一种鲎素肽-抗体融合蛋白及制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种鲎素肽-抗体融合蛋白，包括至少一个鲎素肽单元，编码鲎素肽单元的基因T直接连接或通过编码接头单元的连接肽基因LU连接于编码抗体单元的基因M的重链或轻链的3’端或5’端；该融合蛋白的制备方法包括(1)将鲎素肽基因通过接头基因或直接与抗体基因相连，并连接到表达载体中，得到重组表达质粒，(2)将含有(T-L)N–M的载体转入到宿主细胞中，并进行融合蛋白的诱导表达；(3)纯化获得融合蛋白。本发明的鲎素肽-抗体融合蛋白作为抗体靶向药物具有很好的应用前景。
【专利说明】一种鲎素肽-抗体融合蛋白及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及肿瘤学、病原微生物学和生物药学领域，本发明涉及一种鲎素肽-抗体融合蛋白及制备方法，具体而言，本发明提供了可以产生靶向肿瘤或致病菌杀伤作用的含有鲎素肽的融合蛋白、及其制备方法，进而为肿瘤和病原微生物感染的靶向治疗提供了优良的候选药物。
【背景技术】
[0002]鲎素肽来源于鲎血细胞提取物，是含有17-18个氨基酸残基的多肽，其氨基端和羧基端都是碱性氨基酸，羧基端还具有一个独特的精氨酸-酰胺结构。四个Cys形成2个二硫键维持當素肽折叠成发夹结构。目前发现了 5种當素肽,tachyplesin I和tachyplesinII发现于东方當血细胞中，tachyplesin III发现于圆尾當血细胞中，polyphemusin I和polyphemusin II发现于美洲鲎血细胞中，其各自氨基酸序列如下:
[0003]
【权利要求】
1.一种鲎素肽-抗体融合蛋白，其特征在于:编码所述融合蛋白的基因序列包括至少一个鲎素肽单元，编码鲎素肽单元的基因T直接连接或通过编码接头单元的连接肽基因LU连接于编码抗体单元的基因M的重链或轻链的3’端或5’端，鲎素肽-抗体偶联表达方式为:(T-LU)n-M,其中，N是≥I的整数， 其中，所述當素妝单兀为:tachyplesin 1、tachyplesin I1、tachyplesin II1、polyphemusin I和polyphemusin II五种當素妝中的至少一种， 其中，所述接头单元是基因工程技术所能利用的连接肽，是根据具体采用的抗体单元及鲎素肽单元的重叠次数而设计，LU为核酸，编码连接肽， 其中，所述抗体单元是单克隆抗体，包含鼠或人或人源化的重链可变区和/或轻链可变区的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的鲎素肽-抗体融合蛋白，其特征在于:所述鲎素肽单元为以五种鲎素肽氨基酸序列为基础进行的增加、删减、重复、联合，替代和修饰而得到的对癌细胞或致病菌具有生长抑制或毒性活性的多肽，所述编码鲎素肽单元的基因T编码上述任意一种鲎素肽。
3.根据权利要求1所述的鲎素肽-抗体融合蛋白，其特征在于:所述鲎素肽单元具体包括tachyplesin I,以Tl表示和tachyplesin II,以T2表示,上述T为编码Tl和T2的核酸。
4.根据权利要求1所述的鲎素肽-抗体融合蛋白，其特征在于:所述鲎素肽接头单元具体为G4S,其氨基酸序列为SQ7，LU为编码G4S的核酸，其核酸序列为SQ15。
5.根据权利要求1所述的鲎素肽-抗体融合蛋白，其特征在于:所述单克隆抗体是完整的抗体，或抗体片段。
6.根据权利要求5所述的鲎素肽-抗体融合蛋白，其特征在于:所述抗体片段为Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、双特异抗体(diabody)、线型抗体、scFv、或scFv_Fc片段中的至少一种，核酸M编码单克隆抗体或抗体片段。
7.根据权利要求6所述的鲎素肽-抗体融合蛋白，其特征在于:所述单克隆抗体具体为能够特异性结合B淋巴瘤细胞表面抗原CD19的单克隆抗体的Fab片段，简写为ant1-⑶19Fab，其氨基酸序列为SQ6，M具体为编码ant1-⑶19Fab的核酸，其核酸序列为SQ14。
8.根据权利要求7所述的鲎素肽-抗体融合蛋白，其特征在于:所述ant1-⑶19Fab进一步的包括轻链和重链，轻链即L链，重链即H链，L链包括轻链可变区VL和轻链恒定区VL，H链包括重链可变区VH和重链恒定区CHl，L链和H链氨基酸序列分别为SQ18和SQ19 ；L链和H链的核酸序列分别为SQ20和SQ21。
9.根据权利要求1一 8所述的鲎素肽-抗体融合蛋白，其特征在于:该融合蛋白是将Tl的基因通过G4S基因与ant1-⑶19Fab L链3’端相连，并且连接上终止密码子TAA，形成新的序列L-T1，其核酸序列为SQ16，将T2的基因通过G4S基因与ant1-⑶19Fab H链3’端相连，并且连接上终止密码子TAA，形成新的序列H-T2，其核酸序列为SQ22。
10.根据权利要求9所述的鲎素肽-抗体融合蛋白，其特征在于:将L-Tl和H-T2序列相连接，由此完成表达式(T-LU)n -M的一种新序列L-T1-H-T2，以此序列表达形成鲎素肽-抗体融合蛋白ant1-⑶19Fab-Tl+T2，其完整氨基酸序列为SQ8，完整核酸基因序列为SQ17。
11.一种鲎素肽-抗体融合蛋白的制备方法，其特征在于:将鲎素肽基因T直接连接或通过编码接头单元的连接肽基因LU连接于编码抗体单元的基因M的重链或轻链的3’端或5’端，形成(T-LU)n-M方式，构建重组表达质粒，通过宿主细胞表达其融合蛋白，制备方法包括步骤如下: (1)利用基因工程方法将鲎素肽基因通过接头基因或直接与抗体基因相连，并连接到表达载体中，得到重组表达质粒，具体步骤为: ①利用重叠延伸PCR技术，以ant1-⑶19FabL链，序列为SQ20，为模板通过两次PCR，将G4S基因、Tl基因和终止密码子TAA基因连接到ant1-⑶19Fab L链的3’端并扩增，扩增出包含L链、G4S、Tl、终止密码子TAA序列的PCR产物L-Tl ； ②利用重叠延伸PCR技术以信号肽-ant1-⑶19FabH链，序列为SQ23，为模板通过两次PCR，将G4S基因、T2基因和终止密码子TAA连接到ant1-⑶19Fab H链的3’端并扩增，扩增出包含H链、G4S, T2基因和终止密码子TAA的PCR产物H-T2 ； ③利用酶切和连接方法，将上述两种PCR产物，即L-Tl和H-T2基因，通过引物赋予的酶切位点，与表达载体PETdiabody的双酶切产物相连接； 所述L-Tl基因3’端与H-T2基因的5’端通过相同的酶切位点Nhe I相连，L-Tl基因5’端与载体PET diabody —端通过相同的酶切位点Mlu I相连，H-T2基因3’端与载体PETdiabody的另一端通过酶切位点Sph I连接在一起，从而构建成了包含有ant1-⑶19Fab-Tl+T2基因的载体，形成(T-L)n- M模式，完成表达载体PET-ant1-CD19Fab-TI +T2 的构建； (2)利用基因工程方法将含有(T-L)n-M的载体转入到宿主细胞中，并进行融合蛋白的诱导表达； (3)纯化获得融合蛋白。
12.根据权利要求11所述的鲎素肽-抗体融合蛋白的制备方法，其特征在于:所述步骤(I)中①步骤中扩增出包含L链、G4S、T1和终止密码子TAA的PCR产物L-Tl所需要的3个引物P5，P9和PlO的序列如下: P5的序列为SQ34:
5’ -ACAAACGCGTACGCTGACATTGTGC-3， 下划线标记的为Mlu I酶切位点， P9的序列为SQ38:
5，-ACCACGGTAGCAAACACGGAAGCACCATTTCGACGGTGGCGGTGGACACTCTCC CCTGTTGAAGC-3， PlO的序列为SQ39:
5， -CTAGCTAGCGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCAGCTTAACGGCAACGACG GTAGCAGATACCACGGTAGCAAACACGGA-3，。 下划线标记的为Nhe I酶切位点。
13.根据权利要求11所述的鲎素肽-抗体融合蛋白的制备方法，其特征在于:所述步骤(I)中②步骤中扩增出包含H链、G4S、T2基因和终止密码子的PCR产物H-T2所需要的3个引物Pll, P12和P13的序列如下: Pll的序列为SQ40:. 5，-GGCGCTAGCACGCAAGTTCACGTAAAAACGG-3’ 下划线标记的为Nhe I酶切位点， P12的序列为SQ41: .. 5，-GGTAGCAAACACGGAAGCACCAACGCGATGGCGGTGGCGGTGTGTGAGTTTTG TCACAAG-3， P13的序列为SQ42:
. 5，-ACATGCATGCCGCGTTAACGGCATTTACGGTAGCAGATACCACGGTAGCAAACAC GGAAGCAC-3， 下划线标记的为Sph I酶切位点。
14.根据权利要求11所述的鲎素肽-抗体融合蛋白的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)的具体方法为:将含有L-T1-H-T2基因的质粒PET-ant1-CD19Fab-Tl+T2转化入宿主细胞大肠杆菌16C9中，通过低温诱导将融合蛋白表达到细菌的周质腔中，收集菌体后通过裂解的方式将融合蛋白释放到上清液中，收集上清液。
15.根据权利要求11所述的鲎素肽-抗体融合蛋白的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)纯化获得的融合蛋白的具体方法为:用纯化所用的上样缓冲液将含有融合蛋白的上清液进行透析后，过亲和层析柱完成纯化，或将透析液超滤浓缩后再过柱纯化，最终获得鲎素肽-抗体的融合蛋白， 即ant1-rai9Fab-Tl+T2融合蛋白。
【文档编号】C07K19/00GK104177502SQ201410414876
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年8月21日 优先权日:2014年8月21日
【发明者】何永胜, 苑庆华, 韩钊, 辛鹤林, 臧丹戎, 李彦彩, 李萌, 任卫新 申请人:天津兰瑞生物技术有限公司