含有两个亮氨酸重复单元的抗菌肽及制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种含有两个亮氨酸重复单元的抗菌肽及制备方法和应用，含有2个亮氨酸重复单元抗菌肽其氨基酸序列如SEQ?No.1所示。本发明首先根据亮氨酸重复单元的基序和抗菌肽的氨基酸组成特点，得到亮氨酸重复单元的氨基酸序列，并将重复单元串联，以提高其肽链长度和净电荷数目；然后使用多肽合成仪，进行固相合成法合成多肽粗品；最后将合成多肽使用高效液相色谱进行纯化，并利用电喷雾质谱法进行鉴定。本发明的有益效果：(1)该多肽是根据生物体广泛存在的亮氨酸重复单元为基础而设计得到，具有广谱抗菌活性；(2)该多肽由22个氨基酸组成，肽链较短，制备方法和技术成熟，合成成本低。
【专利说明】含有两个亮氨酸重复单元的抗菌肽及制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种含有两个亮氨酸重复单元的抗菌肽及制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]抗生素的应用提高了人类健康和动物生产效率。但耐药性菌株、药物残留等问题也随之出现，一直困扰着人类。由于产生药物残留及细菌耐药性问题，因此亟须发现新型抗菌制剂。抗菌多肽作为人体重要免疫组成部分具有重大的发展潜力，是科研工作者研究的热点。一般认为，抗菌肽是通过物理吸附等作用来破坏细菌的细胞膜，从而杀死细菌，因此细菌产生耐药性的几率较小。抗菌肽一般是由10至50个氨基酸所组成，净电荷一般在+2~+9范围内，疏水性氨基酸的比例可以达到50%或更多。
[0003]抗菌肽的上述结构和组成特征与许多蛋白质组成基序相似。亮氨酸重复单元为大家所广泛周知，因其富含疏水性残基亮氨酸而得名。亮氨酸重复单元广泛存在于包括动物、植物和微生物在内的超过60000种生物体蛋白质中。其中一种重要的亮氨酸重复单元的基序为:LxxLxLxxNxL,包含这些基序的蛋白质可以形成螺旋、折置等多样的结构形式。因此，本发明以此基序作为基本单位，通过合成由单个亮氨酸重复单元及将2个亮氨酸重复单元串联的抗菌肽，从而设计得到全新的抗菌肽。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种含有两个亮氨酸重复单元的抗菌肽及制备方法和应用，本发明将具有亮氨酸重复单元的抗菌肽进行串联，从而得到全新的抗菌肽，以提高其抗囷效果。
[0005]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0006]1、一种含有两个亮氨酸重复单元的抗菌肽，序列如SEQ N0.1所示。
[0007]2、如上所述的一种含有两个亮氨酸重复单元的抗菌肽，制备方法如下:
[0008](I)根据亮氨酸重复单元的基序LxxLxLxxNxL，将疏水性残基和正电荷残基充实到基序中去，从而得到亮氨酸重复单元的氨基酸序列(Leu)1，序列如SEQ N0.2所示；将这一重复单元串联，以提高其肽链长度和净电荷数目，得到含有两个亮氨酸重复单元的抗菌肽(Leu)2，序列如SEQ N0.1所示；
[0009](2)采用固相化学合成法，通过多肽合成仪合成这两条多肽粗品；
[0010](3)将合成的多肽使用反相高效液相色谱进行纯化，并利用电喷射质谱法对合成的多肽进行鉴定，完成多肽的制备。
[0011]3、如上所述的一种含有两个亮氨酸重复单元的抗菌肽，采用美国临床实验室标准化研究所推荐的测定最小抑菌浓度(MIC)的方法，(Leu)2的最小抑菌浓度为2-4 μ M，显示出很强的抑制革兰氏阴性和阳性菌生长的活性。从而为实现本发明目的更进一步提供含有两个亮氨酸重复单元的抗菌肽，在制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。
[0012]本发明的有益效果:(1)该多肽是根据生物体广泛存在的亮氨酸重复单元为基础而设计得到，具有广谱抗菌活性；(2)该多肽由22个氨基酸组成，肽链较短，制备方法和技术成熟，合成成本低。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为抗菌肽(Leu)1的质谱图。
[0014]图2为抗菌肽(Leu)2的质谱图。
【具体实施方式】
[0015]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0016]实施例1:亮氨酸重复单元抗菌肽序列的设计
[0017]已知亮氨酸重复单元的基序为LxxLxLxxNxL，其中L为亮氨酸，x为任意氨基酸。抗菌肽的氨基酸组成特点主要为疏水性和净正电荷。因此，我们将疏水性残基和正电荷残基充实到基序中去，从而得到亮氨酸重复单元的氨基酸序列LeuArgArgLeuTrpLeuArgAlaAsHArgLeu0同时还将这一重复单元串联，以提高其肽链长度和净电荷数目，得到两条抗菌肽序列。如表1所示。
[0018]表1抗菌肽的氨基酸序列和分子量
【权利要求】
1.一种含有两个亮氨酸重复单元的抗菌肽，其特征在于:序列如SEQ N0.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种含有两个亮氨酸重复单元的抗菌肽，其特征在于，制备方法如下: (1)根据亮氨酸重复单元的基序LxxLxLxxNxL，将疏水性残基和正电荷残基充实到基序中去，从而得到亮氨酸重复单元的氨基酸序列(Leu)1，序列如SEQ N0.2所示；将这一重复单元串联，以提高其肽链长度和净电荷数目，得到含有两个亮氨酸重复单元的抗菌肽(Leu)2，序列如SEQ N0.1所示； (2)采用固相化学合成法，通过多肽合成仪合成这两条多肽粗品； (3)将合成的多肽使用反相高效液相色谱进行纯化，并利用电喷射质谱法对合成的多肽进行鉴定，完成多肽的制备。
3.—种如权利要求1所述的一种含有两个亮氨酸重复单元的抗菌肽的应用，其特征在于:在制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感`染性疾病药物中的应用。
【文档编号】C07K14/00GK103788184SQ201310715120
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2013年12月13日 优先权日:2013年12月13日
【发明者】马清泉, 单安山, 董娜, 吕银凤, 焦文静 申请人:东北农业大学