本发明涉及生物医药技术领域，更具体的，本发明涉及一种重组抗骨保护素配体(opgl)单克隆抗体。
背景技术：
骨组织提供对身体的支持，并且包括矿物质(包括钙和磷)，胶原蛋白和非胶原蛋白基质，和细胞。活组织在称为沉积的骨形成和称为再吸收的骨分解之间表现出动态平衡。在骨，骨细胞，成骨细胞和破骨细胞中发现的三种类型的细胞都涉及这种平衡。成骨细胞促进骨组织的形成，而破骨细胞与再吸收相关。与骨形成相比，骨基质和矿物质的再吸收或溶解是一个快速而有效的过程，并且能从骨释放大量矿物质。破骨细胞参与骨骼组织正常重塑的调节和激素诱导的再吸收。例如，反应于胞外液中钙离子降低的浓度的甲状旁腺激素的分泌刺激再吸收。相反，再吸收的抑制作用是降钙素的功能。另外，维生素d的代谢物改变骨对甲状旁腺激素和降钙素的反应。
骨保护素配体(opgl)是细胞因子tnf家族的一员，通过与nf-κb(rank，也称作破骨细胞分化和激活受体，或odar)的受体激活剂结合而促进破骨细胞的形成。另一方面，骨保护素(opg)，通过隔离opgl并且阻止opgl与odar缔合而抑制破骨细胞的形成。因此，与odar缔合的opgl的量与骨沉积和再吸收之间的平衡相关。
骨骼成熟之后，骨骼中骨的量反映骨形成和骨再吸收的平衡(或失衡)。在骨成熟之后第四个十年之前骨质达到高峰。在第四和第五个十年之间，平衡转移并且骨再吸收占优势。骨量随着年龄不可避免的减少在女性要比男性开始得早，并且某些女性在绝经期之后显著加快(主要是高加索人和亚洲人血统的那些)。
骨质稀少是与一般骨质低于正常水平的任何降低相关的状况。这样的状况可以由骨合成速度减慢或者骨破坏速度加快或者这两者而发生的一种状况。骨质稀少的一个常见形式是原发性骨质疏松，也称作绝经后和老年骨质疏松。这种骨质疏松形式是随着年龄骨普遍损失的结果，并且经常是伴随骨形成正常速度的骨再吸收加速的结果。在美国，很多白人女性发生有症状的骨质疏松症。骨质疏松和45岁和更年老妇女髋部，股骨，颈和转子间骨折的发生率之间存在直接关系。老年男性在50和70岁之间可能发生有症状的骨质疏松。在某些情况下，骨质疏松可能由opgl提高的水平或活性而产生。因此，能调节破骨细胞生成中opgl的活 性的分子是有用的。
已经鉴定出几种因子，它们对绝经后和老年骨质疏松有作用。它们包括伴随老化和归于钙和其他矿物质降低的肠吸收的不适当钙消耗的激素水平的改变。一些治疗包括激素治疗法或为了延迟该过程的饮食补充。最近，抗吸收剂例如双磷酸盐和选择性雌激素受体修饰剂(serms)用于防止和治疗减少的骨量。因此，将那些治疗与能调节opgl活性的分子结合在治疗某些骨质稀少疾病中是有用的。
技术实现要素：
本发明的申请人经过大量的研究实验，构建了一种具有高亲和力的重组抗opgl单克隆抗体，其比现有的抗opgl抗体具有更高的亲和力，能够更加有效的识别opgl抗原。
具体地，本发明公开了：
1.一种重组抗opgl单克隆抗体，其特征在于，所述抗体包括如seqidno:7所示的重链可变区的第62、105位位点上的氨基酸被取代，和/或如seqidno:8所示的轻链可变区的第92位位点上的氨基酸被取代。
2.根据1所述的重组抗opgl单克隆抗体，其特征在于，所述位点上的氨基酸是被谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸或苏氨酸取代。
3.根据2所述的重组抗opgl单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seqidno:11-16或seqidno:19任一所示，和/或轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:17或seqidno:18所示。
4.根据3所述的重组抗opgl单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seqidno:11-16或seqidno:19任一所示，轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:8；或所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:17或seqidno:18所示，重链可变区的氨基酸序列如seqidno:7所示；或所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seqidno:19所示，轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:8所示；或所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seqidno:19所示，轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:17所示。
5.根据4所述的重组抗opgl单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seqidno:19所示，和轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:17所示。
6.根据1-5任一所述的重组抗opgl单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的重链恒定区的氨基酸序列如seqidno:2所示，轻链恒定区的氨基酸序列如seqidno:4所示。
7.一种制剂，含有上述1-6任一所述的重组抗opgl单克隆抗体和可药用的载体。
8.根据1-6任一所述的重组抗opgl单克隆抗体或7所述制剂在制备治疗骨质稀少疾病的 药物中的用途。
9.根据1-6任一所述的重组抗opgl单克隆抗体或7所述制剂在制备治疗患者中的伴随骨损失的炎症状况的药物中的用途。
10.根据1-6任一所述的重组抗opgl单克隆抗体或7所述制剂在制备治疗患者中的伴随骨损失的自身免疫疾病的药物中的用途。
更具体地，本发明的申请人首先根据中国专利cn02816680.9公开的抗opgl单抗资料及序列，构建了抗opgl抗体αopgl-1的轻、重链可变区，然后通过表达、纯化，最终获得抗opgl抗体αopgl-1。根据图1所示的氨基酸突变位点，采用overlappcr的方式对序列突变的方法对抗体进行构建，其构建、表达、纯化的方法与未突变的αopgl-1相同。所述突变包括αopgl-1重链可变区和/或轻链可变区的下述任何一个或多个氨基酸位点上的氨基酸取代，所述位点为重链可变区第62、105位，轻链可变区第92位氨基酸的位置，取代氨基酸为谷氨酸(e)、赖氨酸(k)、精氨酸(r)、丝氨酸(s)或苏氨酸(t)。
对于本发明，任何合适的表达载体都可以使用，这些载体可以为pcdna3.1(+)，pdr1，pdhff等真核表达载体。
本发明的申请人对上述αopgl-1的突变抗体进行了亲和力检测。实验结果表明，申请人构建的αopgl-1突变抗体的亲和力比现有的抗opgl单抗有了很大的提高，其中重链可变区第62位苏氨酸或丝氨酸取代的突变抗体(h62dt或h62ds)，亲和力提高了2倍以上；重链可变区第105位精氨酸、丝氨酸或谷氨酸取代的突变抗体(h105ir、h105is或h105ie)，亲和力提高4倍以上；针对上述重链可变区和轻链可变区的突变点进行两点或三点的组合突变，亲和力提高了10倍以上，其中h62dt、h105ir和l92yk三点突变，其亲和力提高13倍以上。
本发明提供含有治疗有效量的αopgl-1突变抗体和治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，和药学可接受稀释剂，载体，增溶剂，乳化剂，防腐剂和/或佐剂的药物组合物。在一些实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂选自：骨形态发生因子，转化生长因子-β(tgf-β)，白介素-1(il-1)抑制剂，包括但不限于il-1ra及其衍生物和kinerettm；tnfα抑制剂，包括但不限于可溶性tnfα受体，enbreltm，抗-tnfα抗体，remicadetm和d2e7抗体；甲状旁腺素及其类似物；甲状旁腺素相关蛋白及其类似物；e系列前列腺素；双磷酸盐(例如阿仑特罗和其他)；骨增强矿物例如氟化物和钙；非甾族抗炎药物(nsaids)，包括但不限于cox-2抑制剂，例如celebrextm和vioxxtm；免疫抑制剂，例如甲氨蝶呤或来氟米特，丝氨酸蛋白酶抑制剂，包括但不限于分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(slpi)；il-6抑制剂(包括但不限于抗il-6抗体)，il-8抑制剂(包括但不限于抗il-8抗体)，il-18抑制剂(包括但不限 于il-18结合蛋白和抗il-18抗体)，白介素-1转化酶(ice)调节剂；成纤维细胞生长因子fgf-1至fgf-10和fgf调节剂；paf拮抗剂；角质形成细胞生长因子(kgf)，kgf-相关分子，和kgf调节剂；基质金属蛋白酶(mmp)调节剂；一氧化氮合酶(nos)调节剂，包括但不限于，诱导型nos的调节剂；糖皮质激素受体调节剂；谷氨酸受体调节剂；脂多糖(lps)水平调节剂；和去甲肾上腺素和调节剂及其模拟物。
在一些实施方案中，所述药物组合物可以含有用于改变，保持或保留例如ph，渗透压，粘度，澄清度，颜色，等张性，气味，无菌，稳定性，溶解或释放速度，组合物的吸收或渗透的配方材料。在一些实施方案中，合适的配方材料包括但不限于，氨基酸(例如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(例如抗坏血酸，亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲液(例如硼酸盐，碳酸氢盐，tris-hcl，柠檬酸盐，磷酸盐或其他有机酸)；填充剂(例如甘露糖醇或甘氨酸)；螯合剂(例如乙二胺四乙酸(edta))；络合剂(例如咖啡因，聚乙烯吡咯烷酮，β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填料；单糖；二糖；和其他碳水化合物(例如葡萄糖，甘露糖或糊精)；蛋白质(例如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白)；着色剂，矫味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐抗衡离子(例如钠)；防腐剂(例如苯扎氯铵，苯甲酸，水杨酸，硫汞撒，苯乙醇，羟苯甲酸甲酯，羟苯甲酸丙酯，氯己定，山梨酸或过氧化氢)；溶剂(例如甘油，丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(例如甘露糖醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或湿润剂(例如普流罗尼类，peg，脱水山梨糖醇酯，polysorbates，如polysorbate20，polysorbate80，triton，tromethamine，卵磷脂，胆甾醇，四丁酚醛)，稳定增强剂(例如蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(例如碱金属卤化物，优选氯化钠或氯化钾，甘露糖醇，山梨糖醇)；送递赋形剂；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂(remington’spharmaceuticalscience，18版，a.r.gennaro编著，mackpublishcompany(1990))。
在本发明的一些实施方案中，提供了治疗骨质稀少疾病的方法，包括施用药学有效量的抗体或药物组合物。在一些实施方案中，提供了治疗患者中的伴随骨损失的炎症状况的方法，包括施用抗体或药物组合物。在一些实施方案中，提供了治疗患者中的伴随骨损失的自身免疫疾病的方法，包括施用抗体或药物组合物。
附图说明
图1.αopgl-1抗体重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列(图中框线的地方表示构建的突变体的突变位点)。
具体实施方式
以下实施例仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括sambrook,j.,fritsch,e.f.andmaniais，t.(1989)molecularcloning：alaboratorymanual，2ndedition，coldspringharborlaboratorypress.
实施例1.人抗体轻、重链恒定区基因的克隆
用淋巴细胞分离液(购自鼎国生物技术发展公司)分离健康人淋巴细胞，用trizol试剂(invitrogen公司)提取总rna，根据文献(clonedhumanandmousekappaimmunoglobulinconstantandjregiongenesconservehomologyinfunctionalsegments.hieterpa,maxee,seidmanjg,maizeljvjr,lederp.cell.1980nov；22(1pt1):197-207.)和文献(thenucleotidesequenceofahumanimmunoglobulincgammalgene.ellisonjw,bersonbj,hoodle.nucleicacidsres.1982jul10；10(13):4071-9.)报道的序列分别设计引物采用rt-pcr反应扩增抗体重链恒定区和轻链恒定区基因。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pgem-t载体(购自promega公司)中，测序验证后确认获得了正确的克隆，其中，seqidno：1和seqidno：2分别显示了重链恒定区(ch)的核苷酸序列和氨基酸序列，seqidno：3和seqidno：4分别显示了轻链恒定区(cl)的核苷酸序列和氨基酸序列。将本例中的重链恒定区的正确克隆记作pgem-t/ch，轻链恒定区的正确克隆记作pgem-t/cl。
实施例2.抗opgl抗体αopgl-1的表达载体构建
参照中国专利cn02816680.9公开的抗opgl单抗资料及序列，委托上海生工生物工程有限公司全基因合成抗opgl单克隆抗体αopgl-1重链可变区基因(αopgl-1vh，如seqidno：5所示)及轻链可变区基因(αopgl-1vl，如seqidno：6所示)。αopgl-1重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如seqidno：7及seqidno：8所示。
以αopgl-1vh基因和pgem-t/ch载体为模板通过重叠pcr合成抗体重链基因，反应条件为：95℃15分钟；94℃50秒，58℃50秒，72℃50秒，30个循环；72℃10分钟。得到pcr产物αopgl-1vhch，其5'端含有限制酶位点hindⅲ和信号肽基因序列，3'端含有翻译终止密码taa和限制酶位点ecorⅰ，信号肽基因序列如seqidno：9所示。最后琼脂糖凝胶电泳分离pcr扩增产物，回收目的条带并克隆到pgemt载体中，筛选阳性克隆测 序。挑选测序正确的克隆用hindⅲ和ecorⅰ酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收抗体重链片段αopgl-1vhch，与用hindⅲ和ecorⅰ酶切的质粒pcdna3.1(+)(购自美国invitrogen公司)进行连接，构建成重链真核表达载体pcdna3.1(+)(αopgl-1vhch)。
以αopgl-1vl基因和pgem-t/cl载体为模板通过重叠pcr合成抗体轻链基因，反应条件为：95℃15分钟；94℃50秒，58℃50秒，72℃50秒，30个循环；72℃10分钟。得到pcr产物αopgl-1vlcl，其5'端含有限制酶位点hindⅲ和信号肽基因序列，3'端含有翻译终止密码taa和限制酶位点ecorⅰ，信号肽基因序列如seqidno：10所示。挑选测序正确的克隆用hindⅲ和ecorⅰ酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收抗体轻链片段αopgl-1vlcl，与用hindⅲ和ecorⅰ酶切的质粒pcdna3.1载体(购自美国invitrogen公司)进行连接，构建成轻链真核表达载体pcdna3.1(αopgl-1vlcl)。
实施例3.抗opgl抗体αopgl-1的稳定表达与纯化
于加有含血清培养基的3.5cm组织培养皿中接种3×105cho-k1细胞(atcccrl-9618)，细胞培养至90％-95％融合时进行转染，具体转染过程如下：
取质粒10μg(质粒pcdna3.1(+)(αopgl-1vhch)4μg和质粒pcdna3.1(αopgl-1vlcl)6μg)和20μllipofectamine2000reagent(购自invitrogen公司)分别溶于500μl无血清dmem培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使dna-脂质体复合物形成，其间用3ml无血清的dmem培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的dna-脂质体复合物加入到培养皿中，置于co2孵箱培养4小时后补加2ml含10％血清的dmem完全培养基，置于co2孵箱中继续培养。
转染进行24h后，用含600μg/mlg418选择培养基筛选抗性克隆，其中，筛选方法为取细胞培养上清用elisa检测筛选高表达克隆，筛选过程如下：
将羊抗人igg(fc)包被于elisa板，4℃过夜，用2％bsa-pbs于37℃封闭2h，加入待测的抗性克隆培养上清或标准品humanmyelomaigg1,κ(购自sigma公司)，37℃温育2h，加入hrp-羊抗人igg(κ)(购自southernbiotechnologyassociates公司)进行结合反应，37℃温育1h，加入tmb(四甲基联苯胺)于37℃作用5分钟，最后用h2so4终止反应，测a450值。
将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用proteina亲和柱(购自ge公司)分离纯化抗体αopgl-1。
将纯化抗体用pbs进行透析，最后以紫外吸收法定量确定纯化后抗体的浓度。
实施例4.αopgl-1抗体突变体的构建及表达
采用overlappcr的方式进行αopgl-1抗体突变体的构建，其构建、表达、纯化的方法与αopgl-1抗体相同，构建的抗体突变体共10个，分别命名为omut1～omut10，各突变抗体的突变位点分别如表1所示，重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的氨基酸序列分别见seqidno：11～19，其中，seqidno：11为αopgl-1重链可变区氨基酸序列的62位氨基酸残基由d突变为t的突变序列，seqidno：12为αopgl-1重链可变区氨基酸序列的62位氨基酸残基由d突变为r的突变序列，seqidno：13为αopgl-1重链可变区氨基酸序列的62位氨基酸残基由d突变为s的突变序列，seqidno：14为αopgl-1重链可变区氨基酸序列的105位氨基酸残基由i突变为r的突变序列，seqidno：15为αopgl-1重链可变区氨基酸序列的105位氨基酸残基由i突变为s的突变序列，seqidno：16为αopgl-1重链可变区氨基酸序列的105位氨基酸残基由i突变为e的突变序列，seqidno：17为αopgl-1轻链可变区氨基酸序列的92位氨基酸残基由y突变为k的突变序列，seqidno：18为αopgl-1轻链可变区氨基酸序列的92位氨基酸残基由y突变为r的突变序列，seqidno：19为αopgl-1重链可变区氨基酸序列的62位氨基酸残基由d突变为t，105位氨基酸残基由i突变为r的突变序列。
实施例5.αopgl-1及突变体的biacore鉴定
将sa芯片(购自ge公司)在50μl/min的pbs溶液中25℃平衡30min，然后用1mnacl和50mmnaoh的活化液活化3次，每次1min；将biotin标记的人opgl分子稀释成终浓度为1μg/ml，以10μl/min的流速进行包被(δru＝1000)；然后用pbs缓冲液50μl/min平衡10min。将平衡后的芯片用0.04％的生物素溶液封闭芯片。将抗体以等两倍比稀释五个浓度，50μl/min上样75秒，然后用pbs解离10分钟。在相同样品浓度下，突变抗体omut1-10的亲和力的相对值如表1所示。
表1.biacore检测抗体突变体的亲和力
wt表示未突变的αopgl-1抗体；mutant表示αopgl-1的突变抗体。
实验结果表明，相对于现有的未突变的αopgl-1抗体，单点突变抗体omut7亲和力提高了1倍以上，omut1和omut3亲和力均提高了2倍以上，omut4、omut5和omut6亲和力提高4倍以上；两点突变抗体omut9亲和力提高了10倍以上；而三点突变体抗体omut10，其亲和力更是提高了13倍以上。
以上实验结果表明，本发明的重组抗opgl抗体比现有的αopgl-1单抗表现出更强的抗原亲和力，可用于制备治疗骨质稀少疾病、患者中的伴随骨损失的炎症状况、患者中的伴随骨损失的自身免疫疾病的药物。