心15min，取上清液；. 2)4°C搅拌，将上清液缓慢加入8mlBSA溶液(碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液配制成浓度为.15mg/ml的BSA溶液)中继续搅拌5h ； .3)将溶液装入透析袋中，用蒸馏水透析2d后用pH7.40.01mor/L PBS缓冲液继续透析，每天更换透析液，直到用紫外分光光度计检测不到PBA的特征吸收峰为止； . 4)离心分离出上清液即作为免疫原PBA-BSA，用同样的方法合成PBA-OVA结合物作为ELISA的包被原。
3.—种分泌抗多环芳烃单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，该杂交瘤细胞株的保藏号为 CGMCC N0.7718。
4.权利要求3所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: . 1)动物免疫 .2)取小鼠脾细胞与SP2/0细胞，采用PEG法进行融合 . 3)阳性细胞株筛选. 4)抗体纯化和鉴定，杂交瘤细胞株的筛选与保藏。
5.根据权利要求4所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，所描述的方法包括如下步骤: 1)动物免疫 免疫用小鼠为18g左右的BALB/C，7-8周；免疫之前眼眶取阴性血清。取60 μ g免疫原“PBA-BSA”，用生理盐水稀释到200 μ 1，再加入等体积弗氏完全佐剂进行皮下注射免疫。此后，每隔两周，进行一次加强免疫，免疫量为30yg蛋白/只小鼠。共进行四次加强免疫后，眼眶取血，测定抗血清效价。选择效价较高的小鼠腹腔冲击免疫，免疫量为50μ g蛋白/只小鼠。效价达到1:10000即可做细胞融合； . 2)细胞融合 取免疫小鼠的脾脏细胞与状态良好的骨髓瘤细胞SP2/0,采用PEG法进行融合。融合后的细胞用含15%血清的MDM培养基培养； .3)阳性细胞株筛选 用包被原“PBA-0VA”包板，对培养于96孔细胞培养板的细胞采用酶联免疫吸附分析(ELISA)方法做第一次筛选。得到阳性杂交瘤细胞株后，再用“PBA-0VA及BSA”再次包板，采用ELISA方法，做第二次筛选，得到的阳性杂交瘤细胞株进行亚类鉴定，选择IgGl类型的阳性杂交瘤细胞株。最后，对已筛选的阳性克隆采用竞争ELISA法进行复筛，选择具有明显竞争反应的细胞株进行后续操作； . 4 )抗体纯化和鉴定，杂交瘤细胞株的筛选将步骤3)中筛选到的阳性杂交瘤细胞株接种小鼠BALB/C腹腔，制备腹水，采用protein G进行纯化，纯化后的抗体用竞争ELISA法检测效价，选择亲和性较强的抗体进行热稳定性试验，最终筛选出产生热稳定性良好，亲和性较强抗体的杂交瘤细胞株进行保藏。
6.根据权利要求5所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，步骤3)和4)中，所述竞争ELISA方法包括如下步骤: 以PBA-OVA包被酶标板，IOOul/孔，4°C过夜；洗涤2次，用2%脱脂奶粉，37°C封闭2h，200ul/孔，加入竞争物(按照设计比例加入竞争物(芘)，50ul/孔；加入一抗(抗血清纯化抗体按照选定比例稀释后加入)，50ul/孔，37°C孵育lh。设置空白对照和不抑制对照，洗涤2次。加入已稀释的羊抗鼠酶标二抗，100 μ I/孔，37°C孵育lh，洗涤2次。加入TMB底物显色液显色15min，100 μ I/孔。再加入0.5mol硫酸终止显色，双波长(450，630)测定吸光值，记录保存数据。
7.权利要求3所述的杂交瘤细胞株所分泌的抗多环芳烃单克隆抗体。
【文档编号】C07K16/18GK103965349SQ201310413841
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年9月12日 优先权日:2013年9月12日
【发明者】许丽, 赵鲁, 程言君 申请人:轻工业环境保护研究所