专利名称：：肽、获得及衍生肽的方法和基于衍生肽的药物组合物的制作方法
技术领域：
：本发明可用于化学、医学、兽医学领域，也涉及生物活性肽领域。本研究也涉及药物肽的新的组合物和获得及衍生所述肽的方法。该新开发的化合物具有广泛的生物学活性并可影响生物学过程，如增大活组织的量、刺激上皮腺的生长活性、头发生长、治愈伤口和瘢痕、增加合成代谢活性的速度，也可产生镇痛活性。
背景技术：
：在未成熟和成熟的器官中，激素参与整个新陈代谢过程是公知的。这些功能也可以由具有其激素活性特性的肽来完成，并且肽也完成调节其它激素的功能，该激素又控制活器官的功能。所有这些类型的天然组合物是很有限的。这就是为什么许多世界实验室开发合成分离肽的方法，使得该肽具有较高的活性及其天然形式(EP0136720，1984；EP0137904，1984)。而且，新合成的肽未在活器官中发现但具有独特的特性。其中，具有调节参与生长的肽的特异基团。其中一个肽是能够增加生长激素在血中的含量(PCT89/07111，1989；PCT91/16923，1991)而其它肽参与降低血中生长激素的含量(FR2235701，1978；FR2532308，1982)。目前，合成了增加人体表皮层形成的肽(PCT90/13570，1990)和具有刺激温血动物头发生长能力的金属肽(metalopeptide)。合成了能够使动物脱毛的不同形式(FR2487677，1982)。通过由肽制备不同的组合物有可能调节各种新陈代谢过程变得显而易见。然而，十分需要制备产生特异结果的组合物和化合物。此时，科学家拥有少量的肽来研究它的多种功能活性，如美国专利4680283，1987所述的化合物。该专利合成了具有广泛有用活性的肽。已证明该肽是一种生物刺激因子并在使用期间观察到，它产生类似于吗啡所产生的镇痛作用。着重探索和研究了具有鸦片样作用的这些合成肽。不幸的是，那些产生吗啡作用的组合物实际上是不常见的并且难以生产和合成它们(US4042682，1977)。为此，开发全arsenal合成组合物的刺激剂(US4681871，1987，EP0112036，1983；EP0221019，1986)。近来，已将多种鸦片样肽用于临床治疗脑缺血(DE3447720，1985；US4684624，1987)、缓解孕妇疼痛(EP0099173，1984)和作为镇痛化合物，当与传统治疗联合使用时，是特别有效的(EP096592，1983；EP0099286，1984；US4123523，1987)。同时，通常已知的合成肽组合物对于现代医学的所有需要来说是不能完全满意的，因为它们不具有使它们更有效的所需的特性。使用这些肽的方法要求大的剂量，以便获得所需效果，这样就增加了不需要的副作用的危险。本发明描述所公开的肽用于实验和医学目的。该肽和所有的组合物可被用作鸦片样物质和类似的目的。该肽可被用作具有合成代谢特性的用于增加活组织(影响生长)和皮肤及头发生长量目的的物质。该肽的生物刺激特性适于修复过程和治愈伤口。为了分离该肽，使用现代有效的肽物质合成方法。这些现代方法允许使用最小量的物质和有限数量的步骤来获得大量的最终产物。下面式#1是该肽的分子式。X-Tyr-Y-Phe-Z-A其中X-HorArg，D-Arg，Orn，D-Orn，Lys，D-Lys，Har，D-Har，Cyt，D-Cyt；Y-D-Ala，D-Val，D-Leu，D-Lie，D-Phe，D-Asn，D-Trp，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Tyr，D-Hyp，D-Cys，D-Cys-Cys，D-Met，D-Lys，D-Har，D-Arg，D-His，D-Asp，D-Glu，D-B-Ala，D-Orn；Z-Ala，D-Ala，Val，D-Val，Leu，D-Leu，Lle，D-Lle，Phe，D-Phe，Asn，D-Asn，Gly，Gln，D-Gln，Trp，D-Trp，Pro，D-Pro，Ser，D-Ser，Thr，D-Thr，Tyr，D-Tyr，Hyp，D-Hyp，Cys，D-Cys，Cys-Cys，Cys-D-Cys，D-Cys-Cys，D-Cys-D-Cys，Met，D-Met，Lys，D-Lys，Arg，D-Arg，His，D-His，Asp，D-Asp，Glu，D-Glu，B-Ala，D-B-Ala，Orn，D-Orn；A-OH或取代的酰胺(C1-C3)；其中Arg-精氨酸，Orn-鸟氨酸，Lys-赖氨酸，Har-高精氨酸，Cyt-瓜氨酸，Ala-丙氨酸，Val-缬氨酸，Leu-亮氨酸，Lle-异亮氨酸，Phe-苯丙氨酸，Asn-天冬酰胺，Trp色氨酸-，Pro-脯氨酸，Ser-丝氨酸，Thr-苏氨酸，Try-酪氨酸，Hyp-羟脯氨酸，Cys-胱氨酸，Cys-Cys-胱氨酸-胱氨酸，Met-，甲硫氨酸，His-组氨酸，Asp-天冬氨酸，Glu-戊炔二酸(Glutimicacid)，Gly-甘氨酸，Gln-谷氨酰胺。通过逐渐构成肽链来衍生式(I)肽，首先，由氨基酸Z的C端，即取代的酰胺或保护的羧基开始，用混合酐或活性醚的方法与N-保护的苯丙氨酸结合，接下来的顺序是除掉N-保护基，然后加入活性酯或混合酐，加入N-保护的氨基酸，再除掉N-保护基，再加入N-保护的氨基酸。当完成链的构成后，产生四或五肽并且通过在钯催化剂存在下氢化的方法获得该肽，然后得到最终产品。所述最终产物为略带黄色或灰色的白色粉末，它溶于水，不能很好地溶于乙醇，不溶于氯仿。在表#1中，显示式(I)肽的理化性质，它们是由在丁醇，乙酸和水溶液(其配比为3∶1∶1)中的“RFB”、在氯仿，甲醇，32％乙酸(其配比为60∶45∶20)和(α)D表示。</tables>续表1</tables><tablesid="table5"num="005"><tablewidth="700">H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Glu-OH0.510.74H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-B-ala-OH0.510.74H-Arg-Tyr-D-ala-Phe-D-B-Ala-OH0.160.58H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Orn-OH0.580.73H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-D-Orn-OH0.580.73</table></tables>该新发现的肽可用作制备药物组合物的生物活性组分。这些药物组合物包括有效量的所述肽以及可与生物活性成分组合的载体。该组合物可制成口服和外用以及注射形式。通常，组合物的含量为0.001-0.1％(优选0.001-0.01％)的肽成分。肽的量也取决于它是用于液体形式中还是用于固体形式中。为了获得肽的药物组合物，需要在40-70℃下，将肽与载体混合。在70℃(20℃)下，该混合物可以溶液的形式，在24小时内(3年)保持稳定。为了注射，可使用任何药用溶剂，包括蒸馏水，生理溶液和缓冲溶液。肽与溶剂的比可为0.001％-0.01％。用于制备可注射溶液的方法可以是传统的重量体积法。根据预定量的肽粉末，加入适宜量的溶剂来获得用于注射的所需混合物。然后通过无菌过滤系统，将混合物过滤，并分装到试管或安瓿中。所得到的混合物是不含有任何化学或其它添加剂的透明液体并且是稳定的。用于口服的固体形式肽可制成片剂、粉末或胶囊形式，并且可以是将其它活性组分(如着色剂和矫味剂)加入其中的主剂。根据混合物的目的，肽和添加剂的比可以为0.001％-0.1％。当研究新肽的生物功能时，发现该新肽具有广泛的活性。研究表明，该新肽实际上也是无毒的。为了测定该肽的毒性LD50，使用24只小白鼠，每只体重18g，在试验期间，它们具有相同的生活和饲养条件。在所有研究组中，小鼠中包括50％雄性小鼠和50％雌性小鼠。在试验前24小时和整个试验过程中将饲养的小时放在恒温并通气的环境中。在试验开始前2小时停止给小鼠进食和进水。将小鼠分成4组，每组6只小鼠。最初的3组小鼠腹膜内注射体积为0.2ml，剂量为800，1100，1400mg/kg的肽和水的混合物。第4组对照组小鼠注射相同量的生理溶液。下一步试验为，将小鼠观察7昼夜并计算在该时间内LD50。观察到在试验期间，试验动物在行为和状态方面没有变化并且注射肽也未引起任何疾病症状。在试验期间，没有死亡记录并且所有动物的体重都保持正常。所有器官的重量都在正常的范围内。试验结果表明，注射上述剂量的肽不对动物产生伤害，而且也未观察到毒性。下面是描述衍生下式肽方法的实施例。H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OHA)、制备Boc-Phe-Gly-oBzl向搅拌下的10.7g(40ml)Boc-Phe-OH和4.8ml(40.1mmol)N-甲基吗啉在50ml冷却至-15℃下二甲基甲酰胺的溶液中加入5.6g(40.1mmol)氯甲酸异丁酯(Isobutylinchloro-formate)。2分钟后，将甘氨酸对甲苯磺酸苄基酯在50ml二甲基甲酰胺中的冷溶液加到该冷却的混合物中。将该反应混合物在-15OC下搅拌30分钟，在室温下搅拌2小时。减压蒸馏二甲基甲酰胺。将残渣加到100ml乙酸乙酯中并用50ml2％的硫酸溶液洗涤两次，然后用80ml饱和碳酸氢钠溶液冲洗两次，再用水洗涤至反应物呈中性，然后用硫酸镁干燥。真空蒸馏乙酸乙酯层。将残渣在加入乙醚和己烷的乙酸乙酯中重结晶。产率为16.4g(98.2％)，Mp为135.2℃，Rf＝0.71(洗脱剂为氯仿，乙酸乙酯。甲醇＝3∶6∶1)。Rf＝0.62(洗脱剂为乙酸乙酯，己烷＝1∶1)。B)、制备Boc-D-Ala-Phe-Gly-oBzl将16.4g(39.8mmol)Boc-Phe-Gly-oBzl溶解在80ml50％三氟乙酸的氯仿液中。1小时后，真空蒸发溶剂直至为固体油状物。将150ml乙醚加到该残渣中然后重结晶。将残渣过滤，用乙醚洗涤并干燥。产率为16.2g(99.8％)，MpTFAH-Phe-Gly-oBzl＝135℃，Rf＝0.34(氯仿，甲醇＝9∶1)。将7.5g(39.7mmol)Boc-D-Ala-OH和4.6mg(40.0mmol)N-甲基吗啉在50ml二甲基甲酰胺的混合物冷却至-15℃，同时将溶液混合并加入5.6g(40.3mmol)氯甲酸异丁酯。2分钟后，加入16.2g(40.0mmol)H-Phe-Gly-oBzl三氟乙酸盐和4.6ml(40.0mmol)N-甲基吗啉在50ml二甲基甲酰胺中的冷却混合物。将反应混合物在-30℃下搅拌30分钟并在室温下搅拌2小时。真空除掉二甲基甲酰胺并向残渣中加入100ml乙酸乙酯，然后用2％的硫酸溶液洗涤两次(每次50mg)，用富含混合物的碳酸氢钠洗涤两次，每次80mg，然后用水洗涤至反应物呈中性，用无水硫酸钠干燥。真空蒸发乙酸乙酯层，将残渣在乙醚中重结晶。产率为14.5g(75.9％)，mp为140℃，Rf＝0.79(氯仿，乙酸乙酯，甲醇＝6∶3∶1)，Rf＝0.55(氯仿，甲醇＝9∶1)。C)、制备Boc-Try-(Boc)-D-Ala-Phe-Gly-oBzl将14.4g(29.8mmol)Boc-D-Ala-Phe-Gly-oBzl溶解在80ml50％三氟乙酸的氯仿液。1小时后，将溶剂蒸发直至得到油状物。将残渣溶解在50ml二甲基甲酰胺中并向其中加入3.4mg(29.8mmol)N-甲基吗啉。将11.4g(30.0mmol)Boc-Tyr-(Boc)-OH-和3.45ml(30.0mmol)N-甲基吗啉在50ml二氯甲烷中的混合物冷却至-15℃同时混合并加入4.27g(30.0mmol)氯甲酸异丁酯。2分钟后，向该混合物中加入14.3g(mmol)三肽的苄基酯H-D-Ala-Phe-Gly-oBzl。将该反应混合物在-15℃下混合30分钟，在室温下混合2小时。真空除掉二甲基甲酰胺，将残渣加到100ml乙酸乙酯中并用2％硫酸溶液洗涤两次，每次50ml，然后用富含碳酸氢钠的混合物洗涤两次，每次80mg，将残渣用水洗涤两次。得到中性反应物，然后用硫酸钠干燥。真空除掉乙酸乙酯层。将残渣重结晶。产率为18.5g(83.4％)，mp133.5℃，Rf＝0.62(氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇＝6∶3∶1)，Rf＝0.57(氯仿∶甲醇＝9∶1)。D)、制备Boc-Arg(NO2)-Try-D-Ala-Phe-Gly-oBzl。将9.8g(13.1mmol)Boc-Try-(Boc)-D-Ala-Phe-Gly-oBzl溶解在80ml50％三氟乙酸的氯仿液中。1小时后，将溶剂蒸发直至得到油状物。将残渣在乙醚中重结晶。产率9.68g(100％)。将9.6g(13.0mmol)TFA-Try-D-Ala-Phe-Gly-oBzl溶解在150ml二甲基甲酰胺中并加入1.5ml(13.0mmol)N-甲基吗啉，5.2g(14.6mmol)Boc-Arg(NO2)-OH-1/2TFH，1.97g(14-6mmol)羟苯并三唑。将反应混合物冷却至-10℃同时混合，并加入3.0g(14.0mmol)二环己基碳二亚胺。在室温下，将混合物搅拌72小时。滤掉二环己基脲，真空蒸发溶剂并向残渣中加入100ml乙酸乙酯，将残渣用2％硫酸洗涤两次，每次50ml，然后将混合物用80ml碳酸氢钠混合物洗涤两次，再用水冲洗，得到中性反应物，用无水硫酸钠干燥。真空蒸发乙酸乙酯层。将残渣重结晶。产率为9.6g(87.2％)，mp＝176.7℃，Rf＝0.70(氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸＝6∶3∶1∶0.5)，Rf＝0.23(氯仿∶甲醇，9∶1)。E)、制备H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-oH将9.6g(13.6mmol)Boc-Arg(NO2)-Try-D-Ala-Phe-Gly-oBzl溶解在60ml甲酸，1.0g钯催化剂中并加入氢6小时。将催化剂过滤，将甲酸真空蒸发，用100ml水洗涤。将残渣加到乙醚中。将残渣过滤，用乙醚冲洗并干燥。产率6.9g(100％)，Rf＝0.44(丁醇∶乙酸∶水＝3∶1∶1)。用离子交换柱层析，进一步纯化该肽，该柱装有吸着剂交联葡聚糖G-25梯度0.1M-1.0M的吡啶乙酸(pyidinacetat)缓冲混合物。根据理化研究的结果，该肽H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH具有分子量为612.6的线性结构并且具有略带黄色的白色粉末形态，它溶于水，不能很好地溶于乙醇并且不溶于氯仿。在250-300mm范围的uV光谱显示，在275+/-mm具有吸收，在282+/-2mm具有肩峰，0.1％水混合物的PH＝5.0-0.7。实施例2该实施例描述了制备式H-Arg-Tyr-D-Orn-Phe-D-Ala-OH肽的方法。a)、制备Z-Phe-D-Ala-OH将9.68g(20.0mmol)Z-Phe-OPfp溶解在20ml四氢呋喃中并加入2.3g(25.6mmol)H-D-Ala-OH(溶解在5ml水中，PH＝8.5)。在室温下，将反应混合物搅拌24小时。真空蒸发溶剂，加入70ml乙酸乙酯并加入70ml2％硫酸直至PH＝2-3。用70ml乙酸乙酯提取该肽两次，用饱和氯化钠洗涤直至得到中性反应物，然后用无水硫酸钠干燥并真空蒸发除掉溶剂直至得到油状产物。用乙醚和己烷将最终产物重结晶。产量为7.6g(97.7％)，Rf＝0.40(氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸＝6∶3∶1∶0.1)，Rf＝0.53(乙酸∶氯仿∶甲醇＝0.5∶16∶1)，Rf＝0.58(乙酸∶氯仿∶甲醇＝0.5∶9∶1)，mp＝153-154℃，(α)20+/-3.2(c＝1甲醇)。b)、制备Boc-D-Orn(Z)-Phe-D-Ala-OH将6.5g(18.0mmol)Z-Phe-D-Ala-OH溶解在15ml甲醇和2ml甲酸中，加入0.2g披钯碳并通入氢气3小时。滤掉催化剂并真空蒸发溶剂。将残渣中加入乙醚。过滤残渣，用乙醚洗涤并干燥。产量H-Phe-D-Ala-OH4.3g(98.1％)Rf＝0.01(氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸＝6∶3∶1∶0.1)，Rf＝0.45(乙酸∶氯仿∶甲醇＝1∶3∶2)。将8.0g(15.0mmol)五氟苯基的酯(Boc-D-Orn(Z)-OPfp)溶解在15ml二恶烷中并在混合过程中加入4.3g(17.7mmol)H-Phe-D-Ala-OH(溶解在水中，PH＝8.5)。在室温下，将反应混合物搅拌24小时。真空蒸发掉溶剂并按(a)段相同的方法进行。将所得混合物用乙酸乙酯，乙醚和己烷重结晶。产量6.92g(74.4％)，Rf＝0.44(乙酸∶氯仿∶甲醇＝0.5∶16∶1)，Rf＝0.32(氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇＝6∶3∶1)，mp＝145℃。c)、制备Boc-Tyr-(Bxl)-D-Orn(Z)-Phe-D-Ala-OH将3.3g(5.6mmol)的Boc-D-Orn(Z)-Phe-D-Ala-OH溶解在10ml50％三氟乙酸的氯仿液中。1小时后，真空蒸发掉溶剂并向该残渣中加入乙醚。过滤产物，用乙醚洗涤并干燥。产量3g(100％)。将3.0g(5.4mmol)Boc-Tyr-(Bzl)-OPfp溶解在10ml二甲基甲酰胺中，加入3.0g(5.8mmol)TFA-H-D-Orn(Z)-Phe-D-Ala-OH和0.25ml(5.7mmol)的二乙基异丙基胺。在室温下将反应混合物搅拌24小时。24小时后，真空蒸发除掉溶剂，加入70ml乙酸乙酯和70ml2％硫酸至PH＝2-3。用70ml乙酸乙酯aciolified肽并用饱和氯化钠混合物洗涤直至得到中性反应物，用无水硫酸钠干燥，真空除掉溶剂直至形成油状物。然后用乙酸乙酯和乙醚重结晶残渣。产量4.1g(82％)，Rf＝0.47(乙酸∶氯仿∶甲醇＝0.5∶16∶1)，Rf＝0.35(乙酸∶氯仿∶甲醇＝0.5∶16∶1)。d)、制备Z3-Arg-Tyr-(Bzl)-D-Orn(Z)-Phe-D-Ala-OH将0.9g(1.1mmol)Boc-Tyr-(Bzl)-D-Orn(Z)-Phe-D-Ala-OH溶解在5ml50％三氟乙酸的氯仿液中。1小时后，真空蒸发掉溶剂并向该残渣中加入乙醚。过滤产物，用乙醚洗涤并干燥。产量0.8g(100％)。将0.65g(1.1mmol)Z3-Arg-OPfp溶解在5ml二恶烷和1.5ml二甲基甲酰胺中，加入0.8g(1.0mmol)TFA-H-Tyr(Bzl)-D-Orn(Z)-Phe-D-Ala-OH和0.12ml(1.0mmol)的二乙基异丙基胺。在室温下将反应混合物搅拌24小时。真空蒸发除掉溶剂，加入乙酸乙酯并将得到的残渣过滤。用乙酸乙酯重结晶残渣。产量1.88g(92.0％)，Rf＝0.51(乙酸∶氯仿∶甲醇＝0.5∶16∶1)，Rf＝0.34(氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸＝653∶1∶0.1)；Rf＝0.53(乙酸∶氯仿∶甲醇＝0.5∶9∶1)，mp＝138-143℃。e)、制备H-Arg-Tyr-D-Orn-Phe-D-Ala-OH将0.5g(0.39mmol)Z3-Arg-Tyr-(Bzl)-D-Orn(Z)-Phe-D-Ala-OH溶解在3ml乙酸和2ml甲酸中，加入0.62g的披钯碳并通入氢气3小时。然后滤掉催化剂，真空蒸发溶剂。将所得化合物溶于水中，用反相液相色谱法在1.6×25cm用吸着剂“silasorbC-8”(10mkm)填充的柱上纯化，用乙腈-0.01M三乙胺醋酸铵(pH＝6.0)洗脱。产率0.20克(80.8％)。实施例3本实施例描述了用下式制备肽的方法H-Arg-Tyr-D-Arg-Phe-D-Ala-OH。将0.9克(0.14毫摩尔)H-Arg-Tyr-D-Arg-Phe-D-Ala-OH胍溶于5毫升1N氢氧化钠溶剂中。室温下将反应混合物搅拌7昼夜，用反相液相色谱在1.6×25cm用吸着剂“silasorbC-8”(10mkm)填充的柱上进行分离，用乙腈-0.05％三氟乙酸梯度洗脱。产率0.087克(76.9％)。实施例4本实施例描述了用下式制备肽的方法H-Tyr-D-Orn-Phe-D-Glu-OH。a)BOC-Phe-D-Glu(oBzl)2的制备将14.7克(10.0毫摩尔)H-D-Glu-OH溶于54毫升苄醇中，加入17.2克(10.0毫摩尔)对甲苯磺酸。然后，在Dino-Stark装置中加热至70-80℃12小时。在这12小时中，以相同速率加入苯以替代除去的水。然后用甲醇结晶该混合物，用异丙醇重结晶。产率Tos-H-D-Glu(oBzl)2；25.96克(80.0％)。熔点116℃。将2.2克(5.1毫摩尔)BOC-Phe-OPfp溶于5毫升二恶烷中，搅拌下加入1.9克(5.2毫摩尔)Tos-H-D-Glu(oBzl)2和0.5毫升(5.2毫摩尔)三乙胺的5毫升二氯甲烷溶液及5毫升二恶烷。室温下搅拌反应混合物24小时。24小时后，真空蒸发掉溶剂，将油溶于100毫升乙酸乙酯中，用100毫升2％硫酸溶液漂洗两次，再用100毫升5％碳酸氢钠溶液漂洗两次，然后于水中洗涤混合物直至中性，用无水硫酸钠干燥。真空下蒸发掉乙酸乙酯，用己烷结晶残余物。产率3.2克(98.5％)；Rf＝0.81(氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇＝6∶3∶1)；Rf＝0.78(乙酸∶氯仿∶甲醇＝0.5∶16∶1)；熔点162℃。b)BOC-D-Orn(Z)-Phe-D-Glu(OBzl)2的制备将2.1克(3.7毫摩尔)BOC-Phe-D-Glu(oBzl)2溶于20毫升50％三氟乙酸的氯仿溶液中。1小时后，真空蒸发掉溶剂。将残余油状物溶于10毫升四氢呋喃中，加入0.4毫升二乙基异丙胺和2.0克(3.8毫摩尔)BOC-D-Orn(Z)-OPfP。室温搅拌反应混合物24小时。24小时后，真空蒸发掉溶剂，将油溶于100毫升乙酸乙酯中，用100毫升2％硫酸溶液漂洗两次，再用100毫升5％碳酸氢钠溶液漂洗两次，然后于水中洗涤混合物直至中性，用无水硫酸钠干燥。真空下蒸发掉乙酸乙酯，用乙酸乙酯和己烷重结晶残余物。产率3.0克(88.2％)；Rf＝0.88(氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇＝6∶3∶1)；Rf＝0.85(乙酸∶氯仿∶甲醇＝0.5∶9∶1)；熔点156℃。c)BOC-Tyr(Bzl)-D-Orn(Z)-Phe-D-Glu(OBzl)2的制备将0.91克(1.1毫摩尔)BOC-D-Orn(Z)-Phe-D-Glu(OBzl)2溶于10毫升50％三氟乙酸的氯仿溶液中。1小时后，真空蒸发掉溶剂。将残余油溶于15毫升二恶烷，加入0.10毫升(1.0毫摩尔)二乙基异丙胺和0.54克(1.0毫摩尔)BOC-Tyr(Bzl)-OPfp。然后室温搅拌反应混合物24小时。24小时后，真空蒸发掉溶剂，将油溶于100毫升乙酸乙酯中，用100毫升2％硫酸溶液漂洗两次，再用100毫升5％碳酸氢钠溶液漂洗两次，然后于水中洗涤混合物直至中性，用无水硫酸钠干燥。真空下蒸发掉乙酸乙酯，用乙酸乙酯和乙醚结晶残余物。产率1.1克(93.2％)；Rf＝0.89(氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇＝6∶3∶1)；Rf＝0.83(乙酸∶氯仿∶甲醇＝0.5∶16∶1)；熔点158-160℃。e)H-Tyr-Orn-Phe-D-Glu-OH的制备将0.16克(0.15毫摩尔)BOC-Tyr(Bzl)-D-Orn(Z)-Phe-D-Glu(OBzl)2溶于2毫升甲醇中，加入2毫升甲酸和0.2克钯碳并通入氢气4小时。滤除催化剂，真空蒸发掉溶剂。然后将油溶于5毫升70％含水三氟乙酸中。1小时后，真空蒸发掉溶剂。将残余物溶于最少量的乙醇中，用水稀释并用高效反相液相色谱在1.6×25cm用吸着剂“silasorbC-8”(10mkm)填充的柱上进行纯化，用乙腈-0.05％三氟乙酸梯度洗脱。产率0.07克(98.8％)。经研究，专业人员可在本发明的基础上进行其它修饰和完善。实施例5在本实施例中，描述了评价肽阿片样活性的不同试验。在传统的分离器官中进行体外阿片样活性研究-GPI试验(GuangT.A.KosterlitzH.WAgonistandantagonistactionofmorphinelikedrugsontheguineapigsisolatedileum//Br.J.Pharmac.Chmother-1966-V.27N3.P.514-527)。MVD试验(HughsJ.KosterlitzH.WLwslieF.MEffectofmorphineonadrenergictransmissioninthemousewasdifferent.AssessmentofagonistandAntagonistpotenciesofnarcotic.//Br.J.Pharmacol-1975-V.53N3.P.371-381)。以及在体外热板试验中确定阿片样活性的试验(AukierS.I.newhotplateteststoqualifyantinjiceptiveandnarcoticantagonistactivities//Eur.J.Pharmacol-174-V.27Nip.1-4)。还有大鼠上的“Tailflick”(D′amourF.E.SmithD.LamethodfordetermininglossExp.Ther.-1974-V.27Ni-p.74-79)。用“尾部闪烁”方法在大鼠上进行试验，测试肽链的镇痛活性，以0.005mg/kg的剂量静脉内注射给大鼠。242单位的真正镇痛效应是肽H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH的特征。表2列出了肽链的阿片样活性的研究结果。表2<p>从表中可看出，引起任何生物效应的最小肽剂量为1-10mkg/kg。在小鼠、大鼠、貂、鸟、鱼、小牛和猪中进行该肽以及其衍生物的生物活性实验。实施例6本实施例描述了肽对年幼大鼠和小鼠体重增加的影响。a)本实验是在4组1周大的大鼠中进行的。将0.1毫升生理盐水溶液注射给对照组1。将肽以每公斤体重0.1、0.5和1.0mkg剂量静脉内注射给对照组2、3和4。每5天将4个组的大鼠称重，同时监测其食物的摄取。实验进行35天。准确度＜0.05的结果如表3所示。表3</tables>在第4组观察到最大的体重增加，该组接受了1.0mkg/kg肽的剂量。下表4列出了大鼠的总食物摄取。表4</tables>仔细观察各组食物的消耗量并无差异，这表明该肽是同化性活性。b)本实验是在7组一个月大的NMRI系小鼠中进行的。不限制这些小鼠的食物和水。将0.1毫升生理盐水注射给第1组，第2、3和4组分别给予1.0、10.0和100.0mkg/kg的肽和水。第5、6和7组分别每日给予0.1、0.5和1.0mkg/kg的肽水溶液共30天。在这30天的实验中，每周将小鼠称重，同时监测每日的食物摄取量。体重增加结果如下表5所示。</tables>*-口服给药**-静脉内给药肽最有效的给药方法是每日以1mkg/kg的剂量以水溶液形式给药。以下是每24小时测得的每组平均食物消耗量。</tables></tables>结果表明，在接受最多食物并以1.0mkg/kg的剂量每日口服肽水溶液的动物组中观察到了最多的体重增加。注意到，摄取肽后，测试动物体重增加并且食物摄取量也增加。摄取1克食物而观察到的体重增加是该肽商业性应用的指标。结果如表7所示。</tables>观察到摄取1克食物时以10.0mkg/kg剂量给予肽水溶液得到了最大的体重增加，测试组的体重净增加百分数比对照组体重增加百分数高36.5％。实施例7本实验描述了肽类对皮肤形态学改变和头发生长的影响。本实验是在4组NMRI系小鼠中进行的。第1组是阳性对照，其它组接受下列剂量的肽第2组1.0，第3组10.0，第4组100.0mkg/kg。活检后，从动物的嵴部取下5×5mm的皮肤样品，按照“lili”方法测试48小时。用乙醇处理皮肤并染色24小时。然后用棉胶处理。用“Rehard”公司生产的手术刀制备组织标本，将这些标本按照轴序排列，切缘用常规的曙红法染色。在研究10mkm厚度的组织标本时，研究表皮和真皮的性质。按照“Aftondilov”法对测试组和对照组动物计数每毫米的发囊数。观察到给予100.0、10.0和1.0mkg/kg肽的小鼠发囊与对照组相比分别增长了14％、19％和22％。各动物组的皮肤标本表明，给予100.0mkg/kg肽的第4测试组的表皮角化区表皮层增厚。给予10.0mgk/kg肽的第3组动物与第4组的变化类似。也观察到了表皮的增厚。同样观察到了第2测试组动物的上皮生长区的活性以及皮下脂肪组织的良好状态。标记测试组嵴部的毛发都增长。将每组动物的10根毛发以1微米的精度测量，计算每个测试组的平均值。结果如表8所示。表8很明显，给予10和100mkg/kg剂量的肽对小鼠毛发的生长有刺激效应。这些实验中的肽没有表现出任何毒性征兆。该肽表明可刺激上皮的生长活性，刺激增加表皮层，刺激发囊密度和数量的增长以及增加活组织的容积。实施例8在本实施例中，描述了肽对鱼尾鳍的再生影响。实验是在小鲤鱼和鲑鱼中进行的。将鱼在浓度为1.0mg/l的肽溶液中饲养2个月。实验过程中过程尾鳍的再生(通过修剪尾鳍将测试组和对照组标记区分)。测量对照组尾鳍时，观察到再生部分的长度为183+/-23，测试组为268+/-26，其至少为对照组测量值的1.5倍。测试组鲤鱼的再生速度也比对照组鲤鱼高1.5倍。很明显，该肽具有生长刺激作用，可以用于愈合。在子实体鱼血和肽血清中处理兔红细胞凝集素效价一周后，发现效价增加1.95倍。根据试验结果所得的结论为，肽影响下的鱼更能抵抗原生动物及细菌的感染并且可更好地处理外部物质。实施例9本实施例描述了肽对貂和北极狐体重增加的影响。本实验使用两个月大的北极狐和貂。每种动物有三组测试组和一组对照组。将肽以10mkg/kg的剂量以食物供给方式给予第一个测试组。10天后，将肽以10mkg/kg的剂量给予第二个测试组10天。将肽以20mkg/kg的剂量按照与第一个测试组相同的方式给予第三个测试组。一个月后，将动物称重。结果表明与对照组相比，测试组的雄性与雌性之间有差异。本实验结果如表9所示。该结果是学生计算平均值偏差的一个平均数。</tables>结果表明两类动物的第三测试组的雌性体重增加了6％，其接受的是20mkg/kg剂量的肽。雄貂体重增加了26％，雄北极狐体重增加了21％。实施例10本实验描述了肽对貂和北极狐皮毛质量改善的影响。本实验的条件和方法与实施例9相同。当将动物放倒后，测量皮毛区并评定皮毛的质量。与对照组相比，所有测试组的皮毛区都增长，同时总质量保持在高水平。貂测试组的增加率为第二组平均为105％，第3组平均为108％，第4组平均为108％。北极狐组的结果为第2组112％，第3组107％，第4组106％。实施例11本实施例描述了肽对小猪体重增加的影响。在本实验中，使用7组断奶小猪。小猪为4至5个月大。一组小猪用作对照组，另外六组为测试组。将肽分别以1.0mkg/kg、5.0mkg/kg、10.0mkg/kg的剂量以食物供给形式给予第二、第三和第四测试组。每个月给药20天，另10天停药。将肽以0.01％水溶液的形式注射给予另外三组，每月给药5天，25天停药。第5、6和7组分别给予0.1、0.5和1.0mkg/kg。实验持续100天。实验结果如表10所示。表10*-口服**-注射给药本实验结果表明，当给予动物高剂量时得到最好的结果。以10.0mkg/kg的剂量口服肽的第三组与对照组相比体重增加高于30％。以1.0mkg/kg的剂量注射给予肽的第六组与对照组相比体重增加高于18％。本实验表明，使用肽不会引起任何副作用或偏离测试动物血液生化指标正常值。该肽确实具有增加测试动物肌肉的作用。实施例12本实验描述了肽对公鸡体重增加的影响。本实验是在产肉公鸡“P-46”中进行的。公鸡年龄为24小时。将测试公鸡分为5组，每组13只。第1组作为对照组，其它4组为测试组。将肽混在食物中分别以8、12、16和20mkg/kg的量给予测试组2、3、4和5组。饲养公鸡直至达10周龄，这种肉鸡推荐混合饲料。所有测试组和对照组的公鸡在本实验中都存活。肉眼观察表明测试组都主动消耗食物，并且与对照组相比外观没有差别。表11表明了本实验的细节。表11测试组3-5平均增加的体重比对照组高13-23％，同时食物量以相同的百分数减少。测试组2-5的食物消耗量与对照组相比分别低2.4％、17.1％、14.9％和14.4％。测试组公鸡的肉质量无论在颜色、气味、一致性和味道上与对照组公鸡肉都没有差别。实施例13本实施例描述了肽对小公牛体重增加的影响。本实验使用2月大的7组小公牛，每个测试组12只。第一组为对照组，其它六组为测试组。将肽以水溶液的形式并分别以1.0、5.0和10.0mkg/kg的速率空腹口服给予第一、第二和第三测试组。将肽以0.01水溶液形式并分别以0.1、0.5和1.0mkg/kg的剂量注射给第四、第五和第六组。在临床和生理学观察中，所有的测试组都没有表现出任何从正常值偏离的迹象。表12所示的结果证实了当口服及静脉内给药时，该肽对大鼠的生长以及牛体重的增加都有正性影响。表12*-口服**-静脉内注射当给予最高剂量时得到最大的正性结果。当将肽以水溶液形式并以10mkg/kg的剂量口服给药时，24小时内体重增加平均值为583克，其比60天测量的对照组高172克。当以水溶液形式注射(剂量为1mkg/kg)给药时，结果更高。24小时平均增加体重627克，比对照组高217克。实施例14本实施例描述了肽对鱼体重增加的影响。a)将10条鲤鱼置于已含有肽溶液2小时的鱼池中(浓度0.25mg/l)。将鲤鱼分别标记，在放进循环鱼池前称重。鲤鱼每日接受3％肽剂量的干食物。20天后，取出鲤鱼并称重。结果如表13所示。表13</tables>用肽处理鲤鱼体重平均增加23.0％，个体偏差为18.9至31.0％。b)本实验用重量为0.5克的小鲑鱼进行。将鱼放在肽浓度为1.0mk/l的溶液中2个月。结果表明对照组鱼的平均重量为2.83克，测试组为3.86克。因此，测试组与对照组相比以36.4％的速率生长。实施例15基于生物活性成分(按照实施例1所得)的药物组合物是用0.001至0.1％的肽制备的，该含量的最优选值为0.001至0.01％。将碳水化合物和其它载体用于组合物中，这种组合物用于动物的食物补给和水中。通过混合肽粉和水或饲料制备食物补给。加到混合物中的食物量取决于所需的一致性或者实验的条件。a)在用鱼做的实验中，将鱼放在浓度为1.0mg/l的肽水溶液中。b)基于生物活性成分的药物组合物按照实施例1获得，其是用含量为0.001％的肽混合到牛饮用水中而制备的。c)基于生物活性成分的药物组合物按照实施例1获得，其是用含量为0.001％的肽混合到小猪饮用水中而制备的。混合剂是水。工业适用性肽及含有其药物组合物(如实施例5-14所述)可以广泛用于医学和农业。权利要求1.通式I的肽X-Tyr-Y-Phe-Z-A其中X表示H或Arg，D-Arg，Orn，Lys，D-Lys，Har，D-Har，Cys，D-Cyt；Y表示D-Ala，D-Val，D-Leu，D-Ile，D-Phe，D-Asn，D-Trp，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Tyr，D-Hyp，D-Cys，D-Cys-Cys，D-Met，D-Lys，D-Har，D-Arg，D-His，D-Asp，D-Glu，D-β-Ala，D-Orn；Z表示Ala，D-Ala，Val，D-Val，Leu，D-Leu，Ile，D-Ile，Phe，D-Phe，Asn，D-Asn，Gly，Gln，D-Gln，Trp，D-Trp，Pro，D-Pro，Ser，D-Ser，Thr，D-Thr，Tyr，D-Tyr，Hyp，D-Hyp，Cys，D-Cys，Cys-Cys，Cys-D-Cys，D-Cys-Cys，D-Cys-D-Cys，Met，D-Met，Lys，D-Lys，Arg，D-Arg，His，D-His，Asp，D-Asp，Glu，D-Glu，B-Ala，D-B-Ala，Orn，D-Orn；并且A表示OH或取代的酰胺(C1-C3)。2.药物组合物包括活性成分和稀释剂或填充剂，该混合物中的活性成分是权利要求1中通式I肽。3.权利要求2中液体形式的药物组合物。4.权利要求2中固体形式的药物组合物。5.权利要求3中注射形式的药物组合物。6.口服使用药物组合物或者如权利要求4肠道外给药。7.药物组合物中肽的优选含量是0.001％至0.01％。8.药物组合物由0.001％至0.1％的权利要求4肽组成。9.通式I肽如下获得以氨基酸Z的C-端残基开始逐渐构成肽链，所述氨基酸Z是一种取代酰胺或被保护的羧基，通过混合酸酐或活化醚的方法将氨基酸Z与N-取代的苯丙氨酸结合；然后除去N-保护基，加入活化醚或活化酸酐，接着加入N-保护的氨基酸以除去N-保护基；构成链后，释放出四肽或戊肽，在钯催化剂存在下利用氢化方法回收肽即得终产物。10.权利要求9的方法是在酸酐溶液中进行的，其中起始化合物是氨基酸的苄醚和三丁氧羰基苯丙氨酸，在此化合物中加入三丁氧羰基苯丙氨酸之前除去酸溶液中的三丁氧羰基，然后在钯催化剂存在下通入氢气，用离子交换色谱法纯化终产物。11.权利要求10的方法，其中肽是在吸附剂芯SephadexG-25上用离子交换色谱法纯化的，用0.1M-1.0M的吡啶乙酸盐缓冲液梯度洗脱。全文摘要本发明提供式(I)肽X-Tyr-Y-Phe-Z-A，其中X表示H或Arg，D-Arg，Orn，D-Orn，Har，D-Har，Cyt，D-Cyt；Y表示D-Ala，D-Val，D-Leu，D-Ile，D-Phe，D-Asn，D-Trp，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Tyr，D-Hyp，D-Cys，D-Cys-Cys，D-Met，D-Lys，D-Har，D-Arg，D-His，D-Asp，D-Glu，D-β-Ala，D-Orn；Z表示Ala，D-Ala，Val，D-Val，Leu，D-Leu，Ile，D-Ile，Phe，D-Phe，Asn，D-Asn，Gly，Gln，D-Gln，Trp，D-Trp，Pro，D-Pro，Ser，D-Ser，Thr，D-Thr，Tyr，D-Tyr，Hyp，D-Hyp，Cys，D-Cys，Cys-Cys，Cys-D-Cys，D-Cys-Cys，D-Cys-D-Cys，Met，D-Met，Lys，D-Lys，Arg，D-Arg，His，D-His，Asp，D-Asp，Glu，D-Glu，β-Ala，D-β-Ala，Orn，D-Orn；并且A表示OH或取代的酰胺(C1-C3)。按照本发明，通过逐渐构成肽链来获得式(I)肽，由氨基酸Z的C端，即取代的酰胺或保护的羧基开始，通过使用活性醚或混合酐的方法，逐渐加入N-保护的氨基酸；将N-保护基分离并再次逐渐加入N保护的氨基酸，产生在钯催化剂存在下未阻断的四或五肽，并分离靶向肽。所述的肽和基于它的化合物可用作起鸦片样特性的试剂，而且也具有增加体重的特性以及促进生长和皮层(包括头发)发展的活性。所要求的肽的生物刺激特性也被证明能治愈伤口和瘢痕。文档编号C07K7/06GK1159758SQ95194382公开日1997年9月17日申请日期1995年6月27日优先权日1994年6月29日发明者V·I·捷依盖,E·P·娅劳娃申请人:V·I·捷依盖,E·P·娅劳娃