用于制备卵黄抗体的大肠杆菌菌毛抗原的提取方法和制备卵黄抗体的方法
【专利摘要】本发明提供一种用于制备卵黄抗体的大肠杆菌菌毛抗原的提取方法，包括：1)培养大肠杆菌，收集菌体，破碎并溶解菌体，制备含大肠杆菌菌体的初提取液；2)将所述初提取液经4FF凝胶层析柱纯化获得含大肠杆菌菌毛蛋白的纯化液；3)用丙酮沉淀去除大肠杆菌菌毛蛋白的纯化液中的内毒素，获得大肠杆菌菌毛抗原。本发明利用凝胶过滤层析得到了纯度较高的菌毛蛋白，且去除了菌体释放的内毒素等可能干扰免疫效果的因素。制备的亚单位疫苗免疫蛋鸡，成功获得了高效价的抗体，为相关疾病的预防和治疗提供了新思路。
【专利说明】用于制备卵黄抗体的大肠杆菌菌毛抗原的提取方法和制备卵黄抗体的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种改进的大肠杆菌菌毛提取方法；
[0002]本发明还涉及一种卵黄抗体的制备方法。
【背景技术】
[0003]大肠杆菌(Esc herichiacoli) —方面是寄生于动物肠道的一类正常细菌,另一方面也表现出一定的病原性而引起各种疾病。致病性的大肠杆菌可引起人和动物的腹泻以及败血症，特别是对幼龄动物的危害最大。在规模化养猪生产中，大肠杆菌感染可导致的仔猪的黄痢、白痢、水肿病等，并且发病率和死亡率占所有仔猪腹泻的56.2%和24.7%，给养殖业带来不小的经济损失。
[0004]肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)是引起仔猪腹?写的一种主要致病菌，按菌毛类型可分为Κ88、Κ99、987Ρ及F18。其致病机理是通过菌体表面密集的菌毛，首先粘附到宿主的小肠粘膜刷状缘上皮细胞的受体上，抵抗肠道蠕动及内容物的清洗，实现定殖后并释放一种或两种肠毒素(enterotoxin),引起细胞内水和电解质平衡失调，从而产生水样腹泻。由此可以看出菌毛是致病过程的首要条件，也是传统疫苗研究中的重要目标抗原。
[0005]在当前抗生素使用受到严格限制的条件下，大肠杆菌的预防和治疗需另辟蹊径，其中注射疫苗和口服抗体是未来的主要发展趋势。因此，寻找一种有效的抗原变得非常重要。研究发现，大肠杆菌全菌体与分离纯化后的菌毛蛋白对比，后者免疫制备的卵黄抗体效价明显高于前者，且特异性好。传统的菌毛提取方法主要为热搅拌脱毛法，即将大肠杆菌的菌体在60°C左右的条件下水浴搅拌一定时间，离心后的上清再通过等电点沉淀或硫酸铵沉淀获得纯度较高的菌毛蛋白。然而在实际研究过程中，不同血清型的菌株使用以上方法难以获得相应的菌毛蛋白，这促使我们针对不同菌株应采取不同的物理化学方法，来得到纯化的菌毛蛋白。
[0006]在制备卵黄抗体时，采用细菌菌毛作为抗原免疫鸡获得卵黄抗体，传统的细菌菌毛提取过程中，很容易夹杂细胞壁中的一种成分，叫做脂多糖，也就是内毒素。这是因为即使是不剧烈的加热搅拌，细菌细胞壁也很容易破损，从而产生大量内毒素。内毒素虽然抗原性不强，但对于宿主细胞是有毒性的，可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等症状，对免疫效果有影响。菌种不同，内毒素的毒性强度不一。发明人曾采用不除内毒素的大肠杆菌F18菌毛抗原免疫蛋鸡，蛋鸡出现了大量死亡，因此有必要将内毒素清除出纯化的抗原提取物。
【发明内容】
[0007]本发明一个目的在于提供一种用于制备卵黄抗体的大肠杆菌菌毛抗原的提取方法。[0008]本发明通过以下技术方案实现:
[0009]用于制备卵黄抗体的大肠杆菌菌毛抗原的提取方法，包括下述步骤:
[0010]I)培养大肠杆菌，收集菌体，破碎并溶解菌体，制备含大肠杆菌菌体的初提取液；
[0011]2)将所述初提取液经4FF凝胶层析柱纯化获得含大肠杆菌菌毛蛋白的纯化液；
[0012]3)用丙酮沉淀去除大肠杆菌菌毛蛋白的纯化液中的内毒素，获得大肠杆菌菌毛抗原。
[0013]根据大肠杆菌菌毛类型，具体的提取方法为:
[0014](I)用改良Minca培养基发酵肠毒素大肠杆菌K99，收集菌体。在含有2% Triton的PBS中充分搅匀沉淀，冰浴超声破碎。稀释超声后的菌体，经中空纤维柱过滤，并收集滤出液。超滤浓缩滤出液，40%硫酸铵沉淀，PBS清洗后复溶。样品液经4FF凝胶柱层析，样品液加入丙酮后沉淀蛋白，去除内毒素，最后以PBS复溶沉淀，即得K99菌毛抗原。
[0015](2)用改良Minca培养基发酵肠毒素大肠杆菌987P，加2M尿素的PBS溶解菌体(体积比为10:1)。将充分溶解的菌体进行5次匀浆。差速离心处理匀浆液，去沉淀。上清用4FF层析柱纯化，收得的样品利用40%饱和度硫酸铵进行浓缩。样品液加入丙酮后沉淀蛋白，去除内 毒素，最后以PBS复溶沉淀，即得987P菌毛抗原。
[0016]本发明的另一个目的是提供一种以大肠杆菌菌毛为抗原制备卵黄抗体的方法，包括下述步骤:
[0017]I)从大肠杆菌中提取大肠杆菌菌毛,制备大肠杆菌菌毛溶液；
[0018]2)在所述大肠杆菌菌毛溶液中加入佐剂进行乳化，制备疫苗；
[0019]3)用所述疫苗免疫蛋鸡获得特异性卵黄抗体。
[0020]以上方法所得的抗原制备疫苗免疫蛋鸡，得到特异性卵黄抗体。ELISA结果显示，抗体效价均达到1:10000以上，证明制备的蛋白抗原性良好，可以作为疫苗的候选抗原。
[0021]本发明技术优势在于利用凝胶过滤层析得到了纯度较高的菌毛蛋白，且去除了菌体释放的内毒素等可能干扰免疫效果的因素。制备的亚单位疫苗免疫蛋鸡，成功获得了高效价的抗体，证明制备的蛋白具备良好的抗原性，为相关疾病的预防和治疗提供了新思路。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1肠毒素大肠杆菌K99菌毛蛋白纯化前后检测。
[0023]图2肠毒素大肠杆菌987P菌毛蛋白纯化前后检测。
[0024]图3鲎试剂检测丙酮处理前后内毒素含量变化
[0025]图4蛋鸡免疫效价检测。
【具体实施方式】
[0026]以下实施例中所用试剂均为商购，配制如下:
[0027]PBS 缓冲液(0.01M) =IOgNaCl, 35.8g Na2HP04.12H20，2.5g KH2P04，2.5g KC1，加入注射用水定容至10L。
[0028]改良Minca培养基:称取培养基27.7g，甘油5mL，加入IL注射用水加热搅拌，并煮沸至完全溶解，116°C高压灭菌30min。
[0029]【实施例1】肠毒素大肠杆菌K99菌毛提取[0030]一级种子制备
[0031]配制IOOmL改良Minca培养基于500mL三角瓶，116°C灭菌30min。冷却后接种K99，接种量为2%o，37°C培养12-18h，转速为200rpm。
[0032]二级种子制备
[0033]配制两份500mL改良Minca培养基于两个2000mL三角瓶，116°C灭菌30min。冷却后接种K99 一级种子液，接种量为2%。，371:培养12-18h，转速为200rpm。
[0034]15L发酵罐高密度发酵
[0035]配制15L改良Minca培养基于发酵罐中，并加入适量的消泡剂，116°C灭菌30min。灭囷完毕后，待te内培养温度37 C时，保持12-24h进彳丁无囷检验。无囷检验合格后接入种子液，接种量为1000mL,培养24小时。在培养过程中，通过高密度发酵罐自动补入葡萄糖液，甘油和酵母浸粉:蛋白胨(1:1)。用5mol/L氨水和2mol/L HCl调节pH维持在7.4左右，搅拌速度200rpm，溶氧量40 %。
[0036]8000rpm离心30min收集菌体,并采用以下方法粗提取菌毛蛋白:
[0037]称取湿重100g左右的K99菌体，加入400mL PBS充分搅拌溶解后，8000rpm离心30min，弃上清。沉淀中加入400mLPBS (含2% Triton)，使菌体沉淀完全溶解混匀。充分搅拌I小时后，冰浴超声lh。超声后的样加入PBS稀释至1L。中空纤维处理至剩余约700mL时，再用2-3LPBS清洗，收集滤出液约3-4L。滤液浓缩至600_800mL。浓缩液中加入固体硫酸铵至40%饱和度，充分搅拌后，过夜沉淀。次日8000rpm离心30min，沉淀用PBS清洗两次后，终沉淀以PBS复溶。
[0038]琼脂糖凝胶4FF柱层析
[0039]首先用PBS以8ml/min流速平衡4FF琼脂糖凝胶柱2_3个体积，同时打开紫外检测仪。待基线稳定后，量取100mL菌毛粗提液，开始上样，保持稳定的流速。上样结束后继续以PBS平衡和洗脱。待紫外检测仪的0.05A值快速上升至50-100，开始收集蛋白样品。A值回落至100左右停止收集。详细记录各步骤的时间节点。
[0040]【实施例2】肠毒素大肠杆菌987P菌毛提取
[0041]987P发酵方法同K99，收集菌体后，采用以下方法提取菌毛蛋白:
[0042]1.称取湿重100_150g987P发酵菌体，加入PBS (含2M尿素)溶解(菌体与PBS体积比为1:10)，用搅拌器充分搅匀。将充分溶解的菌体经压力破碎仪进行5次匀浆。用8000rpm离心30min处理匀浆液，去沉淀。上清再用18000rpm/30min离心处理，去沉淀。终上清经4FF层析柱纯化。
[0043]2.用PBS (含2M尿素)以8ml/min流速平衡4FF琼脂糖凝胶柱2_3个体积，同时打开紫外检测仪。待基线稳定后，量取100mL菌毛粗提液，开始上样，保持稳定的流速。上样结束后继续以PBS平衡和洗脱。待紫外检测仪的0.05A值快速上升至50-100，开始收集蛋白样品。A值回落至100左右停止收集。详细记录各步骤的时间节点。
[0044]【实施例3】内毒素的去除
[0045] 上述方法所得样品液以1:1体积比例加入丙酮(冰浴条件下)，搅拌处理IOmin, 1000Orpm离心20min去上清。收集沉淀，PBS和丙酮按体积比1:9加入,冰浴搅拌lOmin，1000Orpm离心弃尽上清。待丙酮挥发完全以PBS复溶沉淀，即得菌毛抗原。以凝胶法鲎试剂测定内毒素含量的变化，图3可以看出丙酮处理后，细菌内毒素与鲎试剂反应出现阳性的最高稀释倍数明显下降，即内毒素含量显著降低，经免疫蛋鸡后未出现不良反应，所得抗原可用于蛋鸡免疫。
[0046]采用BCA法分别检测制备的菌毛抗原蛋白的浓度，二者经适当的PBS溶解后，蛋白浓度保持在l_2mg/mL。采用SDS-PAGE方法检测蛋白的纯度，检测结果见附图。与纯化前相t匕，可以看出蛋白纯度较好，杂带少，纯化效果良好。
[0047]【实施例4】蛋鸡免疫比较试验
[0048]1.制备疫苗以4FF柱层析纯化前后的蛋白样品分别制备疫苗做蛋鸡免疫比较试验。向实施例3所得最终蛋白样品与4FF柱层析纯化前的蛋白样品中加入等体积弗氏完全佐剂进行乳化，制备疫苗。
[0049]2.蛋鸡免疫将临开产海兰灰蛋鸡随机分为空白组(注射PBS)、未纯化组、纯化组，采用胸部和腿部肌肉多点注射。
[0050]首免2周后用弗氏不完全佐剂乳化抗原加强免疫一次，间隔2周再次免疫，二免后每周各组随机采集鸡蛋，间接ELISA监测抗体效价变化。
[0051]3.结果显示，蛋鸡免疫后无不良反应发生，产蛋略有影响，但2-3天后即可恢复。在第二次免疫后经检测 ，纯化组肠毒素大肠杆菌K99、987P的效价分别上升至1:8000、1:16000，且在第三次免疫后达到最高，分别为1:40000和1:80000(图4)，随后在高水平保持2-3个月。而未纯化组的效价上升缓慢，且最终效价水平低于纯化组。试验证明纯化的菌毛蛋白抗原性好，可诱导产生高效价抗体。
【权利要求】
1.用于制备卵黄抗体的大肠杆菌菌毛抗原的提取方法，包括下述步骤: 1)培养大肠杆菌，收集菌体，破碎并溶解菌体，制备含大肠杆菌菌体的初提取液； 2)将所述初提取液经4FF凝胶层析柱纯化获得含大肠杆菌菌毛蛋白的纯化液； 3)用丙酮沉淀去除大肠杆菌菌毛蛋白的纯化液中的内毒素，获得大肠杆菌菌毛抗原。
2.权利要求1所述的提取方法，其中步骤2)所述的4FF凝胶层析柱纯化包括:用PBS以8ml/min流速平衡4FF琼脂糖凝胶柱2_3个体积，同时打开紫外检测仪，待基线稳定后，量取菌毛粗提液上样，上样结束后继续以PBS平衡和洗脱，待紫外检测仪的0.05A值快速上升至50-100，开始收集蛋白样品，A值回落至100左右停止收集。
3.权利要求1所述的提取方法，其中所述大肠杆菌为大肠杆菌K99或987P菌株。
4.权利要求3所述的提取方法，包括下述步骤: 用改良Minca培养基发酵肠毒素大肠杆菌K99,收集菌体； 在含有2% Triton的PBS中充分搅匀沉淀，冰浴超声破碎； 稀释超声后的菌体，经中空纤维柱过滤，并收集滤出液； 超滤浓缩滤出液，用40%硫酸铵沉淀，PBS清洗后复溶； 样品液经4FF凝胶柱层析纯 化后，收集纯化液加入丙酮后沉淀蛋白，去除内毒素； 以PBS复溶沉淀，即得大肠杆菌K99菌毛抗原。
5.权利要求3所述的提取方法，包括下述步骤: 用改良Minca培养基发酵肠毒素大肠杆菌987P，加2M尿素的PBS溶解菌体； 将充分溶解的菌体进行匀浆，差速离心处理匀浆液，去沉淀； 上清用4FF层析柱纯化，收得的样品利用40%饱和度硫酸铵进行浓缩获得纯化液； 纯化液加入丙酮后沉淀蛋白，去除内毒素； 以PBS复溶沉淀，即得大肠杆菌987P菌毛抗原。
6.一种卵黄抗体的制备方法，包括下述步骤: 1)从大肠杆菌中提取大肠杆菌菌毛，制备大肠杆菌菌毛溶液； 2)在所述大肠杆菌菌毛溶液中加入佐剂进行乳化，制备疫苗； 3)用所述疫苗免疫蛋鸡获得特异性卵黄抗体； 其中，步骤I)所述从大肠杆菌中提取大肠杆菌菌毛包括: Ia)培养大肠杆菌，收集菌体，破碎并溶解菌体，制备含大肠杆菌菌体的初提取液； Ib)将所述初提取液经4FF凝胶层析柱纯化获得含大肠杆菌菌毛蛋白的纯化液； Ic)用丙酮沉淀去除大肠杆菌菌毛蛋白的纯化液中的内毒素，获得大肠杆菌菌毛溶液。
7.权利要求6所述的制备方法，其中步骤I)所述从大肠杆菌中提取大肠杆菌菌毛包括: 用改良Minca培养基发酵肠毒素大肠杆菌K99,收集菌体； 在含有2% Triton的PBS中充分搅匀沉淀，冰浴超声破碎； 稀释超声后的菌体，经中空纤维柱过滤，并收集滤出液； 超滤浓缩滤出液，用40%硫酸铵沉淀，PBS清洗后复溶； 样品液经4FF凝胶柱层析纯化后，收集纯化液加入丙酮后沉淀蛋白，去除内毒素； 以PBS复溶沉淀，即得大肠杆菌K99菌毛。
8.权利要求6所述的制备方法，其中步骤I)所述从大肠杆菌中提取大肠杆菌菌毛包括:用 改良Minca培养基发酵肠毒素大肠杆菌987P，加2M尿素的PBS溶解菌体；将充分溶解的菌体进行匀浆。差速离心处理匀浆液，去沉淀；上清用4FF层析柱纯化，收得的样品利用40%饱和度硫酸铵进行浓缩获得纯化液；纯化液加入丙酮后沉淀蛋白，去除内毒素；以PBS复溶沉淀，即得大肠杆菌987P菌毛。
【文档编号】C07K1/30GK104017060SQ201410217533
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年5月22日 优先权日:2014年5月22日
【发明者】陈娟, 赵秦, 孙盼, 柴向东, 王荣, 刘晓璐, 刘超, 岳静, 孟美玲 申请人:深圳市海王英特龙生物技术股份有限公司