专利名称：一种生物荧光纳米温度计的制备方法
技术领域：
本发明涉及纳米材料领域和生物温度传感器技术领域，具体涉及一种基于具有温度敏感荧光特性的纳米微球的生物荧光纳米温度计的制备方法。
背景技术：
聚N-异丙基丙烯酰胺(poly N-isopropylacrylamide, pNIPAM )是一种具有温度响应性的聚合物，在低温下溶胀，在高温下收缩。PNIPAM的这种特殊的温敏性质使它在药物输运、温敏开关以及药物的可控释放领域都得到了广泛的研究报道。另一方面，近年来，金属纳米粒子凭借其优异的光、电、磁学性质也得到了迅速的发展，在光催化、光传感、 医学诊疗等领域发挥着越来越重要的作用。因此，将PNIPAM与金属纳米粒子进行复合，制备出的杂化纳米材料既保留了微球的温敏特性，又结合了金属纳米粒子优异的光学和电学特性，可实现多功能的集成，对于制备具有多重响应性的智能材料具有重要意义。目前，谢林小组(Polymer Chemistry. ,2009,47,4919-4926)已制备出温敏微球/银纳米球的杂化纳米粒子，首先通过微乳液聚合法合成温敏聚合物微球，然后将银离子利用静电吸附作用吸附在温敏微球表面，最后用强还原剂硼氢化钠将银离子还原成银纳米球。殷鹏刚小组 (Macromolecular Rapid Communications. , 2011，32，1000-1006)将上述制备的杂化纳米粒子应用于表面增强拉曼散射(Surface enhanced Raman scattering, SERS)技术，通过温度的高(或低)，调控SERS信号的强(或弱)。荧光在生化和医药领域有着广泛的应用，当荧光活性分子吸附到金属纳米粒子表面时，会引起荧光淬灭效应。引起荧光淬灭的因素，除局域场和分子到金属表面能量转移这两个方面外，还与金属纳米粒子表面与被吸附荧光活性分子之间的距离密切相关，荧光强度会随着他们之间距离大小的变化而变化。温度传感器在科学技术的发展中一直发挥着极其重要的作用，占据着目前传感器市场上75% 80%的份额。在对各种生物现象的研究中，温度同样是一个重要指标。由于不同的生物化学反应都有可能导致温度的变化，因此温度探测对于生理活动的监测具有十分重要的意义。比如，在细胞内部不断进行着各种各样的生化反应，这些反应都会产生热量。细胞内部温度的变化可能会改变DNA的工作方式或蛋白质分子的运行机制。如果温度上升到足够高时，一些蛋白质可能会发生改变并停止生产。因此，要想了解更多细胞内部的奇妙世界，就必须弄清楚细胞的温度及其变化规律。尽管传统的诸如水银温度计、双金属温度计、热电偶、光纤温度传感器等已成功地用于各种工业领域中，但它们往往无法实现对小于10微米以下的场所，特别是细胞等生物环境的原位探测。因而，将荧光活性分子与金属纳米粒子通过温敏聚合物微球相结合，制备出一种具有生物毒性低，生物兼容性好的生物荧光纳米温度计，为10微米以下生物环境的温度实现原位探测提供了一种有效的方法。
发明内容
技术问题本发明提供了一种制备具有荧光特性和温敏性双重特性的纳米杂化微球的生物荧光纳米温度计的制备方法。该方法首先合成聚合单体R6G/PNIPAM核壳结构的聚合物微球，进而在其表面原位生长一层银纳米球，获得具有荧光特性和温敏性双重特性的纳米杂化微球，该纳米杂化微球的荧光强度随着环境温度的升高(或降低)而实现线性可逆减弱(或增强)的变化，并在4°C 70°C (最佳为8°C 60°C)范围内具有很好的稳定性，对于温敏材料在生物传感、药物可控释放等方面的应用具有重要的价值。 技术方案本发明的生物荧光纳米温度计的制备方法具体为
1.)用N-异丙基丙烯酰胺(N-isopropylacrylamide，NIPAM)作为单体，亚甲基双丙烯酰胺(N，N-methylene-bis-acrylamide，BIS)作为交联剂，过硫酸钾(Potassium perSulfate，KPS)作为引发剂，以及罗丹明6G (Rhodamine 6G，R6G)作为荧光活性分子，四者的摩尔比为700:50:15:1 3000:150:40:1,先将NIPAM和BIS的混合水溶液加入三口烧瓶，然后加入R6G混合均勻，最后在无氧环境中加入KPS水溶液，在6(T80°C水浴条件下反应 2、小时，制备出荧光温敏聚合物微球；
2.)将步骤1)中制备得到的荧光温敏聚合物微球与硝酸银溶液混合，两者的摩尔比为 10 广14 1，将混合溶液加入三口烧瓶中，置于磁力搅拌器上搅拌均勻，通氩气除氧，迅速将在0°C冰水浴中充分冷却的硼氢化钠水溶液加入到所述混合溶液中，硝酸银与硼氢化钠的摩尔比为1 广6 1，在无氧环境下持续搅拌半小时后，将溶液离心清洗，移除上清液，将剩余产物按体积比1:10分散到纯净去离子水中，所得溶液即为制备的生物荧光纳米温度计。本发明中，步骤1)中的无氧环境是在三口烧瓶中持续通氩气除氧。步骤2)中，荧光温敏聚合物微球加入到硝酸银溶液中后，银离子通过静电吸附作用被吸附到温敏聚合物微球网孔中，用强还原剂硼氢化钠还原硝酸银得到生物荧光纳米温度计。本发明方法制备得到的生物荧光纳米温度计，通过调节水溶液的温度高低，可以控制荧光信号的强弱；当探针被置于温度<32°C水溶液时，由于温敏聚合物处于舒展状态， 荧光活性分子与银纳米球彼此间距离较大，荧光信号较强，当探针被置于温度>32°C水溶液时，温敏聚合物收缩，荧光活性分子与银纳米球间的距离变小，荧光淬灭效应增强，从而导致荧光信号减弱。最大荧光强度值随环境温度呈线性变化，且荧光强度随温度变化灵敏， 二者可以定量对应取值，表明所制备出的生物荧光纳米温度计可以应用作为一种纳米温度计。有益效果本发明和现有技术相比，制备了一种全新的具有荧光特性和温敏性双重特性的纳米杂化微球，具有以下优点
1.所制备的生物荧光纳米温度计同时具有荧光特性和温敏特性双重响应性质。即随着环境温度的升高(或降低)，温敏聚合物微球收缩(或舒展)，使得荧光活性分子与银纳米球之间的距离减小(或增大)，引起荧光淬灭效应的增强(或减弱)，导致荧光的信号强度呈可逆的减弱(或增强)。2.所制备的生物荧光纳米温度计的最大荧光强度随环境温度呈线性变化，荧光强度随温度变化灵敏，且二者可以定量对应取值，可有效作为一种纳米温度计。3.由于本发明采用生物兼容性好的聚合物pNIPAM作为温敏性材料，利用原位生长的方法制备银纳米球，所获得的生物荧光温度计毒性很小，生物兼容性好，并且在水性环境中可稳定分散。
4.制备得到的生物荧光温度计具有非常均勻的粒径和球形，通过改变合成条件可以很容易调节其尺寸大小。且由于尺寸小，易被细胞吞噬，因此可以实现对细胞等生物环境温度的原位探测。5.制备方法简单，不需要特殊的设备，在常温常压下操作，可控性强，重复性好。
图1是本发明实施例1制备的R6G/NIPAM_Ag核壳结构纳米微球的透射电镜照片； 图2是本发明实施例1制备的R6G/NIPAM-Ag核壳结构纳米微球在8°C ^60°C的荧光强
度变化谱图3是本发明实施例1制备的R6G/OTPAM-Ag核壳结构纳米微球的最大荧光强度随环境温度变化的曲线。图4是本发明实施例2制备的R6G/OTPAM-Ag核壳结构纳米微球的最大荧光强度随环境温度变化的曲线。
具体实施例方式本发明的生物荧光纳米温度计的制备方法具体为
1.)用N-异丙基丙烯酰胺(N-isopropylacrylamide，NIPAM)作为单体，亚甲基双丙烯酰胺(N，N-methylene-bis-acrylamide，BIS)作为交联剂，过硫酸钾(Potassium perSulfate，KPS)作为引发剂，以及罗丹明6G (Rhodamine 6G，R6G)作为荧光活性分子，四者摩尔比为700:50:15:1 3000:150:40:1,先将NIPAM和BIS的混合水溶液加入三口烧瓶， 然后加入R6G混合均勻，最后在三口烧瓶中持续通氩气除氧的无氧环境中加入KPS水溶液， 在6(T80°C水浴条件下反应2、小时后，离心清洗，移除上清液，将剩余产物分散到去离子水中，制备出荧光温敏聚合物微球；
2.)将步骤1)中制备得到的荧光温敏聚合物微球与硝酸银溶液混合，两者的摩尔比为 10 广14 1，将混合溶液加入三口烧瓶中，置于磁力搅拌器上搅拌均勻，通氩气除氧，迅速将在0°C冰水浴中充分冷却的硼氢化钠水溶液加入到所述混合溶液中，硝酸银与硼氢化钠的摩尔比为1 广6 1，在无氧环境下持续搅拌半小时后，将溶液离心清洗，移除上清液，将剩余产物按体积比1:10分散到纯净去离子水中，所得溶液即为制备的生物荧光纳米温度计。性明方法为得到本发明方法制备的生物荧光纳米温度计的最大荧光强度随环境温度变化特性，先取一定量本发明方法制备的生物荧光纳米温度计，通过荧光光谱仪，测出其在8飞0°C不同温度下的荧光强度值，然后取所测的不同温度下的最大荧光强度值，并作出最大荧光强度值随温度变化的曲线图。以下举例说明本发明的具体实施方式
，但本发明的内容并不局限于以下实施例。实施例1
1)荧光温敏聚合物微球的制备
取;MOmg NIPAM和23mg BIS配成20 ml水溶液加入到50ml的三口烧瓶中，再加入0. 1 ml (0.01mol/L)R6G溶液，磁搅拌，通氩气半小时后，迅速加入4 ml (0.01 mol/L)KPS水溶液，在80°C水浴条件下反应8小时左右后，离心清洗，移除上清液，将剩余产物分散到10 ml 去离子水中，得到荧光温敏聚合物微球。
2)生物荧光纳米温度计的制备
室温搅拌条件下，取2ml上述步骤1)制备的温敏微球加入30ml的三口烧瓶中，用8ml 去离子水稀释，加6ml (0. 01mol/L)硝酸银溶液，磁搅拌均勻，通氩气除氧，半小时后，迅速加入Iml 0°C冰水浴中充分冷却的(O.Olmol/L)硼氢化钠水溶液，搅拌半小时后停止搅拌， 离心清洗，移除上清液，将剩余产物按体积比1:10分散到去离子水中，即得到生物荧光纳米温度计。检测得到的生物荧光纳米温度计的最大荧光强度随环境温度变化特性
取2ml步骤2)制备的生物荧光纳米温度计加入到比色皿中，通过荧光光谱仪，分别测量该溶液在8°C，16°C，32°C，40°C，48°C，56 V，60 V的荧光强度谱线，并进行比较。取上述所测的不同温度下的最大荧光强度值(544nm处的荧光强度值)，随上述温度值从低到高，其最大荧光强度值依次为249600 (a. U. ),227000 (a. u. ),203100 (a. u.)， 176100 (a. u. ),157300 (a. u. ),139900 (a. u. ),123100 (a. u.)，做出最大荧光强度值随温度变化的曲线图。该生物荧光纳米温度计的透射电镜照片见图1，由图1可见，该生物荧光纳米温度计的尺寸均一，分散均勻，形貌呈球形，95%以上的银纳米球都生长在温敏聚合物微球表面， 室温下生物荧光纳米温度计的平均尺寸大约在250nm左右。从图2中可以看出，所制备出的生物荧光纳米温度计水溶液在波长M4nm处具有优良的荧光性能，并且在不同温度下荧光强度值区分明显。该生物荧光纳米温度计的最大荧光强度随着温度的升高逐渐降低，说明制备的生物荧光纳米温度计可以通过温度变化调控荧光信号的强弱。从图3中可以看出，最大荧光强度值随环境温度呈线性变化，且荧光强度随温度变化灵敏，二者可以定量对应取值，表明所制备出的生物荧光纳米温度计可以应用作为一种纳米温度计。实施例2
1)温敏聚合物微球的制备
取80 mg NIPAM和Sng BIS配成20 ml水溶液加入到50ml的三口烧瓶中，再加入0. 1 ml (0. 01mol/L)R6G溶液，磁搅拌，通氩气半小时后，迅速加入1.5 ml (0. 01mol/L) KPS水溶液，在60°C水浴条件下反应2小时左右，离心清洗，移除上清液，将剩余产物分散到10 ml 去离子水中，得到荧光温敏聚合物微球。2)生物荧光纳米温度计的制备
室温搅拌条件下，取2ml上述步骤1)制备的荧光温敏微球加入30ml三口烧瓶中，用 8ml去离子水稀释，加Iml (0. Olmol/L)硝酸银溶液，磁搅拌均勻，通氩气除氧，半小时后， 迅速加入Iml 0°C冰水浴中充分冷却的(0. 01mol/L)硼氢化钠溶液，搅拌半小时后停止搅拌，离心清洗，移除上清液，将剩余产物按体积比1 10分散到去离子水中，即得到生物荧光纳米温度计。检测得到的生物荧光纳米温度计的最大荧光强度随环境温度变化特性
取2ml步骤2)制备的生物荧光纳米温度计加入到比色皿中，通过荧光光谱仪，分别测量该溶液从8。C到60。C的荧光强度谱线，并进行比较。取上述所测的不同温度下的最大荧光强度值(544nm处的荧光强度值)，做出最大荧光强度值随温度变化的曲线图。如图4所示，最大荧光强度值随环境温度呈明显线性变化，且二者可以定量对应取值，表明所制备出的生物荧光纳米温度计可以应用作为一种纳米温度计。实施例3
1)温敏聚合物微球的制备
取210 mg NIPAM和15mg BIS配成20 ml水溶液加入到50ml的三口烧瓶中，再加入0. 1 ml (0. 01mol/L)R6G溶液，磁搅拌，通氩气半小时后，迅速加入2. 7ml (0.01 mol/L) KPS水溶液，在76°C水浴条件下反应4小时左右，离心清洗，移除上清液，将剩余产物分散到10 ml 去离子水中，得到荧光温敏聚合物微球。2)生物荧光纳米温度计的制备
室温搅拌条件下，取2ml上述步骤1)制备的荧光温敏微球加入30ml三口烧瓶中，用 8ml去离子水稀释，加3. 5ml (0. Olmol/L)硝酸银溶液，磁搅拌均勻，通氩气除氧，半小时后， 迅速加入Iml 0°C冰水浴中充分冷却的(0. 01mol/L)硼氢化钠溶液，搅拌半小时后停止搅拌，离心清洗，移除上清液，将剩余产物按体积比1 10分散到去离子水中，即得到生物荧光纳米温度计。检测得到的生物荧光纳米温度计的最大荧光强度随环境温度变化特性
取2ml步骤2)制备的生物荧光纳米温度计加入到比色皿中，通过荧光光谱仪，分别测量该溶液从8。C到60。C的荧光强度谱线，并进行比较。取上述所测的不同温度下的最大荧光强度值(544nm处的荧光强度值)，做出最大荧光强度值随温度变化的曲线图。同样可以得到最大荧光强度值随环境温度呈明显线性变化趋势，表明所制备出的生物荧光纳米温度计可应用作为纳米温度计。实施例4
1)温敏聚合物微球的制备
取275mg NIPAM和19mg BIS配成20 ml水溶液加入到50ml的三口烧瓶中，再加入0. 1 ml (0. 01mol/L) R6G溶液，磁搅拌，通氩气半小时后，迅速加入3.細1 (0.01 mol/L) KPS水溶液，在70°C水浴条件下反应6小时左右，离心清洗，移除上清液，将剩余产物分散到10 ml 去离子水中，得到荧光温敏聚合物微球。2)生物荧光纳米温度计的制备
室温搅拌条件下，取2ml上述步骤1)制备的荧光温敏微球加入30ml三口烧瓶中，用 8ml去离子水稀释，加4. 5ml (0. Olmol/L)硝酸银溶液，磁搅拌均勻，通氩气除氧，半小时后， 迅速加入Iml 0°C冰水浴中充分冷却的(0. 01mol/L)硼氢化钠溶液，搅拌半小时后停止搅拌，离心清洗，移除上清液，将剩余产物按体积比1 10分散到去离子水中，即得到生物荧光纳米温度计。检测得到的生物荧光纳米温度计的最大荧光强度随环境温度变化特性
取2ml步骤2)制备的生物荧光纳米温度计加入到比色皿中，通过荧光光谱仪，分别测量该溶液从8。C到60。C的荧光强度谱线，并进行比较。取上述所测的不同温度下的最大荧光强度值(544nm处的荧光强度值)，做出最大荧光强度值随温度变化的曲线图。同样可以得到最大荧光强度值随环境温度呈明显线性变化趋势，表明所制备出的生物荧光纳米温度计可应用作为纳米温度计。实施例5
1)温敏聚合物微球的制备取305 mg NIPAM和21mg BIS配成20 ml水溶液加入到50ml的三口烧瓶中，再加入0. 1 ml (0. 01mol/L)R6G溶液，磁搅拌，通氩气半小时后，迅速加入3. 6ml (0.01 mol/L) KPS水溶液，在78°C水浴条件下反应2小时左右，离心清洗，移除上清液，将剩余产物分散到10 ml 去离子水中，得到荧光温敏聚合物微球。2)生物荧光纳米温度计的制备
室温搅拌条件下，取2ml上述步骤1)制备的荧光温敏微球加入30ml三口烧瓶中，用 8ml去离子水稀释，加5. 2ml (0. Olmol/L)硝酸银溶液，磁搅拌均勻，通氩气除氧，半小时后， 迅速加入Iml 0°C冰水浴中充分冷却的(0. 01mol/L)硼氢化钠溶液，搅拌半小时后停止搅拌，离心清洗，移除上清液，将剩余产物按体积比1 10分散到去离子水中，即得到生物荧光纳米温度计。检测得到的生物荧光纳米温度计的最大荧光强度随环境温度变化特性
取2ml步骤2)制备的生物荧光纳米温度计加入到比色皿中，通过荧光光谱仪，分别测量该溶液从8。C到60。C的荧光强度谱线，并进行比较。取上述所测的不同温度下的最大荧光强度值(544nm处的荧光强度值)，做出最大荧光强度值随温度变化的曲线图。同样可以得到最大荧光强度值随环境温度呈明显线性变化趋势，表明所制备出的生物荧光纳米温度计可应用作为纳米温度计。实施例6
1)温敏聚合物微球的制备
取145 mg NIPAM和Ilmg BIS配成20 ml水溶液加入到50ml的三口烧瓶中，再加入 0.1 ml (0. 01mol/L) R6G溶液，磁搅拌，通氩气半小时后，迅速加入anl (0.01 mol/L) KPS 水溶液，在70°C水浴条件下反应4小时左右，离心清洗，移除上清液，将剩余产物分散到10 ml去离子水中，得到荧光温敏聚合物微球。2)生物荧光纳米温度计的制备
室温搅拌条件下，取2ml上述步骤1)制备的荧光温敏微球加入30ml三口烧瓶中，用 8ml去离子水稀释，加2. 5ml (0. Olmol/L)硝酸银溶液，磁搅拌均勻，通氩气除氧，半小时后， 迅速加入Iml 0°C冰水浴中充分冷却的(0. 01mol/L)硼氢化钠溶液，搅拌半小时后停止搅拌，离心清洗，移除上清液，将剩余产物按体积比1 10分散到去离子水中，即得到生物荧光纳米温度计。检测得到的生物荧光纳米温度计的最大荧光强度随环境温度变化特性
取2ml步骤2)制备的生物荧光纳米温度计加入到比色皿中，通过荧光光谱仪，分别测量该溶液从8。C到60。C的荧光强度谱线，并进行比较。取上述所测的不同温度下的最大荧光强度值(544nm处的荧光强度值)，做出最大荧光强度值随温度变化的曲线图。同样可以得到最大荧光强度值随环境温度呈明显线性变化趋势，表明所制备出的生物荧光纳米温度计可应用作为纳米温度计。实施例7
1)温敏聚合物微球的制备
取110 mg NIPAM和9mg BIS配成20 ml水溶液加入到50ml的三口烧瓶中，再加入0. 1 ml (0. Olmol/L) R6G溶液，磁搅拌，通氩气半小时后，迅速加入1.8ml (0.01 mol/L) KPS水溶液，在74°C水浴条件下反应4小时左右，离心清洗，移除上清液，将剩余产物分散到10 ml去离子水中，得到荧光温敏聚合物微球。2)生物荧光纳米温度计的制备
室温搅拌条件下，取2ml上述步骤1)制备的荧光温敏微球加入30ml三口烧瓶中，用 8ml去离子水稀释，加1. 7ml (0. Olmol/L)硝酸银溶液，磁搅拌均勻，通氩气除氧，半小时后， 迅速加入Iml 0°C冰水浴中充分冷却的(0. 01mol/L)硼氢化钠溶液，搅拌半小时后停止搅拌，离心清洗，移除上清液，将剩余产物按体积比1 10分散到去离子水中，即得到生物荧光纳米温度计。检测得到的生物荧光纳米温度计的最大荧光强度随环境温度变化特性
取2ml步骤2)制备的生物荧光纳米温度计加入到比色皿中，通过荧光光谱仪，分别测量该溶液从8。C到60。C的荧光强度谱线，并进行比较。取上述所测的不同温度下的最大荧光强度值(544nm处的荧光强度值)，做出最大荧光强度值随温度变化的曲线图。同样可以得到最大荧光强度值随环境温度呈明显线性变化趋势，表明所制备出的生物荧光纳米温度计可应用作为纳米温度计。以上实施例仅是本发明的优选实施方式，应当指出对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种生物荧光纳米温度计的制备方法，其特征在于，该制备方法具体为1)用N-异丙基丙烯酰胺作为单体，亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂，过硫酸钾作为引发剂，罗丹明6G作为荧光活性分子，四者的摩尔比为700 50 15 1 3000 150 40 1，先将N-异丙基丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺的混合水溶液加入三口烧瓶，然后加入罗丹明6G混合均勻，最后在无氧环境中加入KPS水溶液，在6(T80°C水浴条件下反应2、小时，制备出荧光温敏聚合物微球；2)将步骤1)中制备得到的荧光温敏聚合物微球与硝酸银溶液混合，两者的摩尔比为 10 广14 1，将混合溶液加入三口烧瓶中，置于磁力搅拌器上搅拌均勻，通氩气除氧，迅速将在0°C冰水浴中充分冷却的硼氢化钠水溶液加入到所述混合溶液中，硝酸银与硼氢化钠的摩尔比为1 广6 1，在无氧环境下持续搅拌半小时后，将溶液离心清洗，移除上清液，将剩余产物按体积比1:10分散到纯净去离子水中，所得溶液即为制备的生物荧光纳米温度计。
2.根据权利要求1所述的生物荧光纳米温度计的制备方法，其特征在于，所述步骤1) 中的无氧环境是在三口烧瓶中持续通氩气除氧。
全文摘要
本发明是一种生物荧光纳米温度计的制备方法，所制备出的生物荧光纳米温度计其特征一方面在于利用荧光淬灭效应实现温度对荧光强度的调控。在低温时，由于温敏聚合物处于舒展状态，使荧光活性分子与金属银纳米球之间的距离变大，荧光淬灭效应较弱，导致荧光信号较强；当温度升高时，温敏聚合物收缩，使荧光活性分子与金属银纳米球之间的距离变小，荧光淬灭效应增强，导致荧光信号减弱。另一方面在于该生物荧光纳米温度计的最大荧光强度随环境温度呈线性变化，且荧光强度随温度变化灵敏，二者可以定量对应取值，表明所制备出的生物荧光纳米温度计可以应用作为一种纳米温度计。
文档编号C08J3/03GK102516696SQ20111042614
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月19日 优先权日2011年12月19日
发明者宗慎飞, 崔一平, 王著元, 邵平 申请人:东南大学