本发明提供了通式(I)的磷酰胆碱衍生物，其适用于被固定于固体载体上以得到通式(II)的分离材料，其与蛋白质的结合兼具高亲和力和高特异性，更特异地与C反应蛋白和抗-磷酰胆碱抗体结合。所述分离材料尤其可用于从患者的生物流体体外去除C反应蛋白和抗-磷酰胆碱抗体，用于预防和/或治疗免疫功能障碍和心血管疾病。还提供了包含通式(II)的分离材料的柱，以及包含所述柱的装置。
发明背景
C反应蛋白(CRP)是肝脏应答炎症期间细胞因子释放所生成的急性期反应物。其长期以来被用于追踪全身炎症、尤其是细菌感染的临床实践。最近，流行病学证据已显示在没有明显的炎性疾病时，CRP基础水平可在对于将来的心肌或脑血管事件的预测中提供信息(Ridker等人Circulation,2001 103,1813)。还令人感兴趣的是以下事实：CRP是被认为在冠状动脉事件的预测中具有价值的潜在的炎症标识物(Danesh等人N.Engl.J.Med.2004 350,1387)，且CRP是在心肌梗死后的数周期间所观测到的破坏过程的诱发因素(Slagman等人,Blood Purif.2011,31,9)。
若干研究已展现了磷酰胆碱(PC)对CRP的亲和力。因此，固定于固体载体的PC衍生物广泛用于从不同的生物源分离PC结合蛋白。然而，以上提及的固定于固体载体的PC衍生物的最重要的临床应用是从生物流体体外去除C反应蛋白和抗-磷酰胆碱抗体。
WO 90/12632描述了从生物流体除去CRP和抗-磷酰胆碱抗体以改善其细胞免疫应答的方法，和通过经磷酰胆碱-基质吸附装置进行患者血浆的体外灌注来从癌症患者的循环除去CRP和抗-磷酰胆碱抗体以改善患者对癌症的细胞免疫应答的方法。
WO 2007/076844描述了通过在呈现心血管疾病或免疫功能障碍、诸如自身免疫疾病的风险的患者中，凭借包含能吸收的基质材料(包括PC衍生物)的柱，进行血浆的体外灌注以从患者的生物液体清除CRP来处理CRP累积的风险，从而预防和/或治疗自身免疫疾病、心血管疾病、诸如心肌梗死、卒中、糖尿病、风湿病和肾功能不全的方法。
还描述了牛血清清蛋白的PC衍生物(PC-BSA)的合成，其在HW 65的固定及其在CRP亲和性纯化中的应用(Stults等人Anal.Biochem.1987,161,567)。在该项研究中，通过形成磷酸二酯键实现PC衍生物在固体载体上的固定。其它的PC衍生物以类似的方式固定于固体载体上(Spande T.F.J.Org.Chem.1980,45,3081；Martin,L.M.Tetrahedron Lett.1996 37,7921)。
WO 2013/176084 A1也公开了用于涂覆医疗装置以抑制生物材料、诸如血小板的粘附的通式(1)的氨基磷酸甲硅烷基烷基酯化合物：
WO 2012/160187 A1提供了用于治疗炎性、自身免疫和/或变应性障碍的含铵磷酸衍生物。假定公开的化合物通过抑制磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/Akt激酶通路发挥它们的药理学活性。
在我们的知识范围内，直至目前PC在固体载体上的固定仅通过形成磷酸二酯键来实现。PC衍生物通过磷酸二酯键所形成的固定具有一些优势，但也有严重的缺点。该方法的主要缺点是磷酸二酯键的形成改变了PC分子的总电荷(净电荷)，并由此改变了结合口袋中以此方式修饰的PC的朝向。此外，磷酸二酯键可以容易地被生物流体中存在的非特异性的磷酸二酯酶裂解，导致基质的不稳定问题，其以该方式被取代。
为消除上述缺陷，本发明的目的是提供可以被固定在固体载体上以提供分离材料的化合物，所述分离材料与CRP的结合兼具高亲和力和高特异性，用于通过体外去除CRP和抗-磷酰胆碱抗体来预防和/或治疗免疫功能障碍和心血管疾病。
该目的通过根据独立权利要求1的通式(I)的化合物、根据独立权利要求5的分离材料(用于从患者的生物流体体外去除CRP和抗-磷酰胆碱抗体来预防和/或治疗免疫功能障碍和心血管疾病)来实现。
本发明的目的通过独立权利要求的教导来实现。从本申请的从属权利要求、说明书、附图和实施例可明白本发明另外的有利特征、方面和细节。
发明描述
因此，本发明涉及通式(I)的化合物
其中
b选自2和3；
R1和R2彼此独立地选自：–CH3、–C2H5、–C3H7、–C4H9、–C5H11和–C6H13，或R1和R2可以与它们所连接的氮原子一起形成选自以下的杂环:
其中一个或若干个氢原子可以被一个或多个氟原子替代；
X选自：–SH、–NHR3、–C≡CH、–CH＝CH2、–N3和–CHO；
R3选自：–H、–CH3、–C2H5和–C3H7；
–L–选自：–La–、–La–Le–、–La–Lb–Le–和–La–Lb–Ld–Lc–Le–，
其中
–La–选自：–(CH2)m–、–(CH2–CH2–O)m–CH2–、
–Lb–和–Lc–彼此独立地选自：–O–、–NH–C(O)–、–C(O)–NH–、–O–C(O)–NH–和–SO2–；
–Ld–选自：–(CH2)n–、–(CH2–CH2–O)n–CH2–、
–Le–选自：–(CH2)p1–、–(CH2)p1–O–(CH2)p2–、
m、n、p1和p2彼此独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；
及上文提及的化合物的对映异构体、对映异构体的混合物、互变异构体、水合物、溶剂化物、外消旋物、质子化和去质子化形式。
技术人员清楚片段–L–的左侧连接于X，且片段–L–的右侧连接于
同样适用于以下片段：–La–、–Lb–、–Lc–、–Ld–和–Le–。
因此，例如，如果–L–表示–La–Lb–Le–，其中–La–是–(CH2)m–，–Lb–是–O–C(O)–NH–，且–Le–是–(CH2)p1–O–(CH2)p2–，则通式(I)的化合物如下:
如本文使用的表述互变异构体是指可通过称为互变异构化的化学反应互相转化的有机化合物。互变异构化通过碱、酸或其他适合的化合物催化。
本发明的优选的化合物是通式(I)的化合物：
其中b选自2和3；
R1和R2彼此独立地选自：–CH3和–C2H5，或R1和R2可以与它们所连接的氮原子一起形成选自以下的杂环:
其中一个或若干个氢原子可以被一个或多个氟原子替代；
X选自：–SH、–NHR3、–C≡CH、–CH＝CH2、–N3和–CHO；
R3选自：–H、–CH3、–C2H5和–C3H7；
–L–选自：–La–、–La–Le–、–La–Lb–Le–和–La–Lb–Ld–Lc–Le–，其中
–La–表示：–(CH2)m–或–(CH2–CH2–O)m–CH2–；
–Lb–和–Lc–彼此独立地选自：–O–、–NH–C(O)–、–C(O)–NH–、–O–C(O)–NH–和–SO2–；
–Ld–表示：–(CH2)n–或–(CH2–CH2–O)n–CH2–；
–Le–选自：–(CH2)p1–和–(CH2)p1–O–(CH2)p2–；且
m、n、p1和p2彼此独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。
根据本发明的一个优选的实施方案涉及通式(I)的化合物，其中X选自：–SH、–NHR3和–CHO，且更优选选自：–SH和–NHR3。
本发明的另一个优选的实施方案涉及通式(I)的化合物，其中X表示：–C≡CH、–CH＝CH2或–N3。
本发明的优选的化合物为以下通式(III)、(IV)、(V)和(VI)的化合物：
其中
–La–表示：–(CH2)m–或–(CH2–CH2–O)m–CH2–；
–Lb–和–Lc–彼此独立地选自：–O–、–NH–C(O)–、–C(O)–NH–、–O–C(O)–NH–和–SO2–；
–Ld–表示：–(CH2)n–或–(CH2–CH2–O)n–CH2–；
–Le–选自：–(CH2)p1–和–(CH2)p1–O–(CH2)p2–，
m、n、p1和p2彼此独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；
且b、X、R1和R2具有上文定义的含义。
尤其优选的化合物是通式(I)、(III)、(IV)、(V)和(VI)的化合物，其中
R1和R2彼此独立地选自：–CH3和–C2H5；
X选自：–SH和–NHR3；
R3选自：–H、–CH3、–C2H5和–C3H7；且
–La–表示：–(CH2)m–。
甚至更优选的实施方案涉及通式(I)的化合物
其中b选自2和3；
R1和R2彼此独立地选自：–CH3、–C2H5、–C3H7、–C4H9、–C5H11、–C6H13，或R1和R2可以与它们所连接的氮原子一起形成选自以下的杂环：
其中一个或若干个氢原子可以被一个或多个氟原子替代；
X选自：–SH、–NHR3、–C≡CH、–CH＝CH2、–N3和–CHO；
R3选自：–H、–CH3、–C2H5、–C3H7；
–L–选自：–(CH2)m–、–(CH2)m–O–C(O)–NH––(CH2)p1–、–(CH2)m–O–(CH2)p1–、–(CH2)m–C(O)–NH–(CH2)p1–、–(CH2)m–NH–C(O)–(CH2)p1–、–(CH2)m–C(O)–NH–(CH2)n–O–(CH2)p1–、–(CH2)m–O–C(O)–NH–(CH2)n–O–(CH2)p1–、–(CH2)m–C(O)–NH–(CH2)n–C(O)–NH–(CH2)p1–O–(CH2)p2–和–(CH2)m–O–C(O)–NH–(CH2)n–C(O)–NH–(CH2)p1–O–(CH2)p2–；
且m、n、p1和p2彼此独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。
优选地通式(I)的化合物选自：
1磷酸单2-[2-(2-氨基乙氧基)乙基-二乙基-铵基]乙酯
2磷酸单2-[4-[2-(2-氨基乙氧基)乙基]吗啉-4-鎓-4-基]乙酯
3磷酸单2-[1-[2-(2-氨基乙氧基)乙基]哌啶-1-鎓-1-基]乙酯
4磷酸单2-[2-(2-氨基乙氧基)乙基-二甲基-铵基]乙酯
5磷酸单2-[3-氨基丙基(二甲基)铵基]乙酯
6磷酸单2-[二甲基(4-硫烷基丁基)铵基]乙酯
7磷酸单2-[4-叠氮基丁基(二甲基)铵基]乙酯
8磷酸单2-[二甲基(戊-4-炔基)铵基]乙酯
9磷酸单2-[3-(6-氨基己酰氨基)丙基-二乙基-铵基]乙酯
10磷酸单2-[1-[2-[2-(6-氨基己酰氨基)乙氧基]乙基]哌啶-1-鎓-1-基]乙酯
11磷酸单2-[4-[2-[2-[3-(6-氨基己酰氨基)丙酰基氨基]乙氧基]乙基]吗啉-4-鎓-4-基]乙酯
12磷酸单2-[1-[2-[2-[6-(6-氨基己酰氨基)己酰氨基]乙氧基]乙基]吡咯烷-1-鎓-1-基]乙酯
13磷酸单2-[2-烯丙氧基乙基(二甲基)铵基]乙酯
14磷酸单2-[2-烯丙氧基乙基(二乙基)铵基]乙酯
15磷酸单2-[4-(2-烯丙氧基乙基)吗啉-4-鎓-4-基]乙酯
16磷酸单2-[1-(2-烯丙氧基乙基)哌啶-1-鎓-1-基]乙酯
17磷酸单2-[2-[2-(6-氨基己酰氨基)乙氧基]乙基-二甲基-铵基]乙酯
18磷酸单2-[2-[2-[3-(6-氨基己酰氨基)丙酰基氨基]乙氧基]乙基-二甲基-铵基]乙酯
19磷酸单2-[3-叠氮基丙基(二甲基)铵基]乙酯
20磷酸单2-[二甲基-[2-[2-(丙-2-炔氧基羰基氨基)乙氧基]乙基]铵基]乙酯
21磷酸单2-[2-[2-(烯丙氧基羰基氨基)乙氧基]乙基-二甲基-铵基]乙酯
22磷酸单2-[2-[2-[6-(烯丙氧基羰基氨基)己酰氨基]乙氧基]乙基-二甲基-铵基]乙酯
23磷酸单2-[2-(6-氨基己酰氨基)乙基-二甲基-铵基]乙酯
24磷酸单2-[二甲基-[3-[6-(丙-2-炔氧基羰基氨基)己酰氨基]丙基]铵基]乙酯
25磷酸单2-[3-(6-氨基己酰氨基)丙基-二甲基-铵基]乙酯
本发明的化合物被设计使得它们可以被固定于固体载体上以提供分离材料，与现有技术公开的分离材料相比，其呈现增加的稳定性、增加的亲和力和增加的对于CRP的选择性。这通过用–L–X部分来替换磷酰胆碱的三-烷基铵基的烷基取代基中的一个而实现。所述–L–X部分能使通式(I)的化合物固定于固体载体而不改变磷酰胆碱分子的总电荷，且避免结构物中出现不稳定的磷酸二酯键。
因此，本发明还提供了通式(II)的分离材料及该分离材料的质子化和去质子化形式：
其中
b选自2和3；
R1和R2彼此独立地选自：–CH3、–C2H5、–C3H7、–C4H9、–C5H11和–C6H13，或R1和R2可以与它们所连接的氮原子一起形成选自以下的杂环：
其中一个或若干个氢原子可以被一个或多个氟原子替代；
Y选自：–CH(OH)–CH2–N(R4)–、–CH(OH)–CH2–S–、–CH2–NH–、–NH–CH2–、–CH2–CH2–S–、–S–CH2–CH2–、
R4选自：–H、–CH3、–C2H5、–C3H7和–C(O)–CH3；
–L–选自：–La–、–La–Le–、–La–Lb–Le–和–La–Lb–Ld–Lc–Le–，其中
–La–选自：–(CH2)m–、–(CH2–CH2–O)m–CH2–，
–Lb–和–Lc–彼此独立地选自：–O–、–NH–C(O)–、–C(O)–NH–、–O–C(O)–NH–和–SO2–；
–Ld–选自：–(CH2)n–、–(CH2–CH2–O)n–CH2–、
–Le–选自：–(CH2)p1–、–(CH2)p1–O–(CH2)p2–、
–L*–选自：–L*a–、–L*a–L*e–和–L*a–L*b–L*e–，其中
–L*a–选自：–(CH2)o–、–(CH2–CH2–O)o–C2H4–、–(CH2–CH2–O)o–CH2–和–CH2–CH(OH)–CH2–；
–L*e–选自：–(CH2)q–、–C2H4–(O–CH2–CH2)q–和–CH2–(O–CH2–CH2)q–；
–L*b–选自：–O–(CH2)r–O–、–S–(CH2)r–S–、–SO2–、–S–、–O–、–NH–C(O)、–C(O)–NH–和–S–S–；且
m、n、p1、p2、o、r、q彼此独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；
A是固体载体，其选自：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚砜(PS)、聚醚砜(PES)、聚芳醚砜(PAES)、聚丙烯酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)(PGMA)、聚(羟基甲基丙烯酸酯)、聚苯乙烯(PS)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚丙烯酰胺、聚丙烯醛、丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)、聚丙烯腈(PAN)、聚氨酯(PU)、聚乙二醇(PEG)、高氟碳或高氟烃(hyperfluorocarbon)、琼脂糖、藻酸盐、角叉菜胶、壳多糖、淀粉、纤维素、硝化纤维素、玻璃、硅石、硅藻土、氧化锆、氧化铝、氧化铁及所述固体载体的混合物和/或衍生物。
技术人员清楚–L*–的左侧片段连接于A，–L*–片段的右侧连接于Y片段的左侧，Y片段的右侧连接于–L–片段的左侧，–L–片段的右侧连接于
同样适用于以下片段：–La–、–Lb–、–Lc–、–Ld–、–Le–、–L*a–、–L*b–和–L*e–。
因此，例如，如果–L*–表示–L*a–L*b–L*e–，其中–L*a–是–CH2–CH(OH)–CH2–，–L*b–是–O–，–L*e–是–(CH2)q–，Y表示–CH(OH)–CH2–N(R4)–，–L–表示–La–Lb–Le–，其中–La–是–(CH2)m–，–Lb–是–O–C(O)–NH–，且–Le–是–(CH2)p1–O–(CH2)p2–，则通式(II)的分离材料如下:
本文所用的固体载体A是指这样的惰性固体载体：预期用部分–L*–FG官能化实现本发明的通式(I)、(III)、(IV)、(V)和(VI)的化合物的共价固定，其中FG是适合与官能团X反应的反应性官能团。FG基团的实例包括但不限于：环氧化物、–CHO、–C≡CH、–CH＝CH2、–N3、–CH(OH)–CH2–N3、–NH2、–SH、三氟乙磺酰基(tresyl)。固体载体的官能化通过本领域技术人员众所周知的方法实现(Chin.J.Chem.2012,30,2473；Polym.Int.2013,62,991)。此外，官能化的固体载体已经商业可得：AF-环氧、AF-氨基、AF-三氟乙磺酰基、三氟乙磺酰基、环氧-活化的6B(GE Healthcare Life Sciences)、CNBr-活化的4fast flow(GE Healthcare Life Sciences)、ECH4B(GE Healthcare Life Sciences)、NHS-活化的4fast flow(GE Healthcare Life Sciences)、末端乙烯基砜活化的4fast flow(Affiland)、醛(琼脂糖)4B、ECH(琼脂糖)4B(Separopore)。
可以对所述固体载体进行交联或其他处理以增加物理或化学稳定性，且可使其形成各种形状，包括但不限于纤维、片、杆、小球和膜。
优选地，固体载体A选自聚砜(PS)、聚醚砜(PES)、聚芳醚砜(PAES)、其混合物和/或衍生物。
可以修饰基于PS、PES和PAES的固体载体使得部分–L*–FG出现在它们表面上，其中FG是适合与官能团X反应的反应性官能团(Chin.J.Chem.2012,30,2473；Polym.Int.2013,62,991)。所述修饰导致增加了抗污性、生物相容性和其它特定功能。
本发明的优选的分离材料是通式(II)的分离材料及其质子化和去质子化形式：
其中
b选自2和3；
R1和R2彼此独立地选自：–CH3、–C2H5，或R1和R2可以与它们所连接的氮原子一起形成选自以下的杂环:
其中一个或若干个氢原子可以被一个或多个氟原子替代；
Y选自：–CH(OH)–CH2–N(R4)–、–CH(OH)–CH2–S–、–CH2–NH–、–NH–CH2–、–CH2–CH2–S–、–S–CH2–CH2–、
R4选自：–H、–CH3、–C2H5、–C3H7、–C(O)–CH3；
–L–选自：–La–、–La–Le–、–La–Lb–Le–和–La–Lb–Ld–Lc–Le–，其中
–La–表示：–(CH2)m–或–(CH2–CH2–O)m–CH2–；
–Lb–和–Lc–彼此独立地选自：–O–、–NH–C(O)–、–C(O)–NH–、–O–C(O)–NH–和–SO2–；
–Ld–选自：–(CH2)n–和–(CH2–CH2–O)n–CH2–，
–Le–选自：–(CH2)p1–和–(CH2)p1–O–(CH2)p2–；
–L*–选自：–L*a–、–L*a–L*e–和–L*a–L*b–L*e–，其中
–L*a–选自：–(CH2)o–、–(CH2–CH2–O)o–C2H4–、–(CH2–CH2–O)o–CH2–和–CH2–CH(OH)–CH2–；
–L*e–选自：–(CH2)q–、–C2H4–(O–CH2–CH2)q–和–CH2–(O–CH2–CH2)q–；
–L*b–选自：–O–(CH2)r–O–、–S–(CH2)r–S–、–SO2–、–S–、–O–、–NH–C(O)–、–C(O)–NH–和–S–S–；
m、n、p1、p2、o、r、q彼此独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；
且A具有如上文定义的含义、且更优选A选自聚砜(PS)、聚醚砜(PES)、聚芳醚砜(PAES)、其混合物和/或衍生物。
根据本发明的一个优选的实施方案涉及通式(II)的分离材料，其中Y选自：–CH(OH)–CH2–N(R4)–、–CH(OH)–CH2–S–、–CH2–NH–、–NH–CH2–、–CH2–CH2–S–、–S–CH2–CH2–、
且更优选选自：–CH(OH)–CH2–N(R4)–和–CH(OH)–CH2–S–。
还优选的是通式(II)的分离材料，其中Y表示:
本发明的优选的化合物是以下通式(VII)、(VIII)、(IX)和(X)的化合物
其中
–La–选自：–(CH2)m–和–(CH2–CH2–O)m–CH2–；
–Lb–和–Lc–彼此独立地选自：–O–、–NH–C(O)–、–C(O)–NH–、–O–C(O)–NH–和–SO2–；
–Ld–选自：–(CH2)n–和–(CH2–CH2–O)n–CH2–；
–Le–选自：–(CH2)p1–和–(CH2)p1–O–(CH2)p2–；
m、n、p1、p2、o、r、q彼此独立地选自：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；且b、A、L*、Y、R1和R2具有上文定义的含义。
尤其优选的分离材料是通式(II)、(VII)、(VIII)、(IX)和(X)的分离材料，其中
–L*–选自：–L*a–、–L*a–L*e–和–L*a–L*b–L*e–；且
–L*a–选自：–(CH2)o–和–CH2–CH(OH)–CH2–；
–L*e–表示–(CH2)q–；
–L*b–选自：–O–(CH2)r–O–、–S–(CH2)r–S–、–S–和–O–；且
o、q和r彼此独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。
在通式(II)、(VII)、(VIII)、(IX)和(X)中，L*优选地表示–L*a–L*b–L*e–，且A优选地选自：聚砜(PS)、聚醚砜(PES)、聚芳醚砜(PAES)、其混合物和/或衍生物。
另一个优选的本发明的实施方案涉及通式(II)、(VII)、(VIII)、(IX)和(X)的分离材料，其中
R1和R2彼此独立地选自：–CH3和–C2H5；
Y选自：–CH(OH)–CH2–N(R4)–、–CH(OH)–CH2–S–、–CH(OH)–CH2–O–、–CH2–NH–、–S–CH2–CH2–和–CH2–CH2–S–；
R4选自：–H、–CH3、–C2H5、–C3H7和–C(O)–CH3；且
–La–表示–(CH2)m–。
甚至更优选的实施方案涉及通式(II)的分离材料
和所述分离材料的质子化和去质子化形式，其中
R1和R2彼此独立地选自：–CH3、–C2H5、–C3H7、–C4H9、–C5H11和–C6H13，或R1和R2可以与它们所连接的氮原子一起形成选自以下的杂环:
其中一个或若干个氢原子可以被一个或多个氟原子替代；
Y选自：–CH(OH)–CH2–N(R4)–、–CH(OH)–CH2–S–、–CH2–NH–、–NH–CH2–、–S–CH2–CH2–和–CH2–CH2–S–、
R4选自：–H、–CH3、–C2H5、–C3H7和–C(O)–CH3；
–L–选自：–(CH2)m–、–(CH2)m–O–C(O)–NH–(CH2)p1–、–(CH2)m–O–(CH2)p1–、–(CH2)m–C(O)–NH–(CH2)p1–、–(CH2)m–NH–C(O)–(CH2)p1–、–(CH2)m–C(O)–NH–(CH2)n–O–(CH2)p1–、–(CH2)m–O–C(O)–NH–(CH2)n–O–(CH2)p1–、–(CH2)m–C(O)–NH–(CH2)n–C(O)–NH–(CH2)p1–O–(CH2)p2–和–(CH2)m–O–C(O)–NH–(CH2)n–C(O)–NH–(CH2)p1–O–(CH2)p2–；
m、n、p1和p2彼此独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，且b、A和L*具有上文定义的含义，更优选A选自：聚砜(PS)、聚醚砜(PES)、聚芳醚砜(PAES)、其混合物和/或衍生物。
另一个优选的实施方案涉及通式(II)的分离材料
其中b选自2和3；
R1和R2彼此独立地选自：–CH3、–C2H5、–C3H7、–C4H9、–C5H11和–C6H13，或R1和R2可以与它们所连接的氮原子一起形成选自以下的杂环:
其中一个或多个氢原子可以被一个或多个氟原子替代；
Y选自：–CH(OH)–CH2–N(R4)–、–CH(OH)–CH2–S–、–S–CH2–CH2–和–CH2–CH2–S–；
R4选自：–H、–CH3、–C2H5、–C3H7和–C(O)–CH3；
–L–选自：–(CH2)m–、–(CH2)m–O–C(O)–NH–(CH2)p1–、–(CH2)m–O–(CH2)p1–、–(CH2)m–C(O)–NH–(CH2)p1–、–(CH2)m–NH–C(O)–(CH2)p1–、–(CH2)m–C(O)–NH–(CH2)n–O–(CH2)p1–、–(CH2)m–O–C(O)–NH–(CH2)n–O–(CH2)p1–、–(CH2)m–C(O)–NH–(CH2)n–C(O)–NH–(CH2)p1–O–(CH2)p2–和–(CH2)m–O–C(O)–NH–(CH2)n–C(O)–NH–(CH2)p1–O–(CH2)p2–；且m、n、p1和p2彼此独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；
–L*–选自：–(CH2)o–、–(CH2–CH2–O)o–C2H4–、–(CH2–CH2–O)o–CH2–C(O)–NH–(CH2)q–、–(CH2)o–SO2–(CH2)q–、–CH2–CH(OH)–CH2–O–CH2–、–CH2–CH(OH)–CH2–O–(CH2)r–O–CH2–和–(CH2–CH2–O)o–C2H4–O–CH2–；
o、r和q彼此独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；A具有如上文定义的含义、更优选选自：聚砜(PS)、聚醚砜(PES)、聚芳醚砜(PAES)、其混合物和/或衍生物。
另一个优选的实施方案涉及通式(II)及其质子化和去质子化形式的分离材料
其中b选自2和3；
R1和R2彼此独立地选自：–CH3、–C2H5、–C3H7、–C4H9、–C5H11和–C6H13，或R1和R2可以与它们所连接的氮原子一起形成选自以下的杂环:
其中一个或若干个氢原子可以被一个或多个氟原子替代；
Y选自：
–L–选自：–(CH2)m–、–(CH2)m–O–C(O)–NH––(CH2)p1–、–(CH2)m–O–(CH2)p1–、–(CH2)m–C(O)–NH–(CH2)p1–、–(CH2)m–NH–C(O)–(CH2)p1–、–(CH2)m–C(O)–NH–(CH2)n–O–(CH2)p1–、–(CH2)m–O–C(O)–NH–(CH2)n–O–(CH2)p1–、–(CH2)m–C(O)–NH–(CH2)n–C(O)–NH–(CH2)p1–O–(CH2)p2–和–(CH2)m–O–C(O)–NH–(CH2)n–C(O)–NH–(CH2)p1–O–(CH2)p2–；且m、n、p1和p2彼此独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；
–L*–选自：–(CH2)o–、–(CH2–CH2–O)o–C2H4–、–(CH2–CH2–O)o–CH2–C(O)–NH–(CH2)q–、–(CH2)o–SO2–(CH2)q–、–CH2–CH(OH)–CH2–O–CH2–、–CH2–CH(OH)–CH2–O–(CH2)r–O–CH2–和–(CH2–CH2–O)o–C2H4–O–CH2–；
o、r和q彼此独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；A具有如上文定义的含义、且更优选选自聚砜(PS)、聚醚砜(PES)、聚芳醚砜(PAES)、其混合物和/或衍生物。
适应症:
令人惊讶地发现以上提及的通式(I)、(III)、(IV)、(V)和(VI)的化合物以及通式(II)、(VII)、(VIII)、(IX)和(X)的分离材料高亲和力和高选择性地结合CRP和抗-磷酰胆碱抗体。因此，本发明化合物和分离材料可用于从生物流体除去CRP和抗-磷酰胆碱抗体。
本发明的一个实施方案涉及从患者的生物流体体外去除CRP以预防和/或治疗免疫功能障碍和心血管疾病的方法，所述方法包括以下步骤:
a)提供通式(II)、(VII)、(VIII)、(IX)或(X)的分离材料；和
b)使患者的生物流体与所述分离材料接触。
为该目的，将通式(II)、(VII)、(VIII)、(IX)和(X)的分离材料载入柱中，所述柱可用于从患者的生物流体体外去除CRP以预防和/或治疗免疫功能障碍和心血管疾病。
本文所用的术语生物流体包括血、血浆、腹水和淋巴液。
柱的尺寸不是关键性的，必须对它们进行选择使得它们适合生物流体离开患者的流速，所述流速与患者的体重高度相关。包含本发明的分离材料的柱必须被灭菌，例如使用杀菌气体、诸如环氧乙烷，并直接使用或密封并存储用于之后的使用。使用前，必须用生理盐水洗涤柱，随后用含任何其他适合的制备成分(preparatory ingredients)的生理盐水洗涤。柱可以具有常规的筒设计、流化床、膨胀床或整体柱(monolith)。技术人员熟知所述柱的制备。例如，常规筒设计的柱的制备可以如专利申请EP0237659A1中所述进行。
柱的再生也是可能的。用于再生目的，例如可使用0.9％盐水溶液冲洗柱。随后通过使用甘氨酸/HCl缓冲液(pH 2.8)降低pH值以切断CRP和分离材料之间的连接，随后用PBS(磷酸盐缓冲盐水)在pH值7.4进行洗涤步骤，最后用0.9％盐水溶液进行洗涤步骤。
任选地，包含本发明的分离材料的柱含有另外的适用于从患者的生物流体除去其他有意义的物质的分离材料。所述其他物质优选为蛋白质。其他物质的实例为白细胞介素-6、白细胞介素-1、TNFα、血清淀粉样P成分(SAP)、PTX3、血纤蛋白原、抗体(诸如IgG、IgE)、抗磷酯抗体和补体系统成分、诸如C1q、C3a或C5a。
可以将本发明的柱结合至设备中以提供适用于从患者的生物流体体外去除CRP以预防和/或治疗免疫功能障碍和心血管疾病的装置。
因此，根据本发明的设备包含:
a)包含通式(II)、(VII)、(VIII)、(IX)和(X)的分离材料的柱；和
b)用于将包含分离材料的柱与患者的生物流体离体接触由此降低所述生物流体的CRP水平及用于使生物流体返回至患者的装置。
由于通式(I)的化合物的高亲和力和选择性，通式(II)、(VII)、(VIII)、(IX)和(X)的分离材料、包含通式(II)、(VII)、(VIII)、(IX)或(X)的分离材料的柱和包含该柱(所述柱含有通式(II)、(VII)、(VIII)、(IX)或(X)的分离材料)的设备尤其可用于从患者的生物流体体外去除CRP以预防和/或治疗免疫功能障碍和心血管疾病。
优选地，生物流体选自：血、血浆、腹水和淋巴液。
如本文使用的术语“心血管疾病”包括但不限于梗死、卒中、糖尿病、晚期肾病、肾功能不全、由于高血压导致的肾功能不全、内皮损害(endothelial lesions)、内皮破坏(endothelial destruction)、动脉硬化、血栓形成、动脉粥样硬化、狭窄、再狭窄、动脉粥样硬化或血栓形成疾病、血流不足、缺血事件、肺栓塞、稳定和不稳定型心绞痛、冠状动脉疾病、心肌梗死，以及动脉硬化或血栓形成疾病的病理结果。
如本文使用的术语“免疫功能障碍”包括但不限于免疫性疾病、自身免疫疾病、移植术中的排斥反应、异体移植物排斥、异种移植排斥、移植物抗宿主排斥、宿主抗移植物排斥、糖尿病、风湿病、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊椎炎、多发性硬化、重症肌无力、寻常性银屑病、毒性弥漫性甲状腺肿、古德帕斯丘综合征、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、再生障碍性贫血、炎症性肠病(IBD)、克罗恩病(也称为节段性回肠炎)、溃疡性结肠炎、扩张型心肌病(DCM)、自身免疫性甲状腺炎、桥本甲状腺炎、激素替代疗法(HRT)、骨关节炎和痛风。
化学合成
A.通式(I)的化合物的合成
A.1根据流程1可以从市售的通式NHR3–L1–OH(1)的氨基醇(其中L1表示–La–、–La–O–Le–、–La–Le–、–Le–、–Ld–O–Le–或–Ld–Le–)起始装配本发明的通式I的化合物，其中X表示–NHR3，R3选自：–H、–CH3、–C2H5、–C3H7，且–L–表示–La–、–La–O–Le–、–La–Le–(即通式6的化合物)，或X表示–C≡CH或–CH＝CH2，且–L–表示–La–O–C(O)–NH–Le–或–La–O–C(O)–NH–Ld–O–Le–(即通式5的化合物，其中PG1表示烯丙氧基羰基或炔丙基氧基羰基，且R3表示–H)。
流程1：通式5和6的化合物的合成：a.保护氨基；b.将羟基转化为离去基团LG；c.季铵化；d.磷酸化；e.脱保护。
该合成涉及用保护基团PG1保护醇1的末端氨基，随后将末端羟基转化为离去基团LG，得到中间体3。适合的氨基保护基团PG1为技术人员熟知，且包括氨基甲酸酯、邻苯二甲酰基团和取代的邻苯二甲酰基团。氨基甲酸酯的实例包括但不限于：苄氧基羰基(Cbz或Z)、4-硝基-苄氧基羰基、4-氯-苄氧基羰基、4-甲氧基-苄氧基羰基、4-甲基-苄氧基羰基、4-叠氮基-苄氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、烯丙氧基羰基(Aloc)、炔丙基氧基羰基、叔丁氧基羰基(Boc)。邻苯二甲酰(Phtaloyl)和取代的邻苯二甲酰保护基团尤其可用于保护伯胺(R3表示H)。取代的邻苯二甲酰基团的实例包括但不限于4-硝基-邻苯二甲酰、3-硝基-邻苯二甲酰和四氯邻苯二甲酰。优选地，保护基团PG1选自烯丙氧基羰基、炔丙基氧基羰基、苄氧基羰基和邻苯二甲酰。在步骤b引入的离去基团LG可以选自氯化物、溴化物、碘化物、甲苯磺酸酯、苯磺酸酯、对-硝基-苯磺酸酯、甲磺酸酯或三氟甲磺酸酯基团。优选地，离去基团LG是磺酸的酯(即磺酸酯)、且更优选LG是甲磺酸酯基团。醇官能团至的基团LG的转化可以例如通过用MsCl或TsCl在三乙胺的存在下、使用二氯甲烷作为溶剂、在0℃处理醇2来实现。将中间体3进一步与通式NHR1R2–(CH2)b–OH的氨基醇、诸如二甲基乙醇胺、二甲基丙醇胺、N,N-二乙基乙醇胺、N-(2-羟基乙基)吗啉或N-(2-羟基乙基)哌啶反应，通过季铵化反应得到氨基醇4。随后用POCl3和三乙胺在乙腈中在0℃处理醇4，结果在分子上引入磷酸酯基团。对末端氨基的脱保护得到根据本发明的通式6的目标化合物，其可随时通过末端氨基固定于固体载体。如果保护基团PG1是烯丙氧基羰基或炔丙基氧基羰基，且R3表示–H，则脱保护步骤是任选的，因为通式5的化合物可以通过末端烯基团(硫醇-烯化学、点击化学、置换(methathesis))或炔基团(点击化学)直接固定于固体载体。
多种市售的通式NHR3–L1–OH(1)的氨基醇可用作流程1中描述的合成途径的起始材料。所述市售的氨基醇包括但不限于2-氨基乙醇、3-氨基丙-1-醇、4-氨基丁-1-醇、5-氨基戊-1-醇、6-氨基己-1-醇、2-(2-氨基乙氧基)乙醇、2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙醇、2-(3-氨基丙氧基)乙醇、3-(3-氨基丙氧基)丙-1-醇、4-(3-氨基丙氧基)丁-1-醇、2-(甲氨基)乙醇、3-(甲氨基)丙-1-醇、4-(甲氨基)丁-1-醇、5-(甲氨基)己-1-醇、6-(甲氨基)己-1-醇、7-(甲氨基)庚-1-醇、2-[2-(甲氨基)乙氧基]乙醇、2-[2-[2-(甲氨基)乙氧基]乙氧基]乙醇、2-[3-(甲氨基)丙氧基]乙醇、3-[3-(甲氨基)丙氧基]乙醇、3-[3-(甲氨基)丙氧基]丙-1-醇、4-[3-(甲氨基)丙氧基]丁-1-醇。
技术人员会理解通过进行流程1中描述的合成方法的步骤b、c和d和(如果必要的话)对通式PG2S–L1–OH、HC≡C–L1–OH、CH2＝CH–L1–OH、N3–L1–OH或PG3＝C–L1–OH的醇(其中PG2是巯基保护基团(例如苄基)，且PG3是醛保护基团(例如二噻烷或缩醛))的适合的脱保护步骤，会得到类似的6a、6b、6c、6d和6e。
在该情况中炔丙基醇、3-叠氮基丙-1-醇、2-叠氮基乙醇、4-叠氮基丁-1-醇、2-(2-叠氮基乙氧基)乙醇、2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙醇、2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙醇、2-(2-叠氮基乙基磺酰基)乙醇、丁-3-炔-1-醇、戊-4-炔-1-醇、2-丙-2-炔氧基乙醇、2-(2-丙-2-炔氧基乙氧基)乙醇、2-[2-(2-丙-2-炔氧基乙氧基)乙氧基]乙醇可以用作原料。
A.2根据流程2，可以从通式NHR3–L2–CO2H的氨基酸9(其中–L2–表示–La–或–Ld–)、通式NH2–L1–OH(1)的氨基醇10(其中L1表示–Le–)或通式NH2–L3–NR1R2的二胺11(其中L3表示–Le–)起始来装配本发明的通式I的化合物，其中X表示–NHR3，R3选自：–H、–CH3、–C2H5、–C3H7，且–L–表示–La–C(O)–NH–Le–(即通式7和19的化合物)或X表示–C≡CH或–CH＝CH2，且–L–表示–La–O–C(O)–NH–Ld–C(O)–NH–Le–(即通式8和18的化合物，其中PG1表示烯丙氧基羰基或炔丙基氧基羰基，R3表示–H)。
所述合成起始为用保护基团PG1保护氨基酸9上的氨基，其中PG1具有A.1段所定义的含义，得到羧酸12。将羧酸12与氨基醇10偶联，得到伯醇13，在其上将羟基进一步转化为离去基团LG，其中离去基团LG具有A.1段所定义的含义，得到中间体14。用通式NHR1R2–(CH2)b–OH的氨基醇10(例如二甲基乙醇胺、二甲基丙醇胺、N,N-二乙基乙醇胺、N-(2-羟基乙基)吗啉或N-(2-羟基乙基)哌啶)处理中间体14，形成醇15，将其进行季铵化反应，随后进行包括裂解保护基团PG1的脱保护，得到目标化合物7。如前所述，可以将具有为烯丙氧基羰基或炔丙基氧基羰基的PG1的前体8直接固定于固体载体。
流程2：通式7、8、18和19的化合物的合成：a.保护氨基；b.10、偶联；c.将羟基转化为离去基团LG；d.季铵化；e.磷酸化；f.脱保护；g.11，偶联；h.季铵化。
或者，可以将羧酸醇12与二胺11偶联，得到酰胺16，随后通过用2-羟基乙基或3-羟基丙基衍生物处理对其进行季铵化反应。适合的2-羟基乙基和3-羟基丙基衍生物包括2-溴-和2-碘-乙醇和3-溴和3-碘丙醇。所述季铵化反应优选在乙腈中在室温进行。最后，对醇18进行磷酸化反应，随后进行脱保护反应，得到目标化合物19。
通式NHR3–L2–CO2H的氨基酸9包括但不限于7-氨基庚酸、6-氨基己酸、5-氨基戊酸、4-氨基丁酸、3-氨基丙酸、2-氨基乙酸、2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸、2-[2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸、2-(2-氨基乙氧基)乙酸、2-(3-氨基丙氧基)乙酸、3-(3-氨基丙氧基)丙酸、4-(3-氨基丙氧基)丁酸、2-(甲氨基)乙酸、3-(甲氨基)丙酸、4-(甲氨基)丁酸、5-(甲氨基)戊酸、6-(甲氨基)己酸、7-(甲氨基)庚酸、2-[2-(甲氨基)乙氧基]乙酸、2-[2-[2-(甲氨基)乙氧基]乙氧基]乙酸、2-[3-(甲氨基)丙氧基]乙酸、3-[3-(甲氨基)丙氧基]丙酸、4-[3-(甲氨基)丙氧基]丁酸、2-[2-[2-[2-(甲氨基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酸。
适合用于流程2所示的合成流程的通式NHR1R2–(CH2)b–OH的氨基醇10包括但不限于：2-氨基乙醇、3-氨基丙-1-醇、4-氨基丁-1-醇、5-氨基戊-1-醇、6-氨基己-1-醇、2-(2-氨基乙氧基)乙醇、2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙醇、2-(3-氨基丙氧基)乙醇、3-(3-氨基丙氧基)丙-1-醇、4-(3-氨基丙氧基)丁-1-醇。
商购可得的通式H2N–Le–NR1R2的二胺11的实例包括但不限于乙二胺；1,3-二氨基丙烷；N-甲基乙二胺；1,4-二氨基丁烷；3-(甲氨基)-丙胺；N,N′-二甲基乙二胺；N-乙基乙二胺；3-(二甲氨基)-1-丙胺；N-异丙基-乙二胺；N-丙基乙二胺；六亚甲基二胺；1,2-二氨基环己炔；1,4-二氨基环己烷；和N-己基乙二胺。
技术人员会理解通过进行流程2中所述的合成方法的步骤b-e和(如果必要的话)对通式PG2S–L2–CO2H、HC≡C–L2–CO2H、CH2＝CH–L2–CO2H、N3–L2–CO2H或PG3＝C–L2–CO2H的羧酸(其中PG2是巯基保护基团(例如苄基)，且PG3是醛保护基团(例如二噻烷或乙缩醛))的适合的脱保护步骤，会得到类似物7a、7b、7c、7d和7e。
用作获得类似物7a-7e的起始材料的适合的羧酸的实例包括但不限于：6-硫代己酸、6-叠氮基己酸、5-硫代戊酸、5-叠氮基戊酸、4-硫代丁酸、4-叠氮基丁酸、3-硫代丙酸、3-叠氮基丙酸、硫代乙酸、3-丁炔酸、4-戊炔酸。
A.3或者，通式R3HN–L4–NR1R2(20)的二胺可以成功地用于得到通式I的化合物，其中X表示–NHR3，R3选自：–H、–CH3、–C2H5、–C3H7和–L–表示–La–(参见流程3)。二胺20可以商购获得(例如N,N-二甲基-1,3-丙二胺)或可以例如从相应的卤代衍生物起始、经两个合成步骤(包括将卤代衍生物转化为叠氮基衍生物，并将该叠氮基衍生物还原为相应的伯胺)容易地获得。
从通式R3HN–L4–NR1R2的二胺20起始，可以在四个步骤中得到通式24的化合物，所述步骤包括用保护基团PG1(其中PG1具有A.1段所定义的含义)保护伯胺或仲胺，通过用适合的2-羟基乙基或3-羟基丙基衍生物处理将该叔胺季铵化，随后进行磷酸化和伯胺或仲胺的脱保护。
流程3：通式24的化合物的合成：a.保护氨基；b.季铵化；c.磷酸化；d.脱保护。
B.通式(II)的分离材料的制备
通式(II)的分离材料可以通过将通式(I)的化合物与用部分–L*–FG官能化的固体载体A偶联来制备，其中FG是适合与官能团X反应的官能团。FG基团的的实例包括–CHO、–C≡CH、–N3、–CH＝CH2、–NH2、–SH、环氧化物、三氟乙磺酰基。流程4概述了不同的可以用于得到通式(II)的分离材料的偶联方法。优选地，将通式(I)的化合物(其中X选自–SH、–OH和–NHR3)经环氧化物开环偶联至固体载体A(参见流程5a、b)。
在本发明的一个实施方案中，进行通式(I)的化合物(其中X＝–C≡CH、–N3或–CH＝CH2)和固体载体的偶联，形成三唑部分(参见流程5c、d、e)。从叠氮化物和炔烃形成三唑，也称为炔烃叠氮化物Huisgen环加成反应，作为1,3-环加成反应进行。Huisgen1,3-偶极环加成的特别的变型是铜(I)催化的变型，其中联合有机叠氮化物和末端炔烃，得到为单产物的1,2,3-三唑的1,4-位置异构体。该反应称为铜(I)-催化的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)。该反应可以使用商购来源的铜(I)诸如溴化亚铜或碘化亚铜进行。然而，使用铜(II)(例如硫酸铜(II))和还原剂(例如抗坏血酸钠)的混合物，该反应进行得更好，原位得到Cu(l)。由于Cu(l)在水性溶剂中不稳定，所以稳定配体对改善该反应产出有效，尤其是如果使用三-(苄基三唑基甲基)胺(TBTA)。该反应可以在多种溶剂、及水与多种(部分)易混合有机溶剂的的混合物中进行，所述易混合有机溶剂包括醇、DMSO、DMF、t-BuOH、二噁烷、丙酮及其混合物。此外，该反应可通过钌催化。钌-催化的1,3-偶极叠氮化物-炔烃环加成(RuAAC)生成1,5-三唑。因此，使用叠氮化物-炔烃环加成可以容易地得到通式(II)的分离材料，其中Y选自:
以相同的方式，可以从叠氮化物和烯烃起始得到通式(II)的分离材料，其中Y选自：
通过还原性胺化反应、使用例如NaBH4作为还原剂、从通式(I)的化合物(其中X是–NH2或–CH(O))和固体载体(用部分–L*–FG官能化的A，其中官能团FG分别表示–CH(O)和–NH2(参见流程4f、g))起始，可以制备通式(II)的分离材料，其中Y选自–CH2–NH–和–NH–CH2–。
可以通过复分解反应或维悌希反应将通式(I)的化合物(其中X＝–CH＝CH2)固定于固体载体，得到通式(II)的分离材料，其中Y选自:
通式(I)的化合物(其中X＝–CH＝CH2或–SH)可以通过硫醇-烯化学固定于固体载体，得到通式(II)的分离材料，其中Y表示–S–CH2–CH2–或–CH2–CH2–S–。
所包括的以下实施例证明了本发明的优选实施方案。本领域技术人员应理解，在以下实施例中公开的技术代表由本发明人发现的在本发明实践中良好地发挥功能的技术，并且因此可以被认为构成了用于其实践的优选模式。然而，本领域那些技术人员应该依据本公开内容理解，所公开的特定实施方案中可以做出许多改变，并且仍获得相似或类似的结果而不背离本发明的精神和范围。
根据本说明书，本发明不同方面的其他修饰和替代实施方案对本领域技术人员来说将是显而易见的。因此，本说明书应被理解为仅是示例性的，并且其目的是用于教导本领域的技术人员执行本发明的一般方式。应当理解，本文所示和所述的本发明的形式将被视为实施方案的实例。元件与材料可被本文所示和所述的那些元素与材料所替代，可颠倒各部分和工艺并且可独立地利用本发明的某些特征，在受益于本发明的本说明书之后，所有这些对于本领域的技术人员而言都将是显而易见的。可在不背离以下权利要求书中所描述的本发明的实质和范围的情况下对本文所述的元素作出修改。
实施例
实施例1：N-[3-(二甲氨基)丙基]氨基甲酸苄基酯(1*)的合成。
在氩气气氛、0℃下向N-(苄氧基羰基氧基)琥珀酰亚胺(68.8g，0.276mol)在氯仿(300ml)中的搅拌的溶液中，滴加溶于氯仿(150ml)中的N',N'-二甲基丙-1,3-二胺(24.52g，0.24mol)，同时将该反应混合物温度保持在0℃。将该反应混合物在0℃搅拌2h，然后用氯仿(400ml)稀释，并用饱和的碳酸氢钠水溶液(3x 200ml)和饱和的氯化钠(2x 200ml)洗涤。将有机相经无水硫酸镁干燥，过滤，并在真空下浓缩，得到56g(98.7％)粘性油，为所需产物1*，将其原样用于下一个反应。MS m/z 236.31(M+H)+(236.15，计算值)。
实施例2：3-(苄氧基羰基氨基)丙基-(2-羟基乙基)-二甲基-溴化铵(2*)的合成。
向N-[3-(二甲氨基)丙基]氨基甲酸苄基酯(1*，56g，0.237mol，实施例1)在乙腈中的约1M溶液中加入2-溴乙醇(32.58g，0.261mol)，并将该反应混合物在室温温育，直至所有N-[3-(二甲氨基)丙基]氨基甲酸苄基酯被消耗(通过LC/MS和TLC监测)。向得到的3-(苄氧基羰基氨基)丙基-(2-羟基乙基)-二甲基-溴化铵溶液中加入5体积的甲基叔丁基醚。将该浑浊的混合溶液搅拌直至观察到相分离。通过倾析将上层有机相与3-(苄氧基羰基氨基)丙基-(2-羟基乙基)-二甲基-溴化铵分离，并再重复沉淀另外三次。最后，在真空下抽出微量溶剂后得到目标化合物，为粘性油状物(76.7g，89.6％，为氢溴酸盐)。通过LC/MS和TLC得知目标产物2*为均质的，并将其并未经进一步纯化地用于磷酸化步骤。MS m/z 281.33M+(281.19，计算值)。
实施例3：6-(苄氧基羰基氨基)己酸(3*)的合成。
向细粉状的6-氨基己酸(32.79g，0.25mol)在二氯甲烷(500ml)中的搅拌的混悬液中，加入三乙胺(63.24g，0.625mol)。然后，在剧烈搅拌下滴加三甲基氯硅烷(54.32g，0.5mol)，并将得到的混合物回流2h。然后将该反应混合物在冰浴上冷却，并加入氯甲酸苄基酯(95％，53.31g，0.313mol)。将得到的混合物在冰上搅拌60min，并在室温搅拌4h。除去溶剂后，将残余物在1000ml 4％(v/w)碳酸氢钠溶液和500ml甲基叔丁基醚之间分配。将水层分离，用2N盐酸酸化至pH 2.0，并用乙酸乙酯萃取三次。将合并的有机层经无水硫酸镁干燥，过滤，并浓缩，得到澄清的油状物(62.4g，94.1％)，为目标羧酸3*，通过LC/MS和TLC检测其是均质的，并将其未经进一步纯化地用于下一个步骤。MS m/z 265.33(M+1)+(265.13，计算值)。
实施例4：N-[6-[3-(二甲氨基)丙基氨基]-6-氧代-己基]氨基甲酸苄基酯(4*)的合成
向6-(苄氧基羰基氨基)己酸(3*，66.3g，0.25mol，实施例3)在干燥的二氯甲烷(500ml)中的溶液中加入催化量的二甲基甲酰胺(1.25ml)，并将该反应混合物在冰/盐浴上冷却至0℃。缓慢加入草酰氯(38.08g，0.3mol)在二氯甲烷(150ml)中的溶液，同时保持该反应混合物温度为0℃。将该反应混合物在室温搅拌2h。在真空下蒸发挥发物，并将残余物溶于干燥的二氯甲烷(500ml)中。将得到的溶液在冰/盐浴上冷却至0℃，在搅拌下滴加N,N-二甲基-1,3-丙二胺(25.55g，0.25mol)和三乙胺(55.65g，0.55mol)的混合物，并在2h的时间内冷却。将该反应混合物搅拌6h，并通过TLC和LC-MS监测该反应过程。将沉淀过滤，用少量二氯甲烷洗涤。然后，将该二氯甲烷溶液依次用饱和的碳酸氢钠、饱和的氯化钠洗涤，经无水硫酸镁干燥，并浓缩，得到N-[6-[3-(二甲氨基)丙基氨基]-6-氧代-己基]氨基甲酸苄基酯(4*,76.4g，87.4％)，为澄清的微黄油状物。将粗制的物质经LC/MS和TLC纯化，并未经进一步纯化地用于下一个步骤中。MS m/z249.13(M+1)+(349.24，计算值)。
实施例5：3-[6-(苄氧基羰基氨基)己酰氨基]丙基-(2-羟基乙基)-二甲基-溴化铵(5*)的合成。
向N-[6-[3-(二甲氨基)丙基氨基]-6-氧代-己基]氨基甲酸苄基酯(4*,56g，0.16mol，实施例4)在乙腈中的约1M溶液中加入2-溴乙醇(22.03g，0.176mol)，并将该反应混合物在室温搅拌直至所有N-[6-[3-(二甲氨基)丙基氨基]-6-氧代-己基]氨基甲酸苄基酯被消耗(通过LC/MS和TLC监测)。向得到的3-[6-(苄氧基羰基氨基)己酰氨基]丙基-(2-羟基乙基)-二甲基-溴化铵溶液中加入5体积的甲基叔丁基醚。将该浑浊的混合物溶液搅拌直至观察到相分离。通过倾析将上层有机相与3-[6-(苄氧基羰基氨基)己酰氨基]丙基-(2-羟基乙基)-二甲基-溴化铵分离，并再重复沉淀另外三次。最后，在真空下抽出微量溶剂后得到目标化合物，为粘性油状物(5*，66.3g，87.2％，为氢溴酸盐)。通过LC/MS和TLC得知产物为均质的，并将其并未经进一步纯化地用于磷酸化步骤。MS m/z 394.1M+(394.27，计算值)。
实施例6：N-[2-(2-羟基乙氧基)乙基]氨基甲酸苄基酯(6*)的合成。
将2-(2-氨基乙氧基)乙醇(25.23g，0.240mol)溶于530mL在MeOH中的10％三乙胺(48ml，0.345mol三乙胺，480ml甲醇)中，并冷却至0℃。立即加入全部氯甲酸苄基酯(工业级，95％，34.4ml，0.229mol)，并将该反应混合物升温至室温。12h后，通过蒸发除去溶剂，并使用硅胶柱色谱纯化产物(乙酸乙酯/己烷)，得到无色油状物(6*，52g，0.163mol，95％基于氯甲酸苄基酯)。经LC/MS和TLC分析得知粗制的物质为分析纯的，并未经进一步纯化地用于下一个步骤中。MS m/z 239.17(M+1)+(239.12，计算值)。
实施例7：N-[6-[2-(2-羟基乙氧基)乙基氨基]-6-氧代-己基]氨基甲酸苄基酯(7*)的合成。
将亚磷酸三甲酯(12.5g，0.101mol)在二氯甲烷(290ml)中的溶液在冰/盐浴上冷却。然后，分批加入粉状碘(25.6g，0.101mol)，同时将该反应混合物温度保持在0℃。在固体碘完全溶解后，相继加入6-(苄氧基羰基氨基)己酸(3*,25.5g，0.096mol，实施例3)和三乙胺(23.3g，0.23mol)，并将得到的溶液在冷却浴中在0℃搅拌20min。加入溶于二氯甲烷(50ml)中的2-(2-氨基乙氧基)乙醇(10.6g，0.101mol)，并将该反应混合物在0℃搅拌30min。除去冷却浴后，将该反应混合物在室温搅拌过夜。通过TLC和LC/MS监测反应进程。然后，将该反应混合物依次用10％(v/w)硫酸氢钠、饱和的氯化钠、饱和的碳酸氢钠洗涤，并经无水硫酸镁干燥。通过蒸发除去溶剂，并使用硅胶柱色谱纯化产物(乙酸乙酯/己烷)，得到无色油状物(34.7g，0.091mol，95.1％，基于6-(苄氧基羰基氨基)己酸)。将粗制的物质7*经LC/MS和TLC纯化，并未经进一步纯化地用于下一个步骤中。MS m/z 352.42(M+H)+(352.20，计算值)。
实施例8：甲磺酸2-[2-[6-(苄氧基羰基氨基)己酰氨基]乙氧基]乙基酯(8*)的合成。
在氩气下将N-[6-[2-(2-羟基乙氧基)乙基氨基]-6-氧代-己基]氨基甲酸苄基酯(7*，17.25g，0.049mol，实施例7)在亚甲基氯(115ml)中的溶液在冰-盐浴中冷却至-5℃。加入三乙胺(8.2ml，0.059mol)，并将得到的溶液在-5℃搅拌10min。滴加甲磺酰氯(4.5ml，0.059mol)，同时将该反应混合物温度保持在0℃至-5℃。添加完成后，将该反应混合物升温至室温。4h后，将该反应混合物用水、饱和的氯化钠洗涤，并再次用水洗涤。将有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。将粗制的物质8*经LC/MS和TLC纯化，并未经进一步纯化地用于下一个步骤中。MS m/z 430.52(M+H)+(430.18，计算值)。
实施例9：2-[2-[6-(苄氧基羰基氨基)己酰氨基]乙氧基]乙基-(2-羟基乙基)-二甲基-铵甲磺酸盐(9*)的合成。
历经20-30分钟向甲磺酸2-[2-[6-(苄氧基羰基氨基)己酰氨基]乙氧基]乙酯(8*，18.6g，0.043mol，实施例8)在乙腈中的1M溶液中加入2-(二甲氨基)乙醇(4.24g，0.048mol)。添加完成后，在持续搅拌下将得到的溶液回流直至所有的甲磺酸烷基酯被消耗。通过LC/MS和TLC监测反应进程。12h后，将该反应混合物冷却，并在真空下蒸发乙腈。将得到的混合物溶于200ml热的甲基叔丁基醚中。将该溶液缓慢冷却至室温，然后将其在0-5℃放置12h直至结晶完成。回收约19.7g(87.7％，为甲磺酸盐)白色固体，为目标醇9*。将粗制的物质经LC/MS和TLC纯化，并未经进一步纯化地用于下一个步骤中。MS m/z 424.55M+(424.28，计算值)。
实施例10：6-(1,3-二氧代异二氢吲哚-2-基)己酸(10*)的合成。
将6-氨基己酸(65.6g，0.5mol)、邻苯二甲酸酐(74.1g，0.5mol)和乙酸(115ml)的搅拌的混合物加热至回流达9h。通过过滤分离冷却后结晶的产物，用水洗涤若干次，并在真空下在100℃干燥，得到124.2g(95.1％)的6-(1,3-二氧代异二氢吲哚-2-基)己酸10*，通过LC/MS和TLC得知其是均质的，并未经进一步纯化地用于下一个步骤中。MS m/z 261.24(M+H)+(261.10，计算值)。
实施例11：2-[2-(2-羟基乙氧基)乙基]异二氢吲哚-1,3-二酮(11*)的合成。
向装备有机械搅拌器、氮气进气口-排气口和盖有回流冷凝器的迪安斯达克分水器的1L三颈圆底烧瓶中加入邻苯二甲酸酐(88.87g，0.6mol)和2-(2-氨基乙氧基)乙醇(63.08g，0.6mol)在甲苯(540ml)中的溶液。将该反应混合物回流直至在迪安斯达克分水器中收集到1当量的水(约24h)。24h后，在真空下除去甲苯，并将残余物溶于乙酸乙酯(550ml)中，并依次用10％(v/w)硫酸氢钠、饱和的氯化钠、饱和的碳酸氢钠洗涤，并经无水硫酸镁干燥。在真空下除去溶剂，并将残余物从甲基叔丁基醚中结晶。回收约130g(92.1％)白色固体，为目标醇11*。将粗制的物质经LC/MS和TLC纯化，并未经进一步纯化地用于下一个步骤中。MS m/z 235.27(M+H)+(235.08，计算值)。
实施例12：甲磺酸2-[2-(1,3-二氧代异二氢吲哚-2-基)乙氧基]乙酯(12*)的合成。
该实施例示例证明制备N-保护的2-(2-氨基乙氧基)乙醇的甲磺酸酯的方法。
在氩气下将2-[2-(2-羟基乙氧基)乙基]异二氢吲哚-1,3-二酮(11*,47.05g，0.2mol，实施例11)在亚甲基氯(300ml)中的溶液在冰-盐浴中冷却至-5℃。加入三乙胺(33.4ml，0.24mol)，并将得到的溶液在-5℃搅拌10min。滴加甲磺酰氯(18.6ml，0.24mol)，同时将该反应混合物的温度保持在0℃至-5℃。添加完成后，将该反应混合物升温至室温。4h后，将该反应混合物用水、饱和的氯化钠洗涤，并再次用水洗涤。将有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。将粗制的物质经LC/MS和TLC纯化，并未经进一步纯化地用于下一个步骤中。MS m/z 313.17(M+H)+(313.06，计算值)。
实施例13：2-[2-(1,3-二氧代异二氢吲哚-2-基)乙氧基]乙基-(2-羟基乙基)-二甲基-铵甲磺酸盐(13*)的合成。
历经20-30分钟向甲磺酸2-[2-(1,3-二氧代异二氢吲哚-2-基)乙氧基]乙酯(12*，32.53g，0.104mol，实施例12)在乙腈中的约1M溶液中加入2-(二甲氨基)乙醇(10.18g，0.114mol)。添加完成后，在持续搅拌下将得到的溶液回流直至所有的甲磺酸烷基酯被消耗。通过LC/MS和TLC监测反应进程。12h后，将该反应混合物冷却，并在真空下蒸发乙腈。将得到的混合物溶于150ml热乙腈中，随后向得到的溶液中加入200ml热甲基叔丁基醚。将该溶液缓慢冷却至室温，然后将其在0-5℃放置过夜直至完成结晶。回收约50.7g(92.6％，为甲磺酸盐)白色固体。将对应于目标化合物13*的粗制的物质经LC/MS和TLC纯化，并未经进一步纯化地用于下一个步骤中。MS m/z 307.07M+(307.17，计算值)。
实施例14：2-[2-(1,3-二氧代异二氢吲哚-2-基)乙氧基]乙基-(3-羟基丙基)-二甲基-铵甲磺酸盐(14*)的合成。
向甲磺酸2-[2-(1,3-二氧代异二氢吲哚-2-基)乙氧基]乙酯(12*，30.41g，0.097mol，实施例12)在乙腈中的约1M溶液中加入3-(二甲氨基)丙-1-醇(11.01g，0.107mol)。在20-30分钟之间的某个时间加入3-(二甲氨基)丙-1-醇。当加入所有物料，将得到的溶液在持续搅拌下回流直至所有的甲磺酸烷基酯被消耗。通过LC/MS和TLC监测反应进程。12h后，将该反应混合物冷却，并在真空下蒸发乙腈。将得到的混合物溶于120ml热乙腈中，随后向得到的溶液中加入200ml热的甲基叔丁基醚。将该溶液缓慢冷却至室温，然后将其在0-5℃放置过夜直至结晶完成。回收约46.1g(88.1％)白色固体。将对应于目标化合物14*的粗制的物质经LC/MS和TLC纯化，并未经进一步纯化地用于下一个步骤中。MS m/z 321.11M+(321.18，计算值)。
实施例15：Sepharose 6B的环氧-活化。
将Sepharose 6B(GE Healthcare Life Sciences)在玻璃过滤器-漏斗用3x 1000ml部分的水洗涤，并吸干。然后将100克吸干的Sepharose 6B与100ml的1,4-丁二醇二环氧甘油醚(CAS N°2425-79-8)和每毫升含2mg硼氢化钠的100ml的0.6M氢氧化钠溶液混合。将该混悬液在室温通过旋转混合8h，并通过在玻璃过滤器-漏斗用10x 400ml部分的热(40–60℃)水洗涤凝胶停止该反应。该凝胶的环氧乙烷含量为67μmol/g吸干的凝胶。
实施例16：用于测定环氧-基数量的测试。
将环氧-活化的Sepharose 6B与巯基乙酸反应，并根据Scoble,JA和Scopes,RK Journal of Chromatography A,1996,752,67中所述的方法通过滴定测定引入的酸基数量。
实施例17：叠氮化物-官能化的Sepharose 6B的合成
将10克吸干的环氧-活化的Sepharose 6B(实施例15)加入50ml叠氮化钠在水中的1M溶液中。在室温将该混合物在实验室旋转式混合机上温育24h。将该凝胶用4x 100ml水洗涤，并保持在20％(v/v)乙醇中至进一步使用。
实施例18：用于测定叠氮基-基团数量的测试。
通过与DTT反应将叠氮基Sepharose 6B的叠氮基定量还原为氨基(Handlon、AL和Oppenheimer,NJ,Pharmaceutical Research 1988,5,297)，并根据公开的方法用TNBS量化得到的氨基(Antoni,G等人Analytical Biochemistry 1983,129,60)。该方法基于基质与过量的2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)的反应和随后通过与甘氨酸反应对未反应的TNBS的定量测定。
实施例19：通过分光光度法测定游离的伯氨基。
使用在L-谷氨酸与邻苯二醛、N-乙酰基-L-半胱氨酸在室温和pH 9.5反应后生成的标准曲线直接测量伯氨基的量(Medina Hernandez,MJ等人Microchemical Journal 1990,42,288)。N-乙酰基-L-半胱氨酸衍生物是高度稳定的，且不需要反应时间的严格限制(不同于2-巯基乙醇)。发现335nm处的UV吸光度与氨基-基团的浓度呈线性关系。
实施例20：通过分光光度法测定游离的仲氨基。
使用化合物的该基团与硝普钠和乙醛的反应直接定量评估仲氨基的量(Lin,CML和Wagner,C Analytical Biochemistry 1974,60,278)。
实施例21：磷酸单2-[3-氨基丙基(二甲基)铵基]乙酯在环氧-活化的Sepharose 6B(分离材料1)上的固定。
磷酸化。
向保持在0℃至-10℃的磷酰氯(3.7g)在干燥的乙腈中的0.2M溶液中加入三乙胺(2.68g)。加入三乙胺后，历经30min滴加3-(苄氧基羰基氨基)丙基-(2-羟基乙基)-二甲基-溴化铵(2*，5.81g，实施例2)的约0.2M溶液，同时将该反应混合物的温度保持在0℃至-5℃。添加完成后，将该混悬液在室温再温育24h。通过LC/MS和TLC监测反应进程。将该盐酸三乙胺沉淀过滤，并在搅拌下向得到的溶液中加入水(1.8ml)，同时将温度保持在0-5℃。在真空下除去水-溶剂混合物，得到磷酸化产物，其纯度足够进行之后的脱保护和固定。
保护基团裂解。
在25℃向以上磷酸化产物在水(50ml)中的搅拌的溶液中加入10％活性炭载钯(10mol％)。将得到的混合物在25℃在H2(1atm)下搅拌24h，然后过滤。将催化剂用水(2x 10ml)洗涤，并将该澄清的溶液减压浓缩，过滤后得到具有高纯度的磷酸单2-[3-氨基丙基(二甲基)铵基]乙酯。
固定。
将20克吸干的环氧-活化的Sepharose 6B(实施例15)加入磷酸单2-[3-氨基丙基(二甲基)铵基]乙酯的溶液(40ml)中。用1M氢氧化钠溶液将得到的混悬液的pH调节至11.0。将该混合物在室温在实验室旋转式混合机温育24h。将该凝胶用4x 100ml高压灭菌的水洗涤，并保持在20％(v/v)乙醇中直至进一步使用。
实施例22：磷酸单2-[3-(6-氨基己酰氨基)丙基-二甲基-铵基]乙酯在环氧-活化的Sepharose 6B(分离材料2)上的固定。
磷酸化。
向保持在0℃至-10℃的磷酰氯(3.7g)在干燥的乙腈中的约0.2M溶液中加入三乙胺(2.68g)。加入三乙胺后，历经30min的时间滴加3-[6-(苄氧基羰基氨基)己酰氨基]丙基-(2-羟基乙基)-二甲基-溴化铵(5*，7.63g，实施例5)的约0.2M溶液，同时将该反应混合物的温度保持在0℃至-5℃。添加完成后，将该混悬液在室温再温育24h。通过LC/MS和TLC监测反应进程。将该盐酸三乙胺沉淀过滤，并在搅拌下向得到的溶液中加入水(1.8ml)，同时将温度保持在0-5℃。在真空下除去水-溶剂混合物，得到磷酸化产物，其纯度足够进行之后的脱保护和固定。
保护基团裂解。
在25℃向以上磷酸化产物在水(50ml)中的搅拌的溶液中加入10％活性炭载钯(10mol％)。将得到的混合物在25℃在H2(1atm)下搅拌24h，然后过滤。将催化剂用水(2x 10ml)洗涤，并将该澄清的溶液减压浓缩，过滤后得到具有高纯度的磷酸单2-[3-氨基丙基(二甲基)铵基]乙酯。
固定。
将20克吸干的环氧-活化的Sepharose 6B(实施例15)加入磷酸单2-[3-(6-氨基己酰氨基)丙基-二甲基-铵基]乙酯的溶液(40ml)中。用1M氢氧化钠溶液将得到的混悬液的pH调节至11.0。将该混合物在室温在实验室旋转式混合机温育24h。将该凝胶用4x 100ml高压灭菌的水洗涤，并保持在20％(v/v)乙醇中直至进一步使用。
实施例23：磷酸单2-[2-[2-(6-氨基己酰氨基)乙氧基]乙基-二甲基-铵基]乙酯在环氧-活化的Sepharose 6B(分离材料3)上的固定。
磷酸化。
向保持在0℃至-10℃的磷酰氯(3.7g)在干燥的乙腈中的约0.2M溶液中加入三乙胺(2.68g)。加入三乙胺后，历经30min的时间滴加2-[2-[6-(苄氧基羰基氨基)己酰氨基]乙氧基]乙基-(2-羟基乙基)-二甲基-铵甲磺酸盐(9*，8.36g，实施例9)的约0.2M溶液，同时将该反应混合物的温度保持在0℃至-5℃。添加完成后，将该混悬液在室温再温育24h。通过LC/MS和TLC监测反应进程。将该盐酸三乙胺沉淀过滤，并在搅拌下向得到的溶液中加入水(1.8ml)，同时将温度保持在0-5℃。在真空下除去水-溶剂混合物，得到磷酸化产物，其纯度足够进行之后的脱保护和固定。
保护基团裂解。
在25℃向以上磷酸化产物在水(50ml)中的搅拌的溶液中加入10％活性炭载钯(10mol％)。将得到的混合物在25℃在H2(1atm)下搅拌24h，然后过滤。将催化剂用水(2x 10ml)洗涤，并将该澄清的溶液减压浓缩，过滤后得到具有高纯度的磷酸单2-[3-氨基丙基(二甲基)铵基]乙酯。
固定。
将20克吸干的环氧-活化的Sepharose 6B(实施例15)加入磷酸单2-[2-[2-(6-氨基己酰氨基)乙氧基]乙基-二甲基-铵基]乙酯的溶液(40ml)中。用1M氢氧化钠溶液将得到的混悬液的pH调节至11.0。将该混合物在室温在实验室旋转式混合机温育24h。将该凝胶用4x 100ml高压灭菌的水洗涤，并保持在20％(v/v)乙醇中直至进一步使用。
实施例24：磷酸单2-[2-(2-氨基乙氧基)乙基-二甲基-铵基]乙酯在环氧-活化的Sepharose 6B(分离材料4)上的固定。
磷酸化。
向保持在0℃至-10℃的磷酰氯(3.7g)在干燥的乙腈中的约0.2M溶液中加入三乙胺(2.68g)。加入三乙胺后，历经30min的时间滴加2-[2-(1,3-二氧代异二氢吲哚-2-基)乙氧基]乙基-(2-羟基乙基)-二甲基-铵甲磺酸盐(6.47g，实施例13)的约0.2M溶液，同时将该反应混合物的温度保持在0℃至-5℃。添加完成后，将该混悬液在室温再温育24h。通过LC/MS和TLC监测反应进程。将该盐酸三乙胺沉淀过滤，并在搅拌下向得到的溶液中加入水(1.8ml)，同时将温度保持在0-5℃。在真空下除去水-溶剂混合物，得到磷酸化产物，其纯度足够进行之后的脱保护和固定。
保护基团裂解。
向以上磷酸化产物在水(50ml)中的搅拌的溶液中加入1M氢氧化钠直至该溶液的pH达到11.5。将得到的混合物在25℃搅拌1h，然后加入6M盐酸直至该溶液的pH达到2。将得到的混合物在25℃搅拌12h，然后将该反应混合物的pH调节至7。
固定。
将20克吸干的环氧-活化的Sepharose 6B(实施例15)加入磷酸单2-[2-(2-氨基乙氧基)乙基-二甲基-铵基]乙酯的溶液(40ml)中。用1M氢氧化钠溶液将得到的混悬液的pH调节至11.0。将该混合物在室温在实验室旋转式混合机温育24h。将该凝胶用4x 100ml高压灭菌的水洗涤，并保持在20％(v/v)乙醇中直至进一步使用。
实施例25：磷酸单3-[2-(2-氨基乙氧基)乙基-二甲基-铵基]丙酯在环氧-活化的Sepharose 6B(分离材料5)上的固定。
磷酸化。
向保持在0℃至-10℃的磷酰氯(3.7g)在干燥的乙腈中的约0.2M溶液中加入三乙胺(2.68g)。加入三乙胺后，历经30min的时间滴加2-[2-(1,3-二氧代异二氢吲哚-2-基)乙氧基]乙基-(3-羟基丙基)-二甲基-铵甲磺酸盐(14*，6.7g，实施例14)的约0.2M溶液，同时将该反应混合物的温度保持在0℃至-5℃。添加完成后，将该混悬液在室温再温育24h。通过LC/MS和TLC监测反应进程。将该盐酸三乙胺沉淀过滤，并在搅拌下向得到的溶液中加入水(1.8ml)，同时将温度保持在0-5℃。在真空下除去水-溶剂混合物，得到磷酸化产物，其纯度足够进行之后的脱保护和固定。
保护基团裂解。
向以上磷酸化产物在水(50ml)中的搅拌的溶液中加入1M氢氧化钠直至该溶液的pH达到11.5。将得到的混合物在25℃搅拌1h，然后加入6M盐酸直至该溶液的pH达到2。将得到的混合物在25℃搅拌12h，然后将该反应混合物的pH调节至7。
固定。
将20克吸干的环氧-活化的Sepharose 6B(实施例15)加入磷酸单3-[2-(2-氨基乙氧基)乙基-二甲基-铵基]丙酯的溶液(40ml)中。用1M氢氧化钠溶液将得到的混悬液的pH调节至11.0。将该混合物在室温在实验室旋转式混合机温育24h。将该凝胶用4x 100ml高压灭菌的水洗涤，并保持在20％(v/v)乙醇中直至进一步使用。
实施例26：对比实施例
磷酸(4-氨基苯基)2-(三甲基铵基)乙酯在环氧-活化的Sepharose6B(分离材料6)上的固定。
固定。
将20克吸干的环氧-活化的Sepharose 6B(实施例15)加入磷酸(4-氨基苯基)2-(三甲基铵基)乙酯的溶液中(4.41g，在40ml水中)。用1M氢氧化钠溶液将得到的混悬液的pH调节至11.5。将该混合物在室温在实验室旋转式混合机温育24h。将该凝胶用4x 100ml高压灭菌的水洗涤，并保持在20％(v/v)乙醇中直至进一步使用。
实施例27：亲和力的测定
结合和洗涤缓冲液：100mM Tris、pH 8,0、200mM氯化钠、2mM氯化铵。
洗脱缓冲液：100mM Tris、pH 8,0、200mM氯化钠、2mM EDTA。
所有色谱操作在室温进行。
将0.5g的各分离材料装入小柱中，并用12树脂床体积(6ml)的结合缓冲液平衡。将40–50ml人血清或血浆(CRP>0.1mg/ml)以1.2ml/min施加至各柱。用60树脂床体积的结合缓冲液(30ml)将未结合材料洗掉，直至OD280读数接近0基线。用洗脱缓冲液以1,2ml/min的速度洗脱亲和性树脂结合的蛋白质，并收集3.6ml级分。将收集的级分在4℃储存至SDS-PAGE测试。通过ELISA进行人C反应蛋白(CRP)的定量测定。
将结果在表1中总结。
表1。