专利名称：生理活性物质ei-2128-1的制作方法
技术领域：
本发明涉及由属于青霉属的微生物生产的新的白细胞介素-1β生产抑制物质。所述化合物有抗菌活性和白细胞介素-1生产抑制活性，并可用于治疗类风湿性关节炎、痛风、骨关节病、骨质疏松症、结节性动脉周炎、溃疡性结肠炎、慢性肾炎、活动性慢性肝炎、败血症、内毒素性休克、动脉粥样硬化、感染性疾病的发热、弥漫性硬皮病等。
白细胞介素-1(下文称为IL-1)是一种分子量为17.5kDa的蛋白质，它是由体内的各种细胞如巨嗜细胞、单核细胞、中性粒细胞、成纤维细胞、皮肤角质化细胞、肝星形细胞、肾小球膜细胞、脑星形神经胶质和血管内皮细胞生产的。IL-1包括等电点(pI)为5的α形式和等电点为7的β形式。目前，已知α形式和β形式有相同的活性。
已知IL-1有各种生物学活性。即，IL-1作为增强淋巴细胞多分化的因子和增加B细胞增殖和抗体生产的辅助因子。此外，认为IL-1作用于丘脑下部温度中心的花生四烯酸的级联反应以增加前列腺素E2的合成，由此引起发热。另外，表明患败血症或节段性回肠炎的患者血清和患关节性风湿病患者的腔静脉关节突点中，IL-1的活性显著增加。这表明IL-1参与了这些疾病的发病和发展。因此认为抑制IL-1的生产可有效地缓解因IL-1而引起的症状。
具有IL-1生产抑制活性的已知化合物的实例是合成的化合物如萘衍生物(日本公开未审查专利申请59743/92)，3-芳基异噻唑衍生物(日本公开未审查专利申请74121/92)，和zingerol衍生物(日本公开未审查专利申请202127/92)。
已经有对aranorosin[抗生素杂志，41，1780-1784(1988)日本公开未审查专利申请157386/91]和aranorosinol A和aranorosinol B[抗生素杂志，45，1592-1598(1992)]的报道。但是这些化合物的结构与式(I)所代表的化合物的结构不同，而且没有有关任何这些化合物抑制IL-1生产的报道。
本发明涉及具有IL-1生产抑制活性的由式(I)代表的化合物
下文将式(I)代表的化合物称为EI-2128-1。
下面列出EI-2128-1的物理化学特性。
所述数据是由下列仪器得到的。
熔点Yanagimoto，微量熔点仪质谱JEOL LTD.，JMS HX/HX110A质谱仪UV吸收光谱Shimadzu Corporation，UV-2200紫外线分光光度计IR谱JEOL LTD.，JIR-RFX3001红外分光光度计NMR谱JEOL LTD.，α400核磁共振旋光率Nippon Bunko Kogyo Co.，Ltd.，DIP-370数字旋光计EI-2128-1的物理化学特性该物质的颜色和形态白色粉末熔点70-71℃旋光率[α]D27＝13.9°(c＝0.17，CHCl3)元素分析实测C，63.16；H，8.44；N，3.29％按C23H35NO6·H2O计算的C，62.85；H，8.48；N，3.19％质谱HRFAB-MS实测422.2538[M+H]+
按C23H35NO6·H2O计算的422.2542分子式C23H35NO6UV吸收谱λmax(CH3OH)；220nm(sh)IR吸收谱νmax(KBr)；3390，1668，1539，984，930cm-1NMR谱δppm(峰裂数，偶合常数，积分高度)1H-NMR(CDCl3，400MHz)6.74(dd，8.3，15.4Hz，1H)，6.09(d，8.1Hz，1H)，5.77(d，15.4Hz，1H)，5.64(d，4.6Hz，1H)，4.75(m，2H)，3.69(dd，3.7，3.9Hz，1H)，3.57(dd，3.7，3.9Hz，1H)，3.46(dd，2.7，3.9Hz，lH)，3.42(dd，2.7，3.9Hz，1H)，2.63(dd，8.8，13.1Hz，1H)，2.40(m，1H)，2.05(dd，10.5，13.1Hz，1H)，1.39(m，1H)，1.37(m，1H)，1.30(m，2H)，1.25(m，7H)，1.12(m，1H)，1.08(m，1H)，1.03(d，6.8Hz，3H)，0.88(t，6.8Hz，3H)，0.84(d，6.6Hz，3H)13C-NMR(CDCl3，100MHz)198.3(s)，166.2(s)，151.9(d)，121.1(d)，96.6(d)，79.1(s)，64.3(d)，62.9(d)，55.9(d)，55.6(d)，52.0(d)，43.9(t)，37.4(t)，36.0(t)，34.2(d)，31.9(t)，30.4(d)，29.7(t)，26.8(t)，22.7(t)，20.5(q)，19.5(q)，14.1(q)溶解度易溶于甲醇，乙腈和氯仿颜色反应碘试验和硫酸试验呈阳性薄层色谱Rf值；0.71
显色剂；氯仿-甲醇(85∶15)薄层；HPTLC Fertigplatten Kieselgel 60 F254(Merck &
Co.，Inc.)展开；室温，上行法，20-40分钟检测；用碘发色下面用试验实施例描述EI-2128-1的活性。试验实施例1对IL-1生产的抑制活性用下列方法检测本发明化合物EI-2128-1对由人单核细胞衍生的THP-1细胞(ATCC No.TIB 202)生产的IL-1β的抑制活性。用ELISA法确定IL-1β的量。
将THP-1细胞以1×105个细胞/毫升的浓度悬浮在含10％灭活的胎牛血清的RPMI1640培养基(Nissui Pharmaceutical Co.，Ltd)中。将细胞悬浮液以1毫升/孔的量加入到24孔平板的孔中。将佛波醇12-肉豆蔻酯13-乙酸酯(PMA，终浓度30nM)加到孔中，然后于37℃，在5％CO2保温箱中保温65小时，以使细胞分化成巨嗜细胞。
然后，用无血清RPMI1640培养基缓慢洗涤平板以除去未粘附到孔上的细胞，将残余物在含脂多糖(LPS，终浓度25ug/毫升)和试验化合物(终浓度0.05-50g/毫升)的无血清RPMI1640培养基中培养4小时。
培养完成后，用IL-1β检测试剂盒(Amersham Corp.)确定释放到培养上清液中的IL-1β量。
按照下列公式计算IL-1生产抑制率以得到IC50(50％的抑制浓度)。
IL-1生产抑制率(％)＝(A-B)/(A-C)×100A只加LPS时生产的IL-1量B加入LPS和试验化合物时生产的IL-1量C不加入LPS时生产的IL-1量EI-2128-1对LPS刺激产生的THP-1细胞生产的IL-1的50％抑制浓度为0.1uM。
试验实施例2对不同细菌的抗菌活性用含3克/升Bacto-胰胨(Difco Laboratories Inc.)，3克/升肉提取物，1克/升酵母提取物，1克/升葡萄糖和16克/升琼脂的培养基(pH7.0)，通过琼脂稀释法，确定EI-2128-1对不同细菌生长的最小抑菌浓度(MIC)。结果列于表1。
表1
下面描述生产EI-2128-1的方法通过在培养基中培养属于青霉属并具有EI-2128-1生产能力的微生物，使EI-2128-1在培养基中积累，然后从培养基中回收EI-2128-1，就可得到EI-2128-1。
作为本发明EI-2128-1的生产菌株，可以使用属于青霉属并有EI-2128-1生产能力的任何菌株。另外，在本发明中还可使用用各种人工诱变方法如UV照射、X射线照射和用诱变剂处理或通过自发突变而得到的所述菌株的突变体，只要它们有生产EI-2128-1的能力。适宜菌株的典型实例是青霉属E-2128菌株。
下面描述青霉属E-2128菌株的真菌学特性。1 肉眼观察当25℃在麦芽糖提取物琼脂培养基上培养该菌株时，在培养的第7天，菌落直径为40-46mm，在第14天为约60mm。在第14天，菌落的颜色为暗蓝绿色，略带浅灰，在边缘为白色到淡蓝色；背面为淡黄白色，在边缘和中心为乳白色。
当25℃在马铃薯-葡萄糖琼脂培养基上培养该菌株时，在培养的第7天，菌落直径为约45mm，在第14天为约70-75mm。在第14天，菌落的颜色为灰橄榄色，背面为暗红棕色。
该菌株的生长温度范围为6-38.5℃，最佳生长温度为约22℃。使其生长的pH范围为3-12，最佳生长pH为7左右。2 在麦芽糖琼脂培养基上培养时，光学显微镜下观察该菌株菌丝分生，光滑，无色到淡黄棕色，分支良好。分生孢子是monoematous，光滑，无色到淡黄棕色；它们为1.8-3.5μm宽，有时可长达约160μm。青霉菌的形状和大小无规则，但它们中的许多是二轮生不对称青霉群。在青霉菌的顶部形成3到4个梗基。梗基是楔形或长方形，长6.5-13.5μm，宽为1.5-3.5μm。在梗基的顶部形成3到6个瓶梗，瓶梗是球顶长颈瓶形或瓶状，长为5.5-9.5μm，最宽的部分为2-3μm，在顶部宽约1.2μm。分生孢子的个体发生方式是成肠细胞样的，分生孢子以链状排列从瓶梗的顶部开始形成。phialoconidium是单细胞型，光滑的，球形或亚球形，直径为2.5-4.3μm；无色到浅棕色，但量很多时呈橄榄色。在该菌株中，只观察到前述渐变(anamorph)，而未观察到远距离刺激变形(telemorph)。
按照The Genera of Fungi Sporulating in Pure Culture第2版，Cramer，Vaduz J.A.von Arx(1974))以上述真菌学特性为基础进行分类学研究，结果将该菌株分在青霉属。本发明人将该菌株命名为青霉属E-2128菌株，并已于1996年3月27日将其保藏在国立生命科学和人体技术研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，日本)，保藏号为FERM BP-5488。
为了培养在本发明中所用的EI-2128-1生产菌株，通常可使用用于培养丝状真菌的常规方法。就培养基而言，可使用合成培养基或天然培养基，只要它含有可以为所述菌株所吸收的碳源、氮源、无机物等。
碳源的实例包括碳水化合物，如葡萄糖、果糖、stabilose、淀粉、糊精、甘露糖、麦芽糖和糖浆；无机酸如柠檬酸、苹果酸、乙酸和延胡索酸；醇如甲醇和乙醇；烃如甲烷、乙烷、丙烷和正链烷烃；氨基酸如谷氨酸和甘油。
氮源的实例包括铵盐如氯化铵、硫酸铵、硝酸铵和磷酸铵，氨基酸如天冬氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸和丙氨酸，脲，胨，肉提取物，酵母提取物，干酵母，玉米浆，大豆粉，棉籽饼，大豆酪蛋白，酪氨酸和Pharmamedia。
无机物的实例包括磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、硫酸铜、硫酸钴、硫酸锌、泛酸钙、钼酸铵、硫酸钾铝、碳酸钨、碳酸钙、氯化钴和氯化钠。
如果需要，还可将促进细胞生长或EI-2128-1生产的物质加到培养基中。如果所用的菌株需要特殊物质，则也可将所述物质加到培养基中。
在20-40℃，中性pH左右，通过振荡培养、通气搅拌培养等完成培养。通常，培养3到7天，在培养物中积累的EI-2128-1量达到最大，之后结束培养。
就从培养物中分离EI-2128-1而言，可以用从培养物中分离微生物代谢产物所常用的方法。
即，用溶剂如丙酮或甲醇提取微生物细胞，通过过滤或离心除去微生物细胞，用吸附树脂、硅胶、硅烷化过的硅胶、反相硅胶、铝、纤维素、硅藻土、硅酸镁、凝胶过滤介质、离子交换树脂等，通过柱色谱使活性物质解吸附，用适宜的溶剂分离等步骤就可分离出EI-2128-1。
在上述分离和纯化步骤中，通过硅凝胶薄层色谱，然后用碘颜色显色或在253.6nm的紫外线照射可示踪EI-2128-1。
本发明的实施例如下。完成本发明的最佳方式实施例1用青霉属E-2128菌株作为接种菌株，将一环的菌株接种到10毫升第一培养基(pH6.5)中，该培养基含有分别在3个50毫升试验试管(培养基总量30毫升)中的100克/升葡萄糖，30克/升磨碎的马铃薯(SnowBrand Milk Products Co.，Ltd.)和5克/升粉末状酵母提取物S(NipponSeiyaku Co.Ltd.)。25℃振荡4天完成培养。
将所得的第一培养物(30毫升)以5毫升的量接种到4个300毫升Erlenmeyer烧瓶中，每个烧瓶均含有50毫升的第二培养基(培养基总量200毫升)。第二培养基的组成与第一培养基的相同。25℃振荡2天完成培养。
将所得的第二培养物(200毫升)以5毫升的量接种到4个300毫升Erlenmeyer烧瓶中，每个烧瓶均含有50毫升的主发酵培养基(培养基总量2升)。主发酵培养基的组成如下10克/升葡萄糖，10克/升可溶性淀粉(MS#3600，Japan Maize Products Co.，Ltd.)，10克/升玉米淀粉(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)，5克/升玉米浆，5克/升Pharmamedia，5克/升Ebios，和2克/升碳酸钙(pH6.0)。25℃振荡6天完成培养。
过滤所得的培养物(2升)以得到微生物细胞。向所述细胞中边搅拌边加入2升甲醇，然后过滤。用8升水稀释所得的细胞提取物(2升)，然后通过Diaion HP-20柱(400毫升，Mitsubishi Chemical Corporation)。用1.6升50％甲醇洗涤该柱后，用1.6升甲醇完成洗脱。合并含EI-2128-1的馏分，用等量水稀释。使所述馏分稀释物通过ODS柱(直径3cm；长度50cm，ODS-AQ-S50，YMC)，然后用75％甲醇洗脱。合并含EI-2128-1的馏分，减压浓缩至干，然后溶解在20毫升甲醇中。使2毫升的所得溶液通过HPLC柱(D-ODS-5-B S-5 120A，YMC)。用80％甲醇，以20毫升/分钟的流速洗脱，然后合并含EI-2128-1的馏分。用HPLC重复该纯化步骤，然后合并含EI-2128-1的馏分，减压浓缩至干，得到107毫克EI-2128-1。
在上述步骤中，通过硅凝胶薄层色谱，然后用碘显色或在253.6nm的紫外线照射可示踪EI-2128-1。
本发明提供了具有IL-1生产抑制活性的生理活性物质EI-2128-1。
权利要求
1 由式(I)代表的生理活性物质EI-2128-全文摘要
本发明涉及一种由式(Ⅰ)表示的新化合物EI－2128－1,该化合物具有IL－1生产抑制活性。
文档编号C07D493/20GK1188511SQ97190302
公开日1998年7月22日 申请日期1997年4月2日 优先权日1997年4月2日
发明者田中健穗, 小泉文人, 我妻勉, 近藤英正, 斋藤裕, 安藤胜彦, 松田让 申请人:协和发酵工业株式会社