本发明涉及通式(I)新型二芳基脲类化合物作为用于炎症性和肿瘤性药物的用途。
背景技术：
丝裂素活化蛋白激酶(MAPKs)是细胞内蛋白激酶的一种，属于丝氨酸/苏氨酸激酶系列，能够作为细胞内众多活化反应和功能反应的调节介质，参与基因表达、细胞增殖和死亡等众多的功能性过程。p38MAPK信号通路是MAPK家族的重要组成成员，它的活化是众多前炎性因子和压力因素作用的结果，不仅在众多包括炎性细胞增殖分化和扩增的细胞内信号反馈过程中发挥着非常重要的作用，而且参与应激反应的过程。有许多相关的文献描述了p38MAPK相关的性质和在疾病研究中的应用以及前景。
p38MAPK原先被认为是通过细胞因子发挥抑制作用的抗炎药物的结合蛋白(CSBP)，首先在1993年由Han等在实验中发现，1994年由Han等首先在小鼠肝脏细胞中克隆了p38MAPK的基因，它是编码由360个氨基酸组成的38KD的蛋白，在炎性细胞因子的生物合成过程中发挥重要的调节作用。
目前发现的p38MAPK家族包含着四种类型：p38α，p38β，p38γand p38δ。不同p38MAPK亚型在组织分布、上游激酶调节、下游作用底物以及对细胞外刺激的反应都各有不同，不同亚型的p38MAPK在结构上也有着不同程度的相似性。p38α和p38β在各种体内组织中都有着广泛的表达，同时它们包含了74％相同的氨基酸序列，并且它们都是特异性表达的，p38γ与p38α有着64％的氨 基酸同源性，p38γ则主要在骨骼肌中表达，而p38δ则在小肠、肺组织、肾上腺、前列腺等处比较常见。由于p38α和β在身体各部位的分布比较广泛，因而针对p38MAPK的抑制剂主要是针对p38α和β的抑制。许多证据表明p38MAPK途径在炎症疾病和癌症中表现出重要的作用。对p38MAPK在这些相关疾病中的作用进行了总结，同时也表明了p38MAPK的抑制剂具有作为治疗手段的潜在价值。
我们创造性发明了全新的二芳基脲类化合物用作P38MAPK抑制剂的研究，通过高通量筛选评价了这类化合物在体外对P38MAPK通路的抑制作用。发现几乎所有实施例化合物细胞活性与P38α酶活性都优于文献公认的P38抑制剂SB203580，其中化合物实施例9和文献报道的阳性对照药SB203580比较，TNF-α抑制活性增强10倍，P38α酶抑制活性增强40倍.此外与阳性对照药BIRB-796比较，实施例2和实施例31对P38α酶选择性明显提高。
本发明报道的具有高活性的P38MAPK小分子抑制剂，用以克服炎症、炎症相关疾病及肿瘤疾病的难题，特别是窒息性气体或刺激性气体造成的急性肺损伤疾病，为这类疾病的临床治疗提供新的医学策略。
本发明目的在于提供一类新型的二芳基脲类化合物作为用于炎症性和肿瘤性药物的用途。
技术实现要素：
1.本发明涉及通式(I)化合物或其异构体的内容
其中：
Ar1为C6-C10芳香碳环，包括但不限于苯环、取代苯环、环辛四烯等；或C3-C10饱和不饱的非芳香杂环，包括但不限于环戊烷、环己烷、环戊烯、环己烯、环己二烯；C5-C10的芳香杂环，包括一到多个选自O，N，S的杂原子，包括但不限于咪唑、吡唑、呋喃、噻吩、噻唑、噁唑、吡嗪、嘧啶、吲哚、喹啉等；或者C5-C8的单杂环或者C8-C11的双杂环，包括一到多个选自O，N，S的杂原子，包括但不限于四氢呋喃、四氢噻吩、哌啶等；其中Ar1独立并选择性的被一到多个R1所取代；
R1独立的为
(1)C1-C10饱和的直连或支链烷烃，所述的烷基可部分或全部被卤素原子取代，并且可以选择性的被1-3个苯基，萘环或以下杂原子取代：喹啉基，异喹啉基，嘧啶基，吡嗪基，哌嗪基，吡咯基，呋喃基，噻吩基，吡唑基，噻唑基，噁唑基，异噁唑基，异噻唑基；上述的苯基，萘环或者杂环可以选择性的被0-5个下述基团取代：卤素，C1-C6的直连或支链烷基，C2-C6的直连或支链烯烃，C1-C6的直连或支链烷氧基，C2-C6的直连或支链烯氧基，卤素，三氟甲基，三氟甲氧基，乙酰基，芳酰基，甲氧羰基，乙氧羰基，苯磺酰基，羟基，氨基，单或双C1-C4取代的磺酰胺基，氰基，硝基；
(2)C3-C10的环烷基和环烯基，所述基团可部分或全部被卤素取代，或选择性的被1-3个C1-C6的直连或支链烷基或C1-C6烷氧基取代；上述的环烷基或者环烯基的1-3个亚甲基可以选择性的被O，NH，S，SO，SO2，羰基，羟甲基取代；上述的环烷基或者环烯基的0-5个以下基团取代：卤素，C1-C6的直连或支链烷基或C1-C6烷氧基；
(3)C3-C10不饱和的直连或支链烯基，所述的烷基可部分或全部被卤素取代，并且选择性的被1-3个C1-C6的直连或支链烷基，苯基，萘基或以下杂环取代：喹啉基，异喹啉基，嘧啶基，吡嗪基，哌嗪基，吡咯基，呋喃基，噻吩基，吡唑基，噻唑基，噁唑基，异噁唑基，异噻唑基；上述的苯基，萘环或者杂环可以选择性的被0-5个下述基团取代：卤素，C1-C6的直连或支链烷基，C2-C6的直连或支链烯烃，C1-C6的直连或支链烷氧基，C2-C6的直连或支链烯氧基，卤素，三氟甲基，三氟甲氧基，乙酰基，芳酰基，甲氧羰基，乙氧羰基，苯磺酰基，羟基，氨基，单或双C1-C4取代的磺酰胺基，氰基，硝基；
(4)卤素，硝基，羟基，氨基，羧基，氰基，三氟甲基，三氟甲氧基，以及各种单取代或是双取代的氨基化合物；
R1独立的为C1-C10饱和的直连、支链以及环烷烃，卤素取代；
R2独立的为C1-C10饱和的直连、支链以及环烷烃取代，苯环或取代苯环取代，苯并杂环取代，杂环取代：喹啉基，异喹啉基，嘧啶基，吡嗪基，哌嗪基，吡咯基，呋喃基，噻吩基，吡唑基，噻唑基，噁唑基，异噁唑基，异噻唑基；
另一方面，本发明提供包含化合物通式(I)化合物药物的药用组合物，其含有至少一种通式(I)化合物或其可药用盐、溶剂化物，一级一种或多种药用载体或赋形剂。
另一方面，本发明还涉及制备通式(I)化合物或者其药用盐或溶剂化物的方法。
再一方面，本发明涉及通式(I)化合物用于治疗或预防细胞因子(TNF-α，IL-1等)介导的疾病的药用用途。
在又一方面，本发明提供通式(I)化合物用于治疗或预防细胞因子(TNF- α，IL-1等)介导的疾病，危险因子或病症的方法，包括给予有此需要的对象治疗或是预防有效量的本发明化合物。本发明中所述的细胞因子(TNF-α，IL-1等)介导的疾病，危险因子或病症包括下列疾病：类风湿性关节炎，慢性肺阻塞，窒息性气体或刺激性气体造成的急性肺损伤，牛皮癣性关节炎，莱特尔氏综合征，痛风，骨关节炎，外伤性关节炎，急性滑膜炎，类风湿性脊柱炎，痛风性疾病和其他关节疾病，败血症，脓毒性休克，骨髓增生异常综合征，中毒性休克，脑性疟，脑膜炎，局部出血性中风，骨质疏松，充血性心力衰竭，冠状动脉旁路搭桥术，肾小球性肾炎，慢性肾衰竭，糖尿病，糖尿病性视网膜病，节段性回肠炎，溃疡性结肠炎，肌肉退化，湿疹，接触性皮炎，牛皮癣，结膜炎，癌症的辅助治疗等。
在本发明的一个实施方式中，本发明提供了通式(I)化合物及其药用盐或溶剂化物，
其中：
Ar1为苯环、取代苯环等；C5-C10的芳香杂环，包括一到多个选自O，N，S的杂原子，包括但不限于咪唑、吡唑、呋喃、噻吩、噻唑、噁唑、吡嗪、嘧啶、吲哚、喹啉等；包括芳基取代的芳香杂环，如苯基取代的吡唑、咪唑等；
R1独立的为H或卤素原子；
R2苯环或取代苯环取代，苯并杂环取代，萘酚取代；
另一方面，本发明提供包含化合物通式(I)化合物药物的药用组合物， 其含有至少一种通式(I)化合物或其可药用盐、溶剂化物，一级一种或多种药用载体或赋形剂。
另一方面，本发明还涉及制备通式(I)化合物或者其药用盐或溶剂化物的方法。
再一方面，本发明涉及通式(I)化合物用于治疗或预防细胞因子(TNF-α，IL-1等)介导的疾病的药用用途。
在又一方面，本发明提供通式(I)化合物用于治疗或预防细胞因子(TNF-α，IL-1等)介导的疾病，危险因子或病症的方法，包括给予有此需要的对象治疗或是预防有效量的本发明化合物。本发明中所述的细胞因子(TNF-α，IL-1等)介导的疾病，危险因子或病症包括下列疾病：类风湿性关节炎，慢性肺阻塞，窒息性气体或刺激性气体造成的急性肺损，伤牛皮癣性关节炎，莱特尔氏综合征，痛风，骨关节炎，外伤性关节炎，急性滑膜炎，类风湿性脊柱炎，痛风性疾病和其他关节疾病，败血症，脓毒性休克，骨髓增生异常综合征，中毒性休克，脑性疟，脑膜炎，局部出血性中风，骨质疏松，充血性心力衰竭，冠状动脉旁路搭桥术，肾小球性肾炎，慢性肾衰竭，糖尿病，糖尿病性视网膜病，节段性回肠炎，溃疡性结肠炎，肌肉退化，湿疹，接触性皮炎，牛皮癣，结膜炎，癌症的辅助治疗等。
在本发明的一个优选实施方式中，本发明提供了通式(I)化合物及其药用盐或溶剂化物，
Ar1为异丙基苯环，2-三氟甲基氯苯，3-叔丁基-1-对甲基苯基吡唑，3-叔丁基-1-对硝基苯基吡唑，3-叔丁基-1-对氟苯基吡唑，3-叔丁基-1-苯基吡唑取代；
R1独立的为H或F原子；
R2独立的为苯并吡啶取代，1，2，3，4四氢萘酚取代；
另一方面，本发明提供包含化合物通式(I)化合物药物的药用组合物，其含有至少一种通式(I)化合物或其可药用盐、溶剂化物，一级一种或多种药用载体或赋形剂。
另一方面，本发明还涉及制备通式(I)化合物或者其药用盐或溶剂化物的方法。
再一方面，本发明涉及通式(I)化合物用于治疗或预防细胞因子(TNF-α，IL-1等)介导的疾病的药用用途。
在又一方面，本发明提供通式(I)化合物用于治疗或预防细胞因子(TNF-α，IL-1等)介导的疾病，危险因子或病症的方法，包括给予有此需要的对象治疗或是预防有效量的本发明化合物。本发明中所述的细胞因子(TNF-α，IL-1等)介导的疾病，危险因子或病症包括下列疾病：类风湿性关节炎，慢性肺阻塞，窒息性气体或刺激性气体造成的急性肺损伤，牛皮癣性关节炎，莱特尔氏综合征，痛风，骨关节炎，外伤性关节炎，急性滑膜炎，类风湿性脊柱炎，痛风性疾病和其他关节疾病，败血症，脓毒性休克，骨髓增生异常综合征，中毒性休克，脑性疟，脑膜炎，局部出血性中风，骨质疏松，充血性心力衰竭，冠状动脉旁路搭桥术，肾小球性肾炎，慢性肾衰竭，糖尿病，糖尿病性视网膜病，节段性回肠炎，溃疡性结肠炎，肌肉退化，湿疹，接触性皮炎，牛皮癣，结膜炎，癌症的辅助治疗等。
本发明优选的化合物包括：
1-[3-(叔丁基)-1-(对甲基苯基)-1H-吡唑-5-基]-3-{2-[(5-羟基-5，6，7，8-四氢萘-2-基)氧基]苄基}脲
1-[3-(叔丁基)-1-(对硝基苯基)-1H-吡唑-5-基]-3-{2-[(5-羟基-5，6，7，8-四氢萘-2-基)氧基]苄基}脲
1-[3-(叔丁基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基]-3-{2-[(5-羟基-5，6，7，8-四氢萘-2-基)氧基]苄基}脲
1-[3-(叔丁基)-1-(对硝基苯基)-1H-吡唑-5-基]-3-{5-氟-2-[(5-羟基-5，6，7，8-四氢萘-2-基)氧基]苄基}脲
1-[3-(叔丁基)-1-(对甲基苯基)-1H-吡唑-5-基]-3-{5-氟-2-[(5-羟基-5，6，7，8-四氢萘-2-基)氧基]苄基}脲
1-{2-[(5-羟基-5，6，7，8-四氢萘-2-基)氧基]苄基}-3-(3-异丙基苯基)脲
1-(4-氯-3-三氟甲基苯基)-3-{2-[(5-羟基-5，6，7，8-四氢萘-2-基)氧基]苄基}脲
1-[3-(叔丁基)-1-对甲基苯基-5-基]-3-[2-(喹啉-6-氧基)苄基]脲
1-[3-(叔丁基)-1-苯基-5-基]-3-[2-(喹啉-6-氧基)苄基]脲
1-[3-(叔丁基)-1-对硝基苯基-5-基]-3-[2-(喹啉-6-氧基)苄基]脲
1-[3-(叔丁基)-1-对硝基苯基-5-基]-3-[5-氟-2-(喹啉-6-氧基)苄基]脲
1-[3-(叔丁基)-1-苯基-5-基]-3-[5-氟-2-(喹啉-6-氧基)苄基]脲
1-[3-(叔丁基)-1-对甲基苯基-5-基]-3-[5-氟-2-(喹啉-6-氧基)苄基]脲
以及其可药用盐或溶剂化物。
本发明提供了通式(I)化合物及其药用盐的制备方法。
R1＝CH3，NO2，H
R2＝H，F
取代的苯肼A与氰基频那酮B于80℃乙醇回流8小时得到中间体C；中间体C，E，G通过与氯甲酸三氯乙酯在0℃四氢呋喃溶液中反应12小时得到中间 体D，F，H。
取代的邻氰基氟苯I与6-羟基喹啉在90℃DMSO溶液中反应2小时得到中间体M，中间体M在65℃四氢呋喃溶液中通过氢化铝锂还原1小时得到中间体N。
取代的邻氰基氟苯I与6-羟基1，2，3，4四氢萘酮在90℃DMSO溶液中反应2小时得到中间体J，中间体J在65℃四氢呋喃溶液中通过氢化铝锂还原1小时得到中间体K。
取代的邻氰基氟苯I与6-羟基喹啉在90℃DMSO溶液中反应2小时得到中间体M；中间体M在65℃四氢呋喃溶液中通过氢化铝锂还原1小时得到中间体N。
中间体D，F，H与中间体N，K在100℃DMSO溶液中反应1小时得到终产物L，O。
再一方面，本发明提供一种用于克服炎症、炎症相关疾病、肿瘤及窒息性气体或刺激性气体造成的急性肺损伤疾病药物组合物，其包含上述式I的化合物，或它们的异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物或N-氧化物，以及至少一种药学上可接受的载体。
再一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含上述式I的化合物，或它们的异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物或N-氧化物，另外包含一种或多种克服炎症、炎症相关疾病、肿瘤及窒息性气体或刺激性气体造成的急性肺损伤疾病药物组合物，其包含上述式I的化合物，以及至少一种药学上可接受的载体。
再一方面，本发明提供上述式I的化合物，或它们的异构体、药学上 可接受的盐、溶剂化物或N-氧化物，它们用作克克服炎症、炎症相关疾病、肿瘤及窒息性气体或刺激性气体造成的急性肺损伤疾病药物。
再一方面，本发明提供一种克服炎症、炎症相关疾病、肿瘤及窒息性气体或刺激性气体造成的急性肺损伤疾病的方法，其包括向该受试者给予治疗有效量的上述式I的化合物，或它们的异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物或N-氧化物，并且任选联合给予一种或多种其它抗炎药物。
再一方面，本发明提供上述式I的化合物或它们的异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物或N-氧化物在制备药物中的用途，其中所述药物用于克服炎症、炎症相关疾病、肿瘤及窒息性气体或刺激性气体造成的急性肺损伤疾病。
现将本申请说明书和权利要求书中出现的用于描述本发明的术语定义如下。对于特定的术语，如果本申请中定义的含义与本领域技术人员通常理解的含义不一致，则以本申请中定义的含义为准；如果在本申请中没有定义，则其具有本领域技术人员通常理解的含义。
本发明中使用的术语“烷基”是指直链或支链一价饱和烃基。“C1-C10烷基”是指具有1～10个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、2-戊基、异戊基、新戊基、己基、2-己基、3-己基、3-甲基戊基、庚基和辛基等。术语“C1-C6烷基”意指具有1～6，即1、2、3、4、5或6个碳原子的直链或支链烷基，典型地为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基和己基等。相似地，术语“C1-C3烷基”意指具有1、2或3个碳原子的直链或支链烷基， 即甲基、乙基、正丙基和异丙基。本发明中的烷基优选是C1-C6烷基，更优选是C1-C3烷基。
本发明中使用的术语“卤素”是指氟、氯、溴以及碘原子。
本发明中使用的术语“芳香基”是指包含至少一个不饱和芳环的任选被取代的单环或二环烃环系统，优选具有6～10，即6、7、8、9或10个碳原子的芳基。本发明中的芳香基的实例包括苯基、萘基、1，2，3，4-四氢萘基、吲哚基和茚基等。本发明中的芳香基可以被以下基团取代：C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、腈基、卤素、羟基、氨基、硝基、单(C1-C6)烷基氨基、二(C1-C6)烷基氨基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6卤代烷基或C1-C6卤代烷氧基。
本发明中使用的术语“芳香杂环基”是指包含至少一个独立地选自N、O或S的杂原子的任选被取代的单环或双环不饱和芳环系统，优选具有5～10，即5、6、7、8、9或10个原子的芳香杂环基。“芳香杂环基”的实例包括但不限于噻吩基、吡啶基、噻唑基、异噻唑基、呋喃基、吡咯基、三唑基、咪唑基、三嗪基、噁二唑基、噁唑基、异噁唑基、吡唑基、咪唑酮基、噁唑、噻唑酮基、四唑基、噻二唑基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、四氢三唑并吡啶基、四氢三唑并嘧啶基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、硫茚基、吲哚基、异吲哚基、吡啶酮基、哒嗪基、吡嗪基、嘧啶基、喹啉基、酞嗪基、喹喔啉基、喹唑啉基、咪唑并吡啶基、噁唑并吡啶基、噻唑并吡啶基、咪唑并哒嗪基、噁唑并哒嗪基、噻唑并哒嗪基、蝶啶基、呋咱基、苯并三唑基、吡唑并吡啶基和嘌呤基等。本发明中的杂芳基可以被以下基团取代：C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、腈基、卤素、羟基、氨基、硝基、单(C1-C6)烷基氨基、二(C1-C6)烷基氨基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6卤代烷基或C1-C6卤代烷氧基。
本发明中使用的术语“环烷基”是指3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的饱和碳环基团。该环烷基可以是单环或者多环稠合系统，而且可以稠合在芳环上。这些基团的实例包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基等。 本文的环烷基可以是未取代的，或者在一个或多个可取代的位置被合适的基团取代。例如，本发明中的环烷基可任选被以下基团取代：C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、腈基、卤素、羟基、氨基、硝基、单(C1-C6)烷基氨基、二(C1-C6)烷基氨基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6卤代烷基或C1-C6卤代烷氧基。
本发明中使用的术语“杂环基”是指包含至少一个和最多四个独立地选自N、O或S的杂原子的任选被取代的单环和双环饱和、部分饱和或不饱和的环状系统，优选具有4～10，即4、5、6、7、8、9或10个原子的5、6或7元杂环基，条件是该杂环基的环不含两个相邻的O或S原子。优选的杂环基包括但不限于吡咯烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、哌啶基、吗啉基或哌嗪基等。本发明中的杂环基可以被以下基团取代：C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、腈基、卤素、羟基、氨基、硝基、单(C1-C6)烷基氨基、二(C1-C6)烷基氨基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6卤代烷基或C1-C6卤代烷氧基。
本发明中使用的术语“芳基烷基”是指被一个或多个如上定义的芳基取代的如上定义的烷基。优选的芳基烷基是芳基-C1-C3烷基。本发明中的芳基烷基的实例包括苄基和苯基乙基等。
本发明中使用的术语“芳香杂环基烷基”是指被如上定义的芳香杂环基取代的如上定义的烷基。更优选的芳香杂环基烷基是5-或6-元杂芳基-C1-C3-烷基。本发明中的杂芳基烷基的实例包括吡啶基乙基等。
本发明中使用的术语“杂环基烷基”是指被如上定义的杂环基取代的如上定义的烷基。更优选的杂环基烷基是5或6元杂环基-C1-C3-烷基。本发明中的杂环基烷基的实例包括四氢吡喃基甲基。
本发明中使用的术语“药学上可接受的盐”意指在制药上可接受的并且具有母体化合物的所需药理学活性的本发明化合物的盐。这类盐包括：与 无机酸或与有机酸形成的酸加成的盐，所述的无机酸诸如盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，磷酸等；所述的有机酸诸如乙酸，丙酸，己酸，环戊丙酸，乙醇酸，丙酮酸，乳酸，丙二酸，琥珀酸，苹果酸，马来酸，富马酸，酒石酸，柠檬酸，苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，甲磺酸，乙磺酸，苯磺酸，萘磺酸，樟脑磺酸，葡庚糖酸，葡糖酸，谷氨酸，羟基萘甲酸，水杨酸，硬脂酸，粘康酸等；或在母体化合物上存在的酸性质子被金属离子，例如碱金属离子或碱土金属离子取代时形成的盐；或与有机碱形成的配位化合物，所述的有机碱诸如乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺，N-甲基葡糖胺等。
本发明中使用的术语“溶剂化物”意指本发明化合物与制药上可接受的溶剂结合形成的物质。制药上可接受的溶剂包括水，乙醇，乙酸等。溶剂化物包括化学计算量的溶剂合物和非化学计算量的溶剂合物，优选为水合物。本发明的化合物可以用水或各种有机溶剂结晶或重结晶，在这种情况下，可能形成各种溶剂化物。
本发明的药物组合物包括有效剂量的本发明式式I化合物或其异构体、药学上可接受的盐或水合物和一种或多种适宜的药学上可接受的载体。这里的药用载体包括但不限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白如人血白蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘油，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜂蜡，羊毛脂。
本发明化合物的药物组合物可以以下面的任意方式施用：口服，喷雾吸入，直肠用药，鼻腔用药，颊部用药，局部用药，非肠道用药，如皮下，静脉，肌内，腹膜内，鞘内，心室内，胸骨内和颅内注射或输入，或借助一种外植储器用药。其中优选口服、腹膜内或静脉内给药方式。
当口服用药时，本发明化合物可制成任意口服可接受的制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊、水溶液或水悬浮液。其中，片剂使用的载体一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬脂酸镁。胶囊制剂使用的稀释剂一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。水悬浮液制剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用。如果需要，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。
当局部用药时，特别是治疗局部外敷容易达到的患面或器官，如眼睛、皮肤或下肠道神经性疾病时，可根据不同的患面或器官将本发明化合物制成不同的局部用药制剂形式，具体说明如下：
当眼部局部施用时，本发明化合物可配制成一种微粉化悬浮液或溶液的制剂形式，所使用载体为等渗的一定pH的无菌盐水，其中可加入也可不加防腐剂如氯化苄基烷醇盐。对于眼用，也可将化合物制成膏剂形式如凡士林膏。
当皮肤局部施用时，本发明化合物可制成适当的软膏、洗剂或霜剂制剂形式，其中将活性成分悬浮或溶解于一种或多种载体中。软膏制剂可使用的载体包括但不限于：矿物油，液体凡士林，白凡士林，丙二醇，聚氧化乙烯，聚氧化丙烯，乳化蜡和水；洗剂或霜剂可使用的载体包括但不限于：矿物油，脱水山梨糖醇单硬脂酸酯，吐温60，十六烷酯蜡，十六碳烯芳醇，2-辛基十二烷醇，苄醇和水。
本发明化合物还可以无菌注射制剂形式用药，包括无菌注射水或油悬浮液或无菌注射溶液。其中，可使用的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。
具体实施方式
下面的具体实施例是本发明的优选实施方案，其不应理解为对本发明构成任何限制。
化合物的熔点由RY-1熔点仪测定，温度计未较正。质谱由Micromass ZabSpec高分辨率质谱仪(分辨率1000)测定。1H NMR由JNM-ECA-400超导NMR仪测定，工作频率1H NMR 400MHz，13C NMR 100MHz。
实施例
实施例1 1-[3-(叔丁基)-1-(对甲基苯基)-1H-吡唑-5-基]-3-{2-[(5-羟基-5，6，7，8-四氢萘-2-基)氧基]苄基}脲
在250mL茄型瓶中加入100mL乙醇，(30mmol)特戊酰基乙腈，(33.63mmol)4-甲基苯肼，搅拌下滴加3.6mL浓盐酸，加热回流8小时，冷却，浓缩，残余物用稀氢氧化钠调pH 10-11，用乙酸乙酯提取三次，无水硫酸钠干燥，浓缩，得到的固体用乙酸乙酯/石油醚重结晶得到白色晶体C，收率80.3％。5-叔丁基-2-对甲基苯基-3-氨基吡唑(3.5mmolC)置于100ml三颈瓶中，以30ml四氢呋喃溶解，将三颈瓶置于低温槽降温至-20℃，搅拌下分批加入2.9g碳酸氢钠，15min后，逐滴滴加氯甲酸三氯乙酯(3.5mmol)，控制溶液温度不超过0℃，滴加完毕后，继续搅拌30min，然后升温至0℃反应12h.反应完毕，混合物过滤，滤渣用乙酸乙酯冲洗，滤液浓缩，收率85％。
在500ml三口瓶中加入16.2g(100mmol)6-羟基1，2，3，4四氢萘酮，200ml DMSO溶解，41.4g碳酸钾(300mmol)，升温90℃，滴加邻氰基氟苯13.3g(110mmol)入反应，反应2小时，反应液倒入冰水中，析出淡黄色固体，抽滤干燥，产率80％。在100ml三口瓶中加入40ml无水四氢呋喃，加入1.14g氢化铝锂室温搅拌10分钟，向反应液中缓慢加入2-[(5，6，7，8四氢萘酮-2基)氧基]苯腈2.63g，升温65℃，回流反应1小时，反应毕，混合液中加入乙醇至无气泡产生，过滤，浓缩，以柱层析分离产物，产率73％。
在50mL三口瓶中加入20mL二甲亚砜，加入化合物0.5mmol2，2，2-三氯乙基-(3-叔丁基-1-(4-甲基-苯基)-1H-吡唑-5-基)酰胺，再加入中间体K 0.5mmol，滴加0.5ml三乙胺入反应，加热80℃反应1小时。冷却，倒入150ml水中，用乙酸乙酯提取3次，有机层用饱和氯化钠洗涤3次，无水硫酸钠干燥过夜，浓缩，柱层析分离产物N，产率58％。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)
δ：8.25(s，1H)，7.38(m，2H)，7.35(m，2H)，7.11(m，3H)，7.15(m，1H)，6.91(t，1H)，6.86(m，1H)，6.74(m，1H)，6.61(d，1H)，6.24(s，1H)，5.09(d，1H)，4.54(s，1H)，4.28(d，2H)，2.65(m，2H)，2.37(s，3H)，1.87(m，2H)，1.63(m，2H)，1.29(s，9H).13C NMR(100MHz，DMSOe d6)，δ：160.90(1C，pyrazole)，155.98(1C，CO)，154.86(1C，pyrazole)，154.46，138.95，138.25，137.01，136.74，135.88，131.25，130.68，130.09，129.34，128.92，124.71，124.12，119.16，117.60，115.96(18C，Ar-C)，95.77(1C，pyrazole)，66.41(1C，HO-C)，38.25(1C，N-CH2)，32.67(1C，CH2)，32.34(1C，C)，30.61(3C，CH3)，29.15(1C，CH2)，20.91(1C，Ar-CH3)，19.00(1C，CH2).ESI-MS(+Q，m/z)：525[M+H]+，547 [M+Na]+.
实施例2 1-[3-(叔丁基)-1-(对硝基苯基)-1H-吡唑-5-基]-3-{2-[(5-羟基-5，6，7，8-四氢萘-2-基)氧基]苄基}脲
采用实施例1的方法，将其中的对甲基苯肼改为对硝基苯肼，得白色固体。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)
δ：8.59(s，1H)，8.33(d，2H)，7.83(d，2H)，7.38(d，1H)，7.25(m，2H)，7.09(t，1H)，6.96(t，1H)，6.81(d，1H)，6.74(m，1H)，6.61(d，1H)，6.33(s，1H)，5.08(d，1H)，4.53(s，1H)，4.24(d，2H)，2.64(m，2H)，1.87(m，2H)，1.63(m，2H)，1.27(s，9H).13C NMR(100MHz，DMSOe d6)，δ：162.87(1C，pyrazole)，155.92(1C，CO)，155.10(1C，pyrazole)，154.42，145.32，144.75，139.07，138.95，135.90，131.17，130.68，129.23，128.92，125.28，124.02，123.58，119.14，117.60，115.98(18C，Ar-C)，99.10(1C，pyrazole)，66.40(1C，HO-C)，38.65(1C，N-CH2)，32.83(1C，CH2)，32.70(1C，C)，30.45(3C，CH3)，29.52(1C，CH2)，19.39(1C，CH2).ESI-MS(+Q，m/z)：556[M+H]+，578[M+Na]+.
实施例3 1-[3-(叔丁基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基]-3-{2-[(5-羟基-5，6，7，8-四氢萘-2-基)氧基]苄基}脲
采用实施例1的方法，将其中的对甲基苯肼改为苯肼盐酸盐，得白色固体。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)
δ：8.31(s，1H)，7.49(m，4H)，7.39(m，2H)，7.26(m，2H)，7.11(m，1H)，6.92(t，1H)，6.83(d，1H)，6.72(m，1H)，6.61(d，1H)，6.26(s，1H)，5.08(d，1H)，4.53(s，1H)，4.24(d，2H)，2.64(m，2H)，1.87(m，2H)，1.67(m，2H)，1.25(s，9H).13C NMR(100MHz，DMSOe d6)，δ：160.70(1C，pyrazole)，155.49(1C，CO)，154.48(1C，pyrazole)，153.93，138.75，138.48，137.78，135.39，130.78，130.21，129.20，128.80，128.43，127.06，124.16，123.69，118.71，117.11，115.47(18C，Ar-C)，95.65(1C，pyrazole)，65.92(1C，HO-C)，38.10(1C，N-CH2)，32.36(1C，CH2)，32.04(1C，C)，30.23(3C，CH3)，29.03(1C，CH2)，18.90(1C，CH2).ESI-MS(+Q，m/z)：511[M+H]+，533[M+Na]+.
实施例4 1-[3-(叔丁基)-1-(对硝基苯基)-1H-吡唑-5-基]-3-{5-氟-2-[(5-羟基-5，6，7，8-四氢萘-2-基)氧基]苄基}脲
采用实施例1的方法，将其中的对甲基苯肼改为对硝基苯肼盐酸盐，2-氰基氟苯改为2-氰基-4-氟氟苯，得白色固体。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)
δ：8.59(s，1H)，8.33(d，2H)，7.83(d，2H)，7.38(d，1H)，7.25(m，1H)，7.09(t，1H)，6.96(t，1H)，6.81(d，1H)，6.72(m，1H)，6.61(d，1H)，6.31(s，1H)，5.05(d，1H)，4.53(s，1H)，4.23(d，2H)，2.64(m，2H)，1.86(m，2H)，1.63(m，2H)，1.25(s，9H).13C NMR(100MHz，DMSOe d6)，δ：162.38(1C，pyrazole)，159.57(1C，CO)，157.19(1C，pyrazole)，155.78，154.81，149.45，144.87，144.30，138.52，138.37，135.30，133.75，130.25，124.75，123.02，121.03，116.48，114.88，114.55(18C，Ar-C)，99.35(1C，pyrazole)，65.89(1C，HO-C)，37.97(1C，N-CH2)，32.36(1C，CH2)，32.23(1C，C)，29.96(3C，CH3)，29.05(1C，CH2)，18.90(1C，CH2).ESI-MS(+Q，m/z)：574[M+H]+，596[M+Na]+.
实施例5 1-[3-(叔丁基)-1-(对甲基苯基)-1H-吡唑-5-基]-3-{5-氟-2-[(5-羟基-5，6，7，8-四氢萘-2-基)氧基]苄基}脲
采用实施例1的方法，将其中的2-氰基氟苯改为2-氰基-4-氟氟苯，得白色固体。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)
δ：8.29(s，1H)，7.37(d，2H)，7.35(d，2H)，7.11(m，2H)，6.95(t，1H)，6.86(m，1H)，6.98(m，1H)，6.70(m，1H)，6.58(d，1H)，6.23(s，1H)，5.07(d，2H)，4.52(s，1H)，4.18(d，2H)，2.61(m，2H)，2.35(s，3H)，1.84(m，2H)，1.63(m，2H)，1.21(s，9H).13C NMR(100MHz，DMSOe d6)，δ：160.43(1C，pyrazole)，159.61(1C，CO)，157.23(1C，pyrazole)，155.80，154.56，149.57，138.52，137.55，136.54，136.33，135.32，133.81，130.25，129.58，124.11，121.04，116.54，114.91，114.59(18C，Ar-C)，95.77(1C，pyrazole)，65.91(1C，HO-C)，37.95(1C，N-CH2)，32.37(1C，CH2)，32.04(1C，C)，30.27(3C，CH3)，29.05(1C，CH2)，20.65(1C，Ar-CH3)，18.90(1C，CH2).ESI-MS(+Q，m/z)：543[M+H]+，565[M+Na]+.
实施例6 1-{2-[(5-羟基-5，6，7，8-四氢萘-2-基)氧基]苄基}-3-(3-异丙基苯基)脲
采用实施例1的方法，将其中的对甲基苯肼改为3-异丙基苯胺，得白色固体。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)
δ：8.57(s，1H)，7.37(d，2H)，7.26(m，2H)，7.12(m，3H)，6.85(d，1H)，6.76(m，2H)，6.66(d，1H)，6.48(t，1H)，5.10(d，1H)，4.53(s，1H)，4.28(d，2H)，2.81(m，1 H)，2.64(m，2H)，1.86(m，2H)，1.63(m，2H)，1.15(d，6H).13C NMR(100MHz，DMSOe d6)，δ：155.56(1C，CO)，155.29，154.03，148.94，140.48，138.55，135.46，131.19，130.24，128.88，128.61，128.40，123.73，119.29，118.74，117.17，115.70，115.51，115.36(18C，Ar-C)，65.99(1C，HO-C)，38.02(1C，N-CH2)，33.61(1C，CH2)，32.43(1C，C)，29.09(1C，CH2)，23.94(2C，CH3)，18.95(1C，CH2).ESI-MS(+Q，m/z)：431[M+H]+，453[M+Na]+.
实施例7 1-(4-氯-3-三氟甲基苯基)-3-{2-[(5-羟基-5，6，7，8-四氢萘-2-基)氧基]苄基}脲
采用实施例1的方法，将其中的对甲基苯肼改为3-三氟甲基-4-氯苯胺，得白色固体。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)
δ：9.15(s，1H)，8.07(d，2H)，7.56(m，2H)，7.38(m，2H)，7.25(m，1H)，7.13(m，1H)，6.86(m，1H)，6.76(m，2H)，6.65(d，2H)，5.10(d，1H)，4.53(s，1H)，4.31(d，2H)，2.68(m，2H)，1.86(m，2H)，1.63(m，2H).13CN MR(100MHz，DMSOed6)，δ：155.49(1C，CO)，154.92，153.97，140.08，138.48，135.39，131.87，130.78，130.23，128.80，128.45，123.70，122.31，121.55，118.73，117.11，116.17，116.11，115.47(18C，Ar-C)，65.92(1C，HO-C)，38.05( 1C，N-CH2)，32.36(1C，CH2)，29.25(1C，CH2)，18.90(1C，CH2).ESI-MS(+Q，m/z)：491[M+H]+，513[M+Na]+.
实施例8 1-[3-(叔丁基)-1-对甲基苯基-5-基]-3-[2-(喹啉-6-氧基)苄基]脲
采用实施例1的方法，将其中的6-羟基1，2，3，4四氢萘酮改为6羟基喹啉得白色固体。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)
δ：8.82(m，1H)，8.25(s，1H)，8.22(s，1H)，8.05(d，1H)，7.49(m，2H)，7.33(m，4H)，7.24(m，4H)，7.02(d，1H)，6.93(t，1H)，6.20(d，1H)，4.28(d，2H)，2.35(s，3H)，1.20(s，9H).ESI-MS(+Q，m/z)：506[M+H]+，528[M+Na]+.
实施例9 1-[3-(叔丁基)-1-苯基-5-基]-3-[2-(喹啉-6-氧基)苄基]脲
采用实施例1的方法，将其中的对甲基苯肼改为苯肼盐酸盐，将其中的6-羟基1，2，3，4四氢萘酮改为6羟基喹啉得白色固体。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)
δ：8.81(m，1H)，8.28(s，1H)，8.23(d，1H)，8.04(d，1H)，7.50(m，6H)，7.33(m，3H)，7.26(m，2H)，7.01(d，1H)，6.94(t，1H)，6.21(d，1H)，4.26(d，2H)，1.20(s，9H).ESI-MS(+Q，m/z)：492[M+H]+，514[M+Na]+.
实施例10 1-[3-(叔丁基)-1-对硝基苯基-5-基]-3-[2-(喹啉-6-氧基)苄基]脲
采用实施例1的方法，将其中的对甲基苯肼改为对硝基苯肼盐酸盐，将其中的6-羟基1，2，3，4四氢萘酮改为6羟基喹啉，得白色固体。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)
δ：8.81(m，1H)，8.55(s，1H)，8.28(d，2H)，8.24(d，1H)，8.05(d，1H)，7.81(d，2H)，7.49(m，2H)，7.37(m，2H)，7.27(d，1H)，7.20(t，1H)，7.00(m，2H)，6.27(s，1H)，4.26(d，2H)，1.20(s，9H).ESI-MS(+Q，m/z)：537[M+H]+，559[M+Na]+.
实施例11 1-[3-(叔丁基)-1-对硝基苯基-5-基]-3-[5-氟-2-(喹啉-6-氧基)苄基]脲
采用实施例1的方法，将其中的对甲基苯肼改为对硝基苯肼盐酸盐，2-氰基氟苯改为2-氰基-4-氟氟苯，将其中的6-羟基1，2，3，4四氢萘酮改为6羟基喹啉，得白色固体。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)
δ：8.81(m，1H)，8.62(s，1H)，8.32(d，2H)，8.24(d，1H)，8.03(d，1H)，7.81(d，2H)，7.48(m，2H)，7.37(m，2H)，7.20(t，1H)，7.00(m，2H)，6.27(s，1H)，4.22(d，2H)，1.26(s，9H).ESI-MS(+Q，m/z)：555[M+H]+，577[M+Na]+.
实施例12 1-[3-(叔丁基)-1-苯基-5-基]-3-[5-氟-2-(喹啉-6-氧基)苄基]脲
采用实施例1的方法，将其中的对甲基苯肼改为苯肼盐酸盐，2-氰基氟苯改为2-氰基-4-氟氟苯，将其中的6-羟基1，2，3，4四氢萘酮改为6羟基喹啉，得白色固体。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)
δ：8.80(m，1H)，8.32(s，1H)，8.22(d，1H)，8.04(d，1H)，7.48(m，6H)，7.45(m ，1H)，7.22(m，4H)，6.98(t，1H)，6.21(s，1H)，4.22(d，2H)，1.24(s，9H).ESI-MS(+Q，m/z)：510[M+H]+，532[M+Na]+.
实施例13 1-[3-(叔丁基)-1-对甲基苯基-5-基]-3-[5-氟-2-(喹啉-6-氧基)苄基]脲
采用实施例1的方法，将其中的2-氰基氟苯改为2-氰基-4-氟氟苯，将其中的6-羟基1，2，3，4四氢萘酮改为6羟基喹啉，得白色固体。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)
δ：8.80(m，1H)，8.26(s，1H)，8.22(d，1H)，8.03(d，1H)，7.50(m，2H)，7.34(d，2H)，7.24(m，3H)，7.13(m，3H)，6.97(t，1H)，6.19(s.1H)，4.22(d，2H)，2.34(s，3H)，1.24(s，9H).ESI-MS(+Q，m/z)：524[M+H]+，546[M+Na]+.
实施例14 采用GFP-MAPKAPk2_BHK细胞模型筛选p38-MAPK抑制剂
实验材料与方法
仪器：IN Cell Analyzer 1000活细胞成像系统(美国GE公司)
细胞株：表达GFP-MAPKAPk2融合蛋白的BHK细胞株(美国GE公司)
细胞培养液：含1mg/ml G418和10％FBS的F12培养液
分析培养液：含10mM HEPES、0.2％BSA的F12培养液
固定液：12％甲醛溶液(PBS配，3×)
染色液：含1μM Hoechst 33342(美国Invitrogen公司)的PBS
化合物的配制：
激动剂Anisomycin用DMSO配成10mM母液，用分析培养液配成300nM工作液。
化合物用DMSO配成30mM母液，用激动剂即300nM Anisomycin配成1×工作液，初筛选用0.3μM、3μM和10μM三个终浓度，复筛根据化合物活性按梯度分别选用终浓度0.1nM、0.3nM、1nM、3nM、10nM、30nM、0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、10μM中的连续七个浓度做量效关系。阳性化合物MOL-p38-001选用终浓度0.3μM和3μM作为对照，在复筛时同时做量效关系。
以含终浓度0.3‰DMSO的分析培养液作为Control对照，以含终浓度0.3‰DMSO的300nM Anisomycin作为激动剂对照。
实验步骤：
将稳定表达GFP-MAPKAPk2融合蛋白的BHK细胞，37℃5％CO2培养于含1mg/ml G418和10％FBS的F12培养液中。按照细胞2.0×104个/100μl/孔种于96孔黑色底透细胞培养板中，37℃5％CO2培养18-24h。配制激动剂和化合物工作液。细胞用100μl/孔分析培养液洗一次，加入100μl/孔化合物工作液，实验设Control对照和激动剂对照，化合物每个浓度平行重复3孔。细胞37℃5％CO2孵育90min，加入室温预暖的3×固定液50μl/孔混匀，室温孵育20min。细胞用染色液200μl/孔洗三次，并留在200μl/孔染色液中室温染色1hr。细胞在IN Cell Analyzer 1000活细胞成像系统上进行测定。测定条件为：20倍物镜，激发波长Ex＝460nm，发射波长Em＝535nm，曝光300ms检测细胞核通道蓝色荧光；激发波长Ex＝475nm，发射波长Em＝535nm，曝光1000ms检测细胞质通道绿色荧光GFP，每孔5个视野连续拍照。使用GE公司IN Cell Analyzer 1000Nuclear Trafficking Analysis Module软件分析细胞核转位，计算化合物抑制核转位的活性。
化合物抑制率(％)＝(化合物处理细胞核转位-激动剂处理细胞核转位)/(Control对照处理细胞核转位-激动剂处理细胞核转位)×100％
实施例15 在脂多糖诱导的外周血单核细胞TNF-α检测实验中进行药物筛选
新鲜血液收集和PBMC分离
1.采血员联系志愿者，采集足够新鲜血液储存于肝素钠采血管中。
2.转移DPBS对比稀释的血液至加有15ml Lymphoprep分离液的SepMate分离管中，
3.常温1200g离心30分钟，无刹车停止离心。
4.吸出白膜层(包含PBMC)，DPBS洗两次。
5.用含10％小牛血清的1640培养基重悬PBMC，细胞计数。
LPS诱导的TNF-α释放实验
1.PBMC铺板每孔8万个细胞，按计划加稀释过的化合物，37度细胞培养箱内培养一小时。
2.加LPS刺激细胞。终浓度为10ng/ml。37度细胞培养箱孵育过夜。
3.离心取上清，按照TNF-αELISA试剂盒步骤检测细胞上清中的TNF-α含量。
4.FlexStation3读取吸光度，导出数据进行统计计算IC50。
实施例40 药物对p38α酶的抑制实验筛选化合物
1.准备浓度为500ng/ml的p38α缓冲液。
2.利用浓度为500ng/ml激酶缓冲溶液连续2倍稀释，稀释16个点。
3.取5uL稀释过的p38α缓冲溶液加入384孔板中。
4.准备0.8uM GFP-ATF2和180uM ATP混合溶液1ml。
5.在每个空中加入5uL的GFP-ATF2和ATP混合溶液，出发反应。
6.密封室温培养1小时。
7.准备ATF-2抗体1ml。
8.向每个孔中加入10ul的抗体，混合均匀。
9.密封，室温培养30分钟。
10.在仪器上读取TR-FRET信号。
11.加入2ul化合物0.5％DMSO溶液，每个孔3倍稀释，11个浓度，2次重复(3333，1111，370，123，41，13.7，4.57，1.52，0.51，0.17，0.056)。
12.加入4uL p38α到每个孔中。
13.室温培养15分钟。
14.加入4uL GFP-ATF2和ATP混合溶液，激发反应。
15.室温培养1小时。
16.每个孔加入10uL抗体。
17.室温培养30分钟。
18.仪器上读取TR-FRET信号，计算IC50值。
实施例41 化合物对p38α/β/γ/δ酶的选择性抑制实验
1.准备浓度为500ng/ml的p38α/β/γ/δ缓冲液。
2.利用浓度为500ng/ml激酶缓冲溶液连续2倍稀释，稀释16个点。
3.取5uL稀释过的p38α缓冲溶液加入384孔板中。
4.准备0.8uM GFP-ATF2和180uM ATP混合溶液1ml。
5.在每个空中加入5uL的GFP-ATF2和ATP混合溶液，出发反应。
6.密封室温培养1小时。
7.准备ATF-2抗体1ml。
8.向每个孔中加入10ul的抗体，混合均匀。
9.密封，室温培养30分钟。
10.在仪器上读取TR-FRET信号。
11.加入2ul化合物0.5％DMSO溶液，每个孔3倍稀释，11个浓度，2次重复(3333，1111，370，123，41，13.7，4.57，1.52，0.51，0.17，0.056)。
12.加入4uL p38α到每个孔中。
13.室温培养15分钟。
14.加入4uL GFP-ATF2和ATP混合溶液，激发反应。
15.室温培养1小时。
16.每个孔加入10uL抗体。
17.室温培养30分钟。
18.仪器上读取TR-FRET信号，计算IC50值。