专利名称：五环三萜烯的制作方法
技术领域：
本发明的领域本发明涉及含五环三萜烯的植物保护组合物及其使用方法。
背景植物的外层例如叶子的角质层，果皮，以及茎皮保护植物免受擦伤，防止水分损失，也抵卸病原微生物。穿透植物的角质层是病原体能够进入植物内部组织的前提。
植物对发病的早期阶段自然地保卫自已的机理还没有完全了解。真菌繁殖体附着于寄主植物的最初过程基本是致病的成功确立。空中的真菌病原体牢牢地粘于非常疏水的表面这一事实暗示疏水力与附着过程有关。
空中的真菌病原体的附着包括外细胞粘液或粘着剂的分泌的活动过程，它可以在与寄主接触后几分钟之内开始。在粘着分泌液中已报告的其它组分包括酶，其中有酯酶和角质酶。邻近于分生胞子和在分生胞子下面的角质层蜡的擦伤可在液体释放的20分钟内观察到。附着胞的胚芽管的生长仅出现在液膜沉积的区域。
一些研究已经提出，感染区的准备包括由叶面病原菌主动溶解寄主的角质层。也认为这种溶解是这些酶的目的。Nicholson，R.L.，和L.“真菌孢子和在植物与动物中的病害发生”(The Fungal Sporeand Disease lnitiation in Plants and Animals)，Eds.Cole，G.T.，和Hoch，H.C.，1991 Plenum Press，New Youk，3-23。因此，在病害发展的相继阶段出现之前，角质层必须被进攻的病原体所渗透。除了酶的降解外，一些真菌孢子用感染结构所产生的机械力帮助它们自己。(Kller，W.“真菌孢子和在植物与动物中的病害发生”(The Fungal Spore and Disease Initiation in Plants andAnimals)，Eds.Cole，G.T.，和Hoch，H.C.，1991 Plenum Press，New York，219-246)。
五环三萜烯(PT)是在最普通的植物次代谢物中，但是它们在植物中的功能还没有被了解。它们通常被富集于最外层，例如植物的角质层，果皮和茎皮。在一些情况下，这些表层含有非常高浓度的五环三萜烯。例如，每个苹果的果皮含有大约0.1g熊果酸，百桦的外茎皮含有高达40％(重量/重量)的桦木脑。在芬兰，每年从木材加工工业的白桦茎皮废液可得到的桦木脑的量估计约15万吨。目前，废茎皮是用作能源生产的低价值的燃料。Jskelinen，P.(1981)Pap.Puu 63，599-603。
文献提供了许多能被PT抑制的酶的实例，表明PT以非特定方式广泛作用于多种靶标的能力。参见例如，(a)Büchler et al.(1991)Biochem.Biophys.Acta 1075，206-212，甾族化合物和三萜系化合物对大鼠肾的11-羟甾脱氢酶的抑制；结构/功能关系；(b)Kochet al.(1994)Phytother.Res.8，109-111，一组甾族和三萜系化合物在活体外对腺苷脱氨酶的抑制；(c)Najid et al.(1992)FEBS299，213-217，熊果酸的特征，采用巨噬细胞，血小板和辨别的HL60白血细胞作为脂肪氧合酶的环加氧酶抑制剂；(d)Pengsuparp et al.(1994)J.Nat.Prod.57，415-418，从Maprounea africana得到的五环三萜烯是HIV-1逆转录酶的强抑制剂；(e)Simon et al.(1992)Biochem.Biophys.Acta 1125，68-72，从石南属植物的花(Calluna Vulgaris)分离的熊果酸对脂肪氧合酶活性和HL60白血细胞增殖的抑制；(f)Ying et al.(1991)Biochem.J.277，521-526，熊果酸对人的白细胞弹性蛋白酶的抑制。关于五环三萜烯结合点的证据，这些文献各自披露的内容合并于此作为参考。
在植物组织培养中，由非活化的真菌或真菌酶诱发的应力已被用于增加生物活性的次代谢物的产量。在几种情况下已经报道这个真菌的引出导至过多生产五环三萜烯，代替了其它一些预期的代谢物。在Yander Heijden et al.，(1988)Plant Cell Rep.7，51-54中给出了适当的实例，通常产生吲哚生物碱的Tabernaemontana spp.的组织培养受到了由真菌，细菌或酶，纤维素酶或果胶酶诱发的应力。有应力时，该培养产生了高达3位于正常量的熊果烷型(ursanetype)五环三萜烯(2％的干物质)，但是不增加存在的吲哚生物碱的产量。
用Candida albicans引出物处理的Taberna emiontanadivaricata的其它试验导致产生一系列的熊果烷型和齐墩果烷(oleane)型的五环三萜烯，并伴随抑制生长和吲哚生物碱的积累(van der Heijden et al.，(1989)Phytochemistry 28，2981，2988)。
通常为强细胞毒性的二萜的来源的Triterygium wilfordii的组织培养，在真菌葡萄孢属引出物的应力下戏剧性地增加了齐墩果烷型五环三萜烯的产量，而不是二萜，这促使人们得出结论，只有三萜烯是可诱导的抗微生物的植物抗毒素。Kutney，et al.，(1993)来自通过真菌引出的Tripterygium wilfordii细胞悬浮培养的抗炎齐墩果烷三萜烯。Plant Cell Rep.12，356-359。
已经受到真菌和细菌进攻的阔叶和窄叶植物的常规处理是在突然蔓延出现后进行的。然后用一种或多种市售的合成的接触性抗微生物喷雾液，以不产生药害的施用量处理受危害的植物。有效处理量必须与伤害化学品处理植物的风险相平衡，而这些化学品在结构上与植物生理学方面和因素无关。希望有这样的植物保护剂，它能有效地抵御微生物病原体，又能以类似于植物自然防御机理的方式工作，以减少药害的风险。与处理疏水性叶面相关的问题之一是材料的有效应用。当前的喷雾技术导致一部分喷雾材料直接落到地上，或施药后被很快出现的两水冲洗掉。这两种情况都增加了对环境的污染。
通过喷雾施用的保护剂应在植物表面上保留一段足以发挥它们的功能的时间。因此，对紫外光和可见光的稳定性是叶面处理所关注的。为此应该开发能抵抗因暴露于紫外光以及可见光引起的降解的叶面施用杀菌剂。
而且已经知道，侵袭的有机体会通过抗性品系的突变和繁殖来躲避处理剂的作用。这种发展的抗性在经济上是有害的，因为它逼迫去发现新的处理剂。提供突变的病原体不能躲避的植物抗感染剂是有帮助的。
本发明的概要本发明的一个目的是提供一种以与天然植物防御机理一致的成分，保护植物表面抵卸微生物病原体的组合物及其使用方法。
本发明的另一个目的是提供一种对环境、人类，或益虫产生低风险的组合物和使用方法。
本发明的又一个目的是提供突变的病原体所产生的抗性不能躲避的植物抗感染剂。
本发明还有一个目的是提供一种对紫外光暴露，长期贮存的降解具有良好的抵抗性和对植物表面具有良好的固有粘着能力的组合物。
本发明的这些和其它目的，根据在此的说明将是显而易见的本发明的组合物包括一种五环三萜烯或五环三萜烯的混合物，它包括一些特别富含五环三萜烯的植物萃取物，具有由式I，II或III的任一种所描述的主要组分化合物。
本发明的方法包括将有效量的，含五环三萜烯或式I，II或III任一种所示的五环三萜烯混合物的组合物施用于植物表面。
式I，II和III是 其中R1＝Me，CH2OH，CH2OY1，CH2O-X-OH，CH2O-X-OY1，CH2O-X-Y2，CH2O-X-Y3，CH2NHY1，CH2NY12，CH2Y3，CH2NH-X-OH，CH2NH-X-Y2，CH2NH-X-Y3，CH2NH-X-OY1，CH2OC(O)-OY1，CH2O-X-OY1，CO2Y1，COY3，COY2，CHO，CH＝N(CH2)m(O(CH2)m)nR4，or CH＝N(CH2)m(O(CH2)m)nY2；R2，R3＝H，OH，OY1，O-X-OH，O-X-OY1，O-X-Y2，Y3，NHY1，NY12，Y3，NH-X-OH，NH-X-Y2，NH-X-Y3，NH-X-OY1，NY1-X-OH，NY1-X-Y2，NY1-X-Y3，or NY1-X-OY1；条件是R2和R3之一是H或R2和R3一起表示羰基氧；R4＝H，OH，OY1，或Y3；Y1＝H，直链或支链的1-30个碳原子的烷基，3-30个碳原子的环烷基，3-30个碳原子的链烯基，4-30个碳原子的氧烷基，7-30个碳原子的苯基烷基，或7-30个碳原子的苯氧基烷基；Y2＝NH2，NHY1，或NY12；Y3＝-(O(CH2)m)nR4或-(O(CH2)m)nY2，此处m＝2-4和n＝1-230；X＝ -OC(CH2)pCO-，此处p＝1-22。
本发明提供了一种能在被处理的植物表面特别有效地防止空气传播的真菌和细菌病害的爆发的组合物及其使用方法。组合物和五环三萜烯被施用并在植物表面形成薄膜。这层材料膜防止空中真菌病原体的预先侵袭和植物角质层的渗透。另外，这些化合物无药害，是与植物的延期防卫相一致的。
详细说明本发明涉及含有式I，II或III的五环三萜烯的组合物及其使用方法 其中R1＝Me，CH2OH，CH2OY1，CH2O-X-OH，CH2O-X-OY1，CH2O-X-Y2，CH2O-X-Y3，CH2NHY1，CH2NY12，CH2Y3，CH2NH-X-OH，CH2NH-X-Y2，CH2NH-X-Y3，CH2NH-X-OY1，CH2OC(O)-OY1，CH2O-X-OY1，CO2Y1，COY3，COY2，CHO，CH＝N(CH2)m(O(CH2)m)nR4，or CH＝N(CH2)m(O(CH2)m)nY2；R2，R3＝H，OH，OY1，O-X-OH，O-X-OY1，O-X-Y2，Y3，NHY1，NY12，Y3，NH-X-OH，NH-X-Y2，NH-X-Y3，NH-X-OY1，NY1-X-OH，NY1-X-Y2，NY1-X-Y3，or NY1-X-OY1；条件是R2和R3之一是H或R2和R3一起表示羰基氧；R4＝H，OH，OY1，或Y3；Y1＝H，1-30个碳原子的直链或支链的烷基，3-30个碳原子的环烷基，3-30个碳原子的链烯基，4-30个碳原子的氧烷基，7-30个碳原子的苯基烷基，或7-30个碳原子的苯氧基烷基；Y2＝NH2，NHY1，或NY12；Y3＝-(O(CH2)m)nR4或-(O(CH2)m)nY2，此处m＝2-4和n＝1-230；X＝ -OC(CH2)pCO-，此处p＝1-22。
优选的五环三萜烯包括桦木脑，桦木酸，熊果酸，石竹素，桦木脑单-和双-二酸酯或戊二酸酯，及其聚乙二醇衍生物。
对人类白细胞弹性蛋白酶的IC50值的浓度小于大约15微摩尔(μM)，更优选IC50值小于大约1O，和最优选IC50值小于大约8微摩尔的五环三萜烯是特别有用的。IC50值代表抑制剂的浓度，它可用每升微摩尔数来表示，此时酶的活性降低50％。因此，较低的IC50值意味着较高水平的酶抑制活性。
本发明的五环三萜烯是与衍生的，合成的，或在植物外表面叶，果，茎皮中天然发现的那些相同的，都可抑制包括角质层的酶降解的致病。本发明，为了提高喷雾层的物理特性，将五环三萜烯或其衍生物与适当的载体例如水，含水的成膜溶液，洗涤剂，乳液形成添加剂，适当的聚合物一起施用于暴露的植物外表面。
五环三萜烯可以通过采用适合于三萜烯的一种或多种有机溶剂，萃取含五环三萜烯的植物组织而得到。优选的PT的植物组织源包括白桦树的茎皮，苹果皮，和属于鸟饭树属与肉豆蔻属植物的叶子。可用的萃取溶剂包括乙酸乙酯，丙酮，甲乙酮，乙醇，丙醇，异丙醇，甲醇，二氯甲烷，氯仿，或它们的混合物。
为了作为在被处理植物表面的均匀包衣的应用，应该把本发明的五环三萜烯或它们的聚乙二醇衍生物从非结晶态变成充分混合的胶体悬浮液。除了通过液体剂型的常规喷雾装置不能到达的下表面或隐蔽区域外，均匀的包衣有助于保证很好地保护植物表面抵抗病原体。
本发明的五环三萜烯是疏水性的结晶固体。这些固体可被溶解在许多适合农业使用的溶剂中。如果需要，为了装运和贮存可以制备五环三萜烯的溶液或胶状的浓液剂。然后由加工者或施用者在使用时进一步稀释这种浓液剂。
用于五环三萜烯固体的优选溶剂含有大约1-25％(重量计)的丙酮，大约0-10％(重量计)的二甲基亚砜(DMSO)，0-35％的脂肪酸的聚乙二醇酯，和大约0-25％(重量计)的表面活性剂，例如市售洗涤剂如Tween 80TM或PalmoliveTM洗碟洗涤剂。一般，这种溶剂混合物可以配成PT是1500-4000％(重量计)的浓度，这是施用于植物所需要的。
浓液剂可用农业上可接受的载体，优选是水进一步稀释成100-4000％，优选300-1000％(重量计)的浓度，以制得根据本发明的可喷雾组合物。特别有用的浓度是在每加仑水大约7-30克的范围内。充分的混合仅要求低至中等的剪切，以保证在稀释过程中浓液剂的充分混合。例如，计量浓液剂进入附属于文丘里混合器的贮液器，混合器提供充分的剪切以使浓液剂与另加的水完全混合。
根据本发明的五环三萜烯或它们的聚乙二醇衍生物按足以防止病原体感染的量被施用。PT的抑制特性被植物用于使真菌孢子分泌的酶失去活性以便降解植物角质层。有效保护的适宜施用量包括在大约0.1-1000kg/h范围内的用量。优选施用量在大约0.1-100kg/h范围内。对于在特殊地区特别类型的植物，最好的特定施用量是容易通过本领域普通技巧的应用来确定的。可是，应该设计施药落在并覆盖于被处理植物暴露的叶面上，正如采用常规叶面喷雾装置作常规叶面处理时所出现的情况。
如果需要，PT或它们的聚乙二醇衍生物可与一种或多种惰性成分或活性成分一起施用。举例的材料包括染料，影响浓液剂稳定性的添加剂和影响喷雾层物理特性的添加剂，叶面肥，杀菌剂和杀虫剂。
实际上可以用根据本发明的组合物有益地处理任一种可通过蜡角质层被侵染的植物。有益的商品化植物包括谷物(例如里麦，小麦和大麦)，番茄，豆，胡椒，小麦和花生。
特别是谷物可从本发明得到好处。这些植物一般不产生足够水平的五环三萜烯，用以阻止入侵微生物的酶的进攻。这些植物的天然病原体一般不适应于产生足够量的酶去克服外部施用的五环三萜烯化合物的抑制作用。
对小虫(如蚜虫)的侵扰敏感的植物也可从本发明的处理得到好处。熊果酸对螨及其幸存者显示有毒性和进食制止作用。螨的繁殖指数按在食物中熊果酸含量的比例降低，另外，对含熊果酸的食物的消化时间减少了大约30％(Varanda et al.，1992)。这些观察资料暗示一种可能性，昆虫的消化酶遭到熊果酸的损害。
PT抑制酶的模式不是特定的，主要是基于与酶的疏水领域的疏水相互作用。这个特性表明通过突变发展微生物病原体抗性的可能性是很小的。因为只要植物生存，病原体就必须涉及在植物角质层中存在的PT，可以假设对PT的微生物的抗性已被优化。用于植物保护的PT的基本剂型应该有利于抵抗用酶去突破角质层的病原微生物，例如真菌，细菌，线虫和病毒。这些剂型也应有利于抵抗小虫，对它们的消化酶进行抑制。通过用含五环三萜烯的薄膜覆盖叶面，可以提高角质层的动防御特性，它可减少或完全防止病原体的成功渗透。
以下实例有助于理解本发明，但无意去限制附属的权利要求的范围。
实施例商品化的化合物可从Extrasyntheses(法国)，Aldrich，Sigma或ICN Pharmaceuticals购得。采用Reichert Thermovar熔点仪测得熔点并经校正。采用Bruker WM-250或270核磁共振谱仪，在C5D5N中，用TMS作内标(0.0ppm)得到Hnmr谱。采用带Super-INCOS软件和直接嵌入试探电极的Finnigan 4023 EI/CI GCMS质谱仪得到质谱。
实施例1a和1b 28-半丁二酰基桦木脑和3，28-双-半丁二酰基桦木脑的合成实施例1a通过将咪唑(4当量)和丁二酸酐(1.08当量)溶解于N-甲基吡咯烷酮中制得反应混合物。溶剂的体积是桦木脑重量的大约4.5倍。在两种反应试剂溶解时，加入桦木脑(1当量)。反应混合物置于室温中并偶尔摇动。大约48小时后，约92-95％的桦木脑已被转变成28-半丁二酰基桦木脑，并带有2-4％未转化的桦木脑和二酰基桦木脑。
28-半丁二酰基桦木脑通过将反应混合物倒入缓慢搅拌下的20倍体积的水中来纯化。从固体残留物轻轻倾倒出水，并用几份新水重复洗涤。分出固体，干燥并溶解于氯仿和异丙醇的混合物中。蒸发除去氯仿，使28-半丁二酰基桦木脑产生和结晶。28-半丁二酰基桦木脑是白色的，熔点242-244℃。
对C34H54O5计算值，C，75.22％，H，10.03；实验值C，75.0，H，9.91.The1Hnmr(DMSO-d6)给出峰在4.86和4.72(1H，s，each，CH2＝C)，4.57和4.14(AB型，J＝12Hz，OCH2O)，3.44(1H，t，J＝8.6Hz)，2.95(4H，s，CHOCH2CH2CO)，1.71，1.22，1.02，0.98，0.98，0.84(s，each，Me)；eims(m/z，rel.int.)524(20，[M-H2O]+)，424(15)，411(27)，207(38)，203(41)，189(100)，135(70)，119(61)，107(62)，95(81)，81(79)，55(90％)；cims543(11，M+)，525(64，[MH-H2O]+)，425(80)，407(100)，217(91)，203(90)，191(48)，和189(52％).
实施例1b将桦木脑443mg(1mmol)，咪唑227mg(4mmoles)，丁二酸酐400mg(4mmoles)和0.6ml甲基吡咯烷酮加到小玻璃瓶中。反应混合物在70℃保持20小时。然后将反应混合物滴加到100ml水中，并搅拌半小时。滤出所得沉淀，为了除去剩下的反应剂，在另一份水中再悬浮和搅拌。该程序重复几次，直到没有反应剂洗出为止。收集固体，干燥，溶于丙酮中。过滤丙酮溶液，蒸发得到470mg 3，28-双半丁二酰基桦木脑。
对C38H58O8·H2O计算值，MW 642.84；C，70.5％，H，9.1％；实验值C70.43％，H 9.15％.1H NMR4.70和4.61(1H，s，each，＝CH2)，4.52(1H，dd，J1＝5.4Hz，J2＝10.0Hz)，4.33和3.90(1H，d，AB型，J＝11.1Hz，OCH2)，2.63-2.71(8H，m，丁二酰基链)，1.70，1.05，0.99，0.87，0.86，和0.85(Me，s，each).MALDI-TOF-MS给出m/z 665(M＋Na+)和也m/z 542和525.
实施例2乙酰基桦木酸的合成将桦木酸100mg(0.22mmoles)加到在5ml CH2Cl2中含有4mg 4-二甲基氨基吡啶(DMAP)和0.5ml(CH3CO)2O的溶液中。2小时后，在真空中除去CH2Cl2，留下的残留物与25ml水一起搅拌。搅拌过程中加入足够的K2CO3分解过量的乙酸酐，此后，用25ml CH2Cl2萃取反应混合物。萃取液蒸发至干，所得固体在CH3OH中结晶，得到104mg乙酰基桦木酸，为白色结晶，熔点285℃。
对C32H50O4计算值，C，77.06，H，10.10；实验值C，77.02，H，10.08％.The1Hnmr(DMSO-d6)给出峰在4.93和4.76(1H，s，each，CH2＝C)，4.67(1H，dd，C3-H，J＝5.0，10.0 Hz)，2.05(s，CH3CO)，1.78，1.06，1.00，0.87，0.84和0.73(each，s，CH3)；eims(m/z，相对强度)499(1，MH+)，452(2)，438(38)，395(26)，189(40)，43(100％)；cims(m/z，相对强度)499(37，MH+)，440(27)，439(100)，437(18)，393 (20)，203(15)，191(24％).
实施例3 3-甲磺酰基桦木酸的合成将桦木酸100mg(0.22mM)溶解在5ml吡啶中，并用100mg(0.88mmoles)CH3SO2Cl处理。16小时后，在真空中除去吡啶，所得的残留物悬浮在10ml水中。用NaHCO3水溶液分解过量的CH3SO2Cl，用10mlCH2Cl2萃取反应混合物。蒸发溶剂得到含3-甲磺酰基桦木酸的粗产品，再通过3g硅胶柱色谱提纯，用含0-5％CH3OH梯度的CH2Cl2洗提。色谱提纯的3-甲磺酰基桦木酸从CH3OH中结晶得到62mg白色结晶，熔点210-2l2℃。
对C31H50O5S计算值C，69.62，H，9.42，S，6.00；实验值C，69.78，H，9.46，S，5.90％.1Hnmr(DMSO-d6)4.95和4.78(1H，each，s，CH2＝C)，4.50(1H，dd，J4.6，11.8Hz)，3.30(3H，s，CH3SO2)，1.79，1.07，1.06，1.00，0.82，0.72(each，s，CH3)；eims(m/z，相对强度)438(9)，423(11)，395(72)，259(12)，161(26)，135(62)，121(100)，107(60)，93(61)，79(54％)；cims(m/z，相对强度)535(11，MH+)，439(91)，423(25)，395(52)，249(12)，203(28)，191(34)，97(100％).
实施例43-甲磺酰基桦木酸甲酯的合成将桦木酸甲酯500mg(1.06mmoles)和320mg(3.3mmoles)(CH3)3N溶解在10ml CH2Cl2中。在冰浴中冷却该溶液并用190mg(1.7mmoles)CH3SO2Cl处理。然后令反应混合物升至室温并放置过夜。真空中蒸发溶剂，留下残留物，再将它溶解在10ml(C2H5)2O中，并用5ml水洗3次。醚层用MgSO4干燥，过滤，蒸发得到582mg3-甲磺酰基桦木酸甲酯。从C2H5OH中重结晶得到结晶，熔点190℃。
对C32H52O5S计算值C，70.03，H，9.55，S，5.84；实验值C，69.85，H，9.50，S，5.65％.1Hnmr(DMSO-d6)4.89和4.73(1H，each，CH2＝C)，4.47(1H，dd，C3-H，J＝2.5，12.5Hz)，3.70(s，OCH3)，3.29(s，CH3SO2)，1.72，1.04，0.99，0.92，0.81，0.72(s，each，CH3)；eims(m/z，相对强度)452(9)，409(14)，341(8)，273(15)，255(12)，189(100)，175(47)，121 (72)，107(72)，93 (76)，79(85％)；cims(m/z，相对强度)549(16％，MH+)，453(100)，393(19)，203(13)，189(12)，97(80％).
实施例5 24-弹性蛋白酶抑制采用人类白细胞弹性蛋白酶(HLE)进行的研究表明，带有羽扇豆烷、齐墩果烷和熊果烷骨架的许多普通天然存在的PT在低微摩尔浓度下能抑制HLE。为了探索结构与活性的关系，采用合成方法制备了几个这些PT的衍生物，在试验时，它们也抑制HLE。对于所试验的化合物，从HLE抑制得到的抑制常数值IC50列于表1。
混合原料溶液产生pH为7.5的在0.1M Tris，0.5M NaCl和3％DMSO(体积/体积)中含有0.5mM Meo-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA(Sigma)和0.7μmg/ml人类白细胞弹性蛋白酶(ElastinProducts)的反应混合物。试验化合物溶于DMSO中。混合等体积的酶和抑制剂，并令其在室温培养15分钟。通过加入第3份等体积的基质使反应开始。反应在微升盘中进行。在405nm，在Dynatechmicroelisa Reader M600中监测对硝基苯胺的出现。比较在存在和不存在试验化合物情况下的最初速度以测定在表1中所报告的IC50值。
表1实施例号 化合物名称 IC50(μM)5 羽扇醇8.46 羽扇醇乙酸酯 14.97 桦木脑5.08 28-丁二酰基桦木脑 6.39 桦木酸3.310桦木酸甲酯5.711乙酰基桦木酸 7.0123-酮基桦木酸 11.013甲基磺酰基桦木酸 11.2143-甲基磺酰基桦木酸甲酯7.315β-香树素 5.416山楂醇4.517熊果酸7.718熊果酸，甲酯 4.919α-香树素 21.120齐墩果酸 18.721齐墩果酸，甲酯8.522合欢酸21.123常春(藤苷)酸基16.824葳严仙根碱酸基(Caulophyllogenin) 0％@ 21°用熊果酸和齐墩果酸进行的进一步试验表明，这些化合物也可以抑制其它酶，例如血纤维蛋白溶酶和尿激酶。在血纤维蛋白溶酶试验中，在22μM测定的抑制值，对熊果酸是43％，对齐墩果酸是25％，而在尿激酶试验中，对熊果酸是83％，对齐墩果酸是40％。对于桦木酸，在以下试验中所测定的IC50值是凝血酶2.3，胰蛋白酶8.5，血纤维蛋白溶酶6.2和尿激酶5.0μM。在所试验的酶中明显缺乏专一性和在0.1％清蛋白存在下抑制停止的观察结果表明抑制是非特定的结合于蛋白造成的。因此，PT看来是非共价地结合于酶的疏水领域，要么阻塞通往酶作用点的通路，或是引起构型的改变，两者都导致酶无力去完成它的功能。
所研究的一组PT的大多数强抑制剂都含有1-3个氧化的取代基，例如羟基或羧基。这些部分为化合物的总的抑制作用出了力。
实施例25杀菌活性番茄，蚕豆，胡椒，小麦和花生在温室中生长1～3周(取决于品种)。每个品种取2盆，代表2个重复，放在一块平地上，以使每块平地上都有一种化合物喷雾的所有植物品种。用所需要的喷雾溶液或标准杀菌剂喷雾每块平地上的植物至流掉药液。作对照，用水喷雾对照的植物。让这些植物空气干燥2-3小时。植物干了以后，按植物品种把它们分类、成组。
表2列出了实施例25-28的组合物保护疏水植物表面的能力。
表2实施例 材料25对照媒介物含有丙酮18ml，二甲基亚砜4ml，和PalmoliveTM洗涤剂200mg.以3％水溶液试验2640mg桦木脑溶解在1.5ml媒介物中，并加入98.5ml水2780mg桦木脑，3.0ml媒介物和97ml水2840mg熊果酸，2.0ml媒介物和98ml水植物病原真菌致病疫霉(Pi)，早期枯萎病菌(As)，灰霉病菌(Bc)和落花生尾孢(Ca)生长在实验室里适当的介质上。从每种真菌收取接种物，将浓度调整到预先确定的水平。专性的植物病原真菌(小麦白粉菌，小麦隐匿柄锈菌)在温室中从它们的寄主收取，将浓度调整到预先确定的水平。
用真菌接种物喷雾以前用试验化合物处理过的植物，然后放入湿气室中一段时间，发现这是发展每种病害的最适条件。培养后，将植物移到温室，允许症状发展，并评价植物的病害强度。表3报告了作为两个重复的平均值的病害防治百分数。
表3病害(％防治率)实施例 Pi Pv As Bc Sn Pr Eg25 8 药害 5 12 0 0 026 0 0 173 0 0 027 40 037 0 0 028 65 药害 8 33 0 0 029 33 0 12 12 0 0 0Pi致病疫霉；番茄晚疫病Pv葡萄生单轴霉；葡萄霜霉病As早期枯萎病菌；番茄早疫病Bc灰霉病菌；葡萄灰霉病Sn颖枯壳针孢(小麦颖枯病)Pr隐匿柄锈菌；小麦叶锈病Eh禾白粉菌；小麦白粉病在检查由实施例25-29所完成的防治之后，改变了五环三萜烯和载体媒介物的浓度。表4列出实施例30-35的组合物，表5显示在实施例30-35中，保护施用各材料后植物病害的防治百分率。表5中的结果是3次重复的平均值。
表4实施例材料30含0.35％Tween 80TM水溶液的载体媒介物31在100ml载体中200mg桦木脑32在100ml载体中400mg桦木脑33在100ml载体中800mg桦木脑34在100ml载体中400mg桦木脑表5病害(％防治率)实施例 PiPvAs Bc SnPrEgSm-p Sm-t307 043 940 0 0 50 3031 10 0471000 0 0 60 203273753 820 0 0 65 3033 60 063 970 0 0 50 30340 0 0 600 0 0 40 60Pi致病疫霉；番茄晚疫病Pv葡萄生单轴霉；葡萄霜霉病As早期枯萎病菌；番茄早疫病Bc灰霉病菌；葡萄灰霉病Sn颖枯壳针孢(小麦颖枯病)Pr隐匿柄锈菌；小麦叶锈病Eh禾白粉菌；小麦白粉病Sm-p小核盘菌；菌核病(花生上)Sm-t小核盘菌；菌核病(番茄上)正如从表5中所见，所施用的桦木脑量增加，一般会提高对敏感真菌的防治率。
权利要求
1.用于抑制酶在植物表面侵袭的组合物，它含有一种农业上可接受的载体和一种有式I，II或III任一种结构的五环三萜烯化合物。 其中R1＝Me，CH2OH，CH2OY1，CH2O-X-OH，CH2O-X-OY1，CH2O-X-Y2，CH2O-X-Y3，CH2NHY1，CH2NY12，CH2Y3，CH2NH-X-OH，CH2NH-X-Y2，CH2NH-X-Y3，CH2NH-X-OY1，CH2OC(O)-OY1，CH2O-X-OY1，CO2Y1，COY3，COY2，CHO，CH＝N(CH2)m(O(CH2)m)nR4，orCH＝N(CH2)m(O(CH2)m)nY2；R2，R3＝H，OH，OY1，O-X-OH，O-X-OY1，O-X-Y2，Y3，NHY1，NY12，Y3，NH-X-OH，NH-X-Y2，NH-X-Y3，NH-X-OY1，NY1-X-OH，NY1-X-Y2，NY1-X-Y3，或NY1-X-OY1；条件是R2和R3之一是H，或R2和R3一起表示羰基氧；R4＝H，OH，OY1，或Y3；Y1＝H，1-30个碳原子的烷基，3-30个碳原子的直链的或支链的环烷基，3-30个碳原子的链烯基，4-30个碳原子的氧烷基，7-30个碳原子的苯基烷基，或7-30个碳原子的苯氧基烷基；Y2＝NH2，NHY1，或NY12；Y3＝-(O(CH2)m)nR4或-(O(CH2)m)nY2，此处m＝2-4和n＝1-230；X＝ -OC(CH2)pCO-，此处p＝1-22。
2.权利要求1的组合物，其中所说的五环三萜烯有式I的结构。
3.权利要求1的组合物，其中所说的五环三萜烯有式II的结构。
4.权利要求1的组合物，其中所说的五环三萜烯有式III的结构。
5.权利要求1的组合物，其中所说的五环三萜烯选自羽扇醇，桦木脑，28-半丁二酰基桦木脑，桦木酸，香树素，山楂醇，熊果酸及其甲酯。
6.权利要求1的组合物，其中所说的五环三萜稀化合物选自羽扇醇，桦木脑，28-丁二酰桦木脑，和28-丁二酰基桦木脑的甲酯。
7.权利要求1的组合物，其中所说的五环三萜稀是桦木脑。
8.权利要求1的组合物，其中所说的五环三萜稀是熊果酸。
9.权利要求1的组合物，其中所说的五环三萜稀选自桦木酸聚丙二醇酯；熊果酸聚丙二醇酯；石竹素聚丙二醇酯；28-半丁二酰基桦木脑聚丙二醇酯；3，28-双半丁二酰基桦木脑二聚丙二醇酯；28-聚丙二醇-桦木脑醚；和3，28-双(聚丙二醇)-桦木脑二醚。
10.保护植物抵抗真菌侵袭的方法，其过程包括将载体和有效量的含有一种式I，II或III结构的五环三萜烯的组合物施用于暴露的植物表面 其中R1＝Me，CH2OH，CH2OY1，CH2O-X-OH，CH2O-X-OY1，CH2O-X-Y2，CH2O-X-Y3，CH2NHY1，CH2NY12，CH2Y3，CH2NH-X-OH，CH2NH-X-Y2，CH2NH-X-Y3，CH2NH-X-OY1，CH2OC(O)-OY1，CH2O-X-OY1，CO2Y1，COY3，COY2，CHO，CH＝N(CH2)m(O(CH2)m)nR4，orCH＝N(CH2)m(O(CH2)m)nY2；R2，R3＝H，OH，OY1，O-X-OH，O-X-OY1，O-X-Y2，Y3，NHY1，NY12，Y3，NH-X-OH，NH-X-Y2，NH-X-Y3，NH-X-OY1，NY1-X-OH，NY1-X-Y2，NY1-X-Y3，或NY1-X-OY1；条件是R2和R3之一是H，或R2和R3一起表示羰基氧；R4＝H，OH，OY1，或Y3；Y1＝H，1-30个碳原子的烷基，3-30个碳原子的直链的或支链的环烷基，3-30个碳原子的链烯基，4-30个碳原子的氧烷基，7-30个碳原子的苯基烷基，或7-30个碳原子的苯氧基烷基；Y2＝NH2，NHY1，或NY12；Y3＝-(O(CH2)m)nR4或-(O(CH2)m)nY2，此处m＝2-4和n＝1-230；X＝ -OC(CH2)pCO-，此处p＝1-22。
11.权利要求10的方法，其中施用步骤包括含有式I结构的五环三萜烯化合物的组合物。
12.权利要求10的方法，其中施用步骤包括施用含有式II结构的五环三萜烯化合物的组合物。
13.权利要求10的方法，其中施用步骤包括施用含有选自的羽扇醇，桦木脑，28-丁二酰基桦木脑，桦木酸，甲磺酰基桦木酸，香树素，山楂醇，熊果酸，及其甲酯的五环三萜烯化合物的组合物。
14.权利要求10的方法，其中施用步骤包括施用含有选自羽扇醇，桦木脑，28-丁二酰基桦木脑，及其甲酯的五环三萜烯化合物的组合物。
15.权利要求10的方法，其中施用步骤包括施用含有桦木脑的组合物。
16.权利要求10的方法，其中施用步骤包括施用含有熊果酸的组合物。
17.权利要求10的方法，其中施用步骤包括将所说的组合物施用于谷物的表面。
全文摘要
本发明涉及在农业上可接受的载体中至少含有一种五环三萜烯化合物的杀菌有效的组合物。
文档编号C07C69/40GK1334733SQ99816045
公开日2002年2月6日 申请日期1999年12月1日 优先权日1998年12月8日
发明者J·格林斯基, K·布兰利 申请人:麦克罗弗罗公司, 泊灵格英格尔海姆药品公司