靶向HER2的人源化改造的非内化单链抗体P2h2及应用的制作方法

本发明属于抗肿瘤技术领域，涉及一种抗人HER2单链抗体，特别涉及一种经人源化改造的非内化抗人HER2单链抗体，包括其氨基酸序列和核苷酸序列以及抗体制备方法和其对HER2阳性肿瘤细胞的诊治用途。

背景技术：

HER2(human epidermal growth factor receptor-2，ErbB2/P185)是人表皮生长因子受体(EGFR)家族的第二个成员，由原癌基因erbB2/Her2编码，编码基因定位于人染色体17q21，分子量为185kDa，是一种酪氨酸激酶受体膜糖蛋白。HER2通过与HER1,HER3或HER4形成异二聚体，导致下游MAPK和PI3K等信号通路活化，过度传导生长信号从而导致细胞恶性增殖。在人类多种肿瘤中，包括25-30％乳腺癌、35-45％胰腺癌及90％的结肠直肠癌、16-57％的非小细胞肺癌、9-38％的胃癌等都发现有HER2原癌基因扩增或者蛋白过表达现象，临床上称为HER2阳性肿瘤，主要表现为肿瘤恶性程度高，易进展及转移，对放化疗不敏感，易复发，患者生存期短。

1975年，Kohler与Milstein发明了用来制备单克隆抗体(Monoclonal antibody，mAb)的杂交瘤技术，之后单抗药物迅速发展并应用于临床。近年来，靶向HER2的抗体药物也已经成为HER2阳性肿瘤治疗新热点。曲妥珠单抗(赫塞汀，英文名Trastuzumab/Herceptin)是Genetech公司开发的抗HER2人源化单克隆抗体药物，美国FDA于1998年批准上市，目前曲妥珠单抗联合化疗药物(紫杉醇等)已经成为HER2过表达晚期转移性乳腺癌和晚期胃癌的一线治疗方案，在HER2阳性转移性乳腺癌的治疗中，临床有效率可达38％，欧洲EMEA已经批准Trastuzumab联合化疗药物作为治疗HER2阳性进展期胃癌的一线治疗方案。

尽管Trastuzumab的临床应用取得了令人鼓舞的结果，但仍有大量病人对治疗无反应，或治疗后复发。有研究报道鼠源性单抗应用于人类有较强的免疫原性，可引起机体免疫系统对该异种蛋白的免疫排斥反应，产生人抗鼠抗体(Human anti-mouse antibody，HAMA)反应，重复使用时甚至可导致病人严重的过敏性休克。而且由于HAMA的存在，鼠单抗在人体内会很快得到清除，半衰期很短，因此限制了其临床应用。Trastuzumab为人鼠嵌合抗体，但其可变区部分为鼠源性，会引发人体产生HAMA，有转移性乳腺癌长期应用Trastuzumab治疗的研究报告指出大约有25％的病人出现过心脏毒性；临床Ⅲ期试验结果表明，HER2阳性乳腺癌病人只有大约1/3对Trastuzumab单剂治疗有确切的疗效；在临床，即使联合化疗，大多数病人在使用Trastuzumab治疗一年内就会产生耐药。

随着对各类抗体结构和功能之间关系的深入了解，利用抗体工程技术对抗体结构进行改造，将动物来源的单克隆抗体人源化(Monoclonal humanization)，以降低这些单抗反复应用于人体后产生的免疫原性使之用于人类疾病的治疗，是目前研究的一个热点。抗体人源化改造的主要策略有以下几种：

1.嵌合抗体

抗体的恒定区是抗体分子结构中免疫原性最强的部位，运用基因工程技术将鼠单抗可变区与人抗体的恒定区相拼接，即成为鼠单抗人源化的最简单形式人/鼠嵌合抗体(chimeric antiboay)。嵌合抗体大大降低了鼠源单抗的免疫原性，同时又保留了鼠单抗的亲和性及特异性。由于嵌合抗体仍保留了原来鼠源抗体约30％左右的鼠源序列，其免疫原性虽有所降低，但仍可引起不同程度的HAMA反应。

2.互补决定区(complementary determining region，CDR)移植的人源化抗体

每一抗体分子Fab段的轻、重链可变区各具有3个抗原互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)，它们之间有起结构稳定作用的框架区(framework region，FR)，CDR可直接接触抗原，决定抗体的特异性，FR作为支持CDR的支架其立体构象极为保守。CDR移植抗体是把鼠单抗的互补决定区(CDR)移植到人单抗的骨架区FR构建而成的抗体，经临床试验证明，其免疫原性得到显著降低。

3.人源FR模板的重构

①模板替换，在已有的抗体序列库中搜寻与鼠mAb FR有最大同源性的人源FR用以替换。轻、重链通常来自不同的人抗体，这样可使鼠源CDR和人模板间有更好的同源性。应将鼠FR中与CDR密切相关的氨基酸残基保留在替换的人源FR中。为了保持CDR的空间构象，要特别注意原始抗体CDR下面的堆积残基以及CDR周围的残基。②补偿变换，补偿变换可以认为是模板替换的进一步延伸，在人FR选择上，将与CDR有相互作用、与抗体亲和力有密切关系或对FR空间结构折叠起关键作用的残基进行改变，以补偿完全CDR移植。③定位保留，最简位置模板(minimal positional template)能确认在抗体可变区中哪些位置是保持抗体的抗原结合结构域完整性所必需的，在选择用于人源化的人FR时，首先从现有的人源抗体保守序列中搜寻与鼠FR最相似的序列；其次根据最简位置模板确定鼠可变区的关键位置残基；最后保留所有这些位置而将其余部分人源化。

4.表面重塑

将非人源单抗可变区(Fv)表面非人源的氨基酸残基替换为人源性的氨基酸残基,使非人源抗体Fv区的表面人源化，降低其免疫原性，同时不影响Fv区的整体空间构象，从而保留其抗原结合部位的结构。

5.抗原表位定向选择(epitope-guided selection)

将鼠抗体的轻链或重链文库与人抗体的重链或轻链文库配对，构建成“人一鼠杂合抗体库”，筛选与抗原结合的克隆，分离获得人抗体的重链或轻链基因，再将它们与人的轻链或重链文库混合，用抗原筛选，就能得到与抗原结合的特异性人抗体。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种靶向HER2的人源化改造的非内化单链抗体P2h2及应用。

本发明公开的一种靶向HER2的人源化改造的非内化单链抗体P2h2，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

编码上述靶向HER2的人源化改造的非内化单链抗体P2h2的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

本发明还公开了上述靶向HER2的人源化改造的非内化单链抗体P2h2在制备抗肿瘤药物和/或保健品中的应用，以及靶向HER2的人源化改造的非内化单链抗体P2h2在制备HER2阳性肿瘤诊断试剂中的应用。

所述的药物和/或保健品为抗HER2阳性肿瘤细胞的药物和/或保健品。

所述HER2阳性肿瘤细胞为乳腺癌细胞、胃癌细胞、非小细胞肺癌细胞或卵巢癌细胞等。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1、本发明首次对鼠源性抗人HER2单链抗体e23sFv进行了人源化改造，e23是HER2分子胞外段免疫小鼠后制备的杂交瘤中亲和力及抑制肿瘤效率最好的克隆，对e23的单链抗体形式e23sFv的人源化改造尚属首次。

2、将与e23sFv的VL、VH同源性最高的人源抗体共有序列FR与e23sFv的FR进行替换，同时挑选对抗体构象起重要作用的13个FR位点，突变为原来e23sFv的氨基酸残基，以最大限度保证单链抗体构象的正确折叠。

3、构建库容量为2¹³的突变体单链抗体库，利用噬菌体展示技术筛选出对HER2亲和力高的人源化单链抗体株P2h2，保证经过人源化改造的单链抗体能够具有较高的亲和力。

4、利用多种实验手段从分子到细胞水平验证经人源化改造的P2h2对HER2分子的亲和活性及是否具有内化活性，比较其与鼠源单链抗体e23sFv免疫原性的大小，确保最后筛选的分子具有较高的亲和活性及较低的免疫原性，为进一步研发靶向HER2的抗肿瘤诊疗新策略奠定基础。

附图说明

图1为完全人源化单链抗体hue23sFv氨基酸序列构建流程框图；

图2为人源化单链抗体突变体的突变引物序列结果；

图3为多位点突变PCR凝胶电泳结果图；

图4为人源化单链抗体噬菌体抗体库的构建及4轮淘选结果图；

图5为Phage ELISA筛选亲和力最高的单链抗体株结果；

图6为4株人源化单链抗体的原核表达及纯化结果；

图7为SPR测定人源化单链抗体对重组人HER2分子亲和常数；

其中(a)为e23sFv对重组人HER2分子的亲和常数KD 4.512*10^-8M；(b)为P2h2对重组人HER2分子的亲和常数KD1.559*10^-9M；(c)为e23sFv、P1h2、P1h3、P2h2、P2h5对重组人HER2分子的结合解离能力分布。

图8为ELISA测定人源化单链抗体对重组人HER2分子的亲和活性；

图9为流式细胞术检测人源化单链抗体对HER2阳性肿瘤细胞结合的特异性；

图10为激光共聚焦显微镜检测人源化单链抗体内化进入HER2阳性肿瘤细胞活性；

其中，(a)为e23sFv、P2h2内化进入HER2阳性乳腺癌细胞BT-474；(b)为e23sFv、P2h2内化进入HER2阳性卵巢癌细胞SKOV-3；(c)为e23sFv、P2h2不能内化进入HER2阴性乳腺癌细胞MCF-7。

图11为ELISPOT检测人源化单链抗体的刺激人PBMC产生IFN-γ的水平；

图12为人外周血多细胞因子检测评价人源化单链抗体免疫原性结果；

其中，(a)为e23sFv、P1h2、P1h3、P2h2、P2h5刺激健康人PBMC分泌TNF-α的水平；(b)为e23sFv、P1h2、P1h3、P2h2、P2h5刺激健康人PBMC分泌IFN-γ的水平；(c)为e23sFv、P1h2、P1h3、P2h2、P2h5刺激健康人PBMC分泌IL-10的水平；(d)为e23sFv、P1h2、P1h3、P2h2、P2h5刺激健康人PBMC分泌IL-2的水平；(e)为e23sFv、P1h2、P1h3、P2h2、P2h5刺激健康人PBMC分泌IL-4的水平；(f)为e23sFv、P1h2、P1h3、P2h2、P2h5刺激健康人PBMC分泌IL-5的水平；(g)为e23sFv、P1h2、P1h3、P2h2、P2h5刺激健康人PBMC分泌IL-17a的水平；(h)为e23sFv、P1h2、P1h3、P2h2、P2h5刺激健康人PBMC分泌IL-21的水平。

具体实施方案：

一、人源化单链抗体及其突变体噬菌体抗体库的构建

1、人源化单链抗体序列的确定

将e23sFv的轻链可变区进行BLAST，找到与其同源性最高的人源抗体轻链可变区序列，以这种人源抗体轻链可变区所属亚类共有序列(concensus sequence)的框架区(FR)替换e23sFv的FR，构建完全人源化的轻链huVL。对e23sFv的重链进行相同方法的替换，构建完全人源化的重链huVH，并与huVL以Linker连接，构建完全人源化的hue23sFv，如图1所示。

2、人源化单链抗体突变体序列的确定

对hue23sFv的基因序列进行大肠杆菌密码子优化，全基因合成，构建入pUC19载体中。将hue23sFv的FR中对抗体结构起重要作用的13个位点，采用多点突变的方法，分别合成突变引物，突变引物序列如图2所示。利用Multi-site directed mutation kit(Takara)各个突变为原来鼠源的氨基酸残基，构建2¹³个突变体，如图3所示。

3、人源化单链抗体突变体噬菌体抗体库的构建

以Sfi I和Not I为酶切位点，将hue23sFv及突变体酶切连接入pCANTAB5E噬菌体载体，电转化感受态细胞TG1，转移入2*YTAG培养基扩增培养至对数生长期后，加入辅助噬菌体M13K07感染1h，离心弃上清，以2*YTAK重悬，37℃培养过夜，收集上清即为表面展示有单链抗体的噬菌体库，测定其噬菌体滴度为5*10¹¹CFU。

二、高亲和力人源化单链抗体的筛选及鉴定

将人源化单链抗体的噬菌体抗体库与包被有HER2分子的ELISA板37℃共孵育2h，0.05％Tween20PBS洗涤5次，加入对数生长期TG1菌液于37℃缓摇孵育1h，使结合HER2的scFv-噬菌体再感染TGI得以富集。取已感染ScFv-噬菌体的细菌培养物测定滴度,同时以辅助噬菌体M13K07感染后制备次级ScFv-噬菌体库，再次进行淘选，并逐步增加洗涤次数，共进行四轮淘选，测定每轮淘选输入及输出的噬菌体滴度并计算得率，如图4所示。

对经过四轮筛选后与HER2结合的噬菌体进行ELISA Screening，筛选出20株亲和力较高的噬菌体抗体，其中亲和力最高的4株为P1h2、P1h3、P2h2、P2h5如图5所示，P2h2氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

三、人源化单链抗体的原核表达、纯化及复性

将淘选获得的4株噬菌体单链抗体序列克隆入原表达载体pET28a，1mM IPTG诱导以包涵体形式进行表达，包涵体用6M GuCl变性经Ni-NTA亲和层析纯化，以缓慢透析去除变性剂的方法使蛋白复性从而获得具有活性的单链抗体，SDS-PAGE检测单链抗体纯度达90％以上，如图6所示。

四、表面等离子共振技术(SPR)测定人源化单链抗体对HER2分子的亲和力

利用Biacore T100(GE)测定人源化单链抗体对HER2分子的亲和常数KD。CM5芯片偶联捕获抗体anti human IgG(Fc)，进一步包被重组人HER2蛋白(Fc tag)，分别制备浓度为32nM、16nM、8nM、4nM、2nM的单链抗体作为流动相，单循环动力学模式测定其与HER2分子结合引起响应值(RU)的大小，从而计算e23sFv及人源化单链抗体对HER2亲和力常数。如图7所示,e23sFv的亲和力常数KD 4.512*10^-8M，P2h2的亲和力常数为1.559*10^-9M，P2h2的亲和力常数明显高于e23sFv。

五、ELISA检测人源化单链抗体对细胞表面HER2分子的亲和活性

以HER2阳性肿瘤细胞BT-474铺96孔板，每孔细胞数1*10⁴,37℃培养24h，弃培养上清，4％多聚甲醛室温固定20min，5％脱脂奶粉室温封闭1h，加入3倍倍比稀释人源化单链抗体，最高浓度3uM，4℃孵育过夜，PBST洗6次，加入1:1000稀释的抗His的一抗室温孵育2h，PBST洗6次，加入1:2500稀释的HRP标记的二抗室温孵育1h,PBST洗六次，TMB室温显色10min，终止显色后测定OD450，如图8所示，单链抗体P2h2较鼠源e23sFv更早到达平台期且平台数值更大，提示P2h2对HER2分子亲和活性高于e23sFv。

六、流式细胞术检测人源化单链抗体对HER2阳性肿瘤细胞结合的特异性

荧光素Dylight 488分别标记单链抗体，测定标记效率分别为e23sFv 73.3％,P1h274.6％，P1h372.1％，P2h273.8％，P2h575.2％。将荧光素标记的人源化单链抗体P2h2分别与HER2阳性肿瘤细胞BT-474及SKOV-3共孵育，HER2阴性肿瘤细胞MCF-7作为阴性对照。同时将未标记的e23sFv以两种不同终浓度(125nM,250nM)与荧光素标记的人源化单链抗体P2h2混合后与BT-474及SKOV-3孵育，冰上1h,流式洗液洗涤三次，1000rpm/min离心，500ulPBS重悬，上机检测。如图9所示，P2h2能与BT-474及SKOV-3表面HER2分子结合其对HER2的结合作用能够被不同浓度的e23sFv阻断，且阻断作用呈现剂量依赖的特点，提示P2h2结合HER2分子的表位较亲本e23sFv并未发生明显变化。

七、激光共聚焦显微镜检测人源化单链抗体对HER2阳性肿瘤细胞的内化活性

制备HER2阳性肿瘤细胞BT-474及SKOV-3的细胞爬片，与荧光素标记的单链抗体在37℃共孵育4h，封片后激光共聚焦显微镜观察各株单链抗体内化进入HER2阳性肿瘤细胞的活性，HER2阴性肿瘤细胞MCF-7作为阴性对照。如图10所示，P2h2孵育的BT-474及SKOV-3胞内未见明显的荧光分布，提示P2h2不能内化进入HER2阳性肿瘤细胞。

八、ELISPOT评价人源化单链抗体免疫原性

采取12例健康人外周血，淋巴细胞分离液分离单个核细胞(PBMC)，分别以3uM e23sFv,P1h2，P1h3,P2h2,P2h5(PBS稀释)于37℃刺激24h，ELISPOT检测PBMC分泌IFN-γ水平。结果提示人源化单链抗体P2h2刺激PBMC产生IFN-γ的阳性细胞频率较亲本e23sFv均有明显减少，差异具有统计学意义，如图11所示。

九、人外周血多种细胞因子检测评价人源化单链抗体免疫原性

采取12例健康人外周血，淋巴细胞分离液分离单个核细胞(PBMC)，分别以3uM e23sFv及人源化单链抗体P1h2、P1h3、P2h2、P2h5于37℃刺激24h，收集细胞培养上清，LEGEND plex试剂盒测定细胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-17a、IL-21、IFN-γ、TNF-α浓度，比较e23sFv与P1h2、P1h3、P2h2、P2h5刺激PBMC细胞因子分泌量的变化。结果提示人源化单链抗体P2h2刺激PBMC产生IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ的水平较亲本e23sFv均有明显减少，提示经过人源化改造后，单链抗体P2h2引发人体产生免疫反应的能力明显下降，差异具有统计学意义，如图12所示。

综上所述，本发明提供一种靶向HER2的人源化非内化单链抗体P2h2，该抗体的获得是将鼠源性单链抗体e23sFv的CDR移植到同源性最高的人抗体共有序列的FR，再选择性地将FR中对维持抗体空间构象的13个重要氨基酸残基突变为e23sFv中的鼠源性氨基酸残基，构建库容量为2¹³单链抗体噬菌体展示库，筛选出1株具有高亲和力的人源化非内化单链抗体P2h2，为在临床诊断和治疗领域的应用打好基础。