一种抗胎盘样硫酸软骨素的嵌合抗原受体及其应用的制作方法

本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，尤其涉及一种抗胎盘样硫酸软骨素的嵌合抗原受体及其应用，具体为以肿瘤特异靶点pl-cs为基础的嵌合抗原受体t(car-t)细胞技术的构建方法及其在抗肿瘤治疗中的应用。

背景技术：

嵌合抗原受体t细胞(car-t)技术是目前在进行大规模临床试验的新型细胞疗法。在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。其基本技术是通过基因工程手段，将t细胞改造成不依赖hla的方式识别肿瘤抗原，使得car-t细胞相较于天然t细胞具有更强的识别和杀伤肿瘤细胞的能力。car-t的核心部件是car，car一般包括一个肿瘤相关抗原结合区，通常来源于肿瘤相关抗原的单克隆抗体scfv段；一个胞外铰链区；一个跨膜区和一个胞内刺激信号区。

car-t技术成功的关键是肿瘤抗原即靶点的选择。最理想的抗原是在肿瘤细胞表面高表达，在正常细胞不表达的抗原。只有选择这样的抗原，才会使car-t细胞专一的结合并杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞不结合，不会对正常组织造成伤害。但这样理想的抗原并不多，大多数抗原是在肿瘤组织中高表达或者过度表达，在正常组织中低表达。目前，car-t在实体肿瘤的治疗远不及白血病的治疗效果，其原因之一就是各实体瘤的中均没有找到非常理想的靶标。

car-t技术用于治疗实体瘤的效果不好的另一个原因是肿瘤免疫抑制微环境的存在。肿瘤免疫抑制微环境是肿瘤发生发展过程中形成的内环境，由肿瘤细胞，间质细胞，免疫调节细胞，微血管，组织液，细胞因子，细胞外基质等 组成。由于免疫微环境的存在，免疫杀伤细胞无法有效到达肿瘤细胞部位或者到达目标部位后无法对肿瘤细胞进行有效的杀伤。car-t细胞要对实体瘤进行有效的治疗，必需突破肿瘤免疫微环境限制，进入实体瘤实现对肿瘤细胞的杀伤。

cn104788573a公开了一种嵌合抗原受体hcd19scfv-cd8α-cd28-cd3ζ及其用途，该嵌合抗原受体由抗人cd19单克隆抗体hi19a轻链和重链可变区(hcd19scfv)、人cd8α铰链区、人cd28跨膜区和胞内区、以及人cd3ζ胞内区结构串联构成。该嵌合抗原受体用于修饰t淋巴细胞，修饰后的t细胞(car-t细胞)能用于表面cd19阳性的肿瘤的治疗。该专利的嵌合抗原受体只针对于表面cd19阳性的肿瘤，且识别效果不好，因此，筛选合适的肿瘤靶标，同时还能突破肿瘤微环境，是car-t技术治疗实体瘤的关键。

硫酸软骨素(cs)是共价连接在蛋白质上形成蛋白聚糖的一类糖胺聚糖。硫酸软骨素广泛分布于动物组织的细胞外基质和细胞表面，糖链由交替的葡萄糖醛酸和n-乙酰半乳糖胺(又称n-乙酰氨基半乳糖)二糖单位组成，通过一个似糖链接区连接到核心蛋白的丝氨酸残基上。硫酸软骨素存在于从线虫到人除植物外的所有生物中，发挥着许多重要的生理功能。虽然多糖的主链结构并不复杂，但就硫酸化程度、硫酸基和两种差异向异构糖醛酸在链内的分布来说，呈现高度的不均一性。硫酸软骨素的精细结构决定着功能的特异性和与多种蛋白质分子的相互作用。

胎盘中存在着一种特殊的硫酸软骨素，其糖基化模式与常规的硫酸软骨素不同，疟原虫中存在一种名为var2csa蛋白，可以特异的结合胎盘中的硫酸软骨素，而在肿瘤细胞的表面，存在着胎盘样硫酸软骨素(pl-cs)，因此，pl-cs是car-t技术治疗肿瘤的最理想靶点。

技术实现要素：

针对目前car-t技术治疗肿瘤中靶点选择不十分理想，以及肿瘤微环境影响car-t技术治疗效果的情况，本发明提供一种抗胎盘样硫酸软骨素的嵌合抗原受体及其应用，所述嵌合抗原受体，可以更特异的识别肿瘤细胞，对肿瘤微环境具有更好的靶向性。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种抗胎盘样硫酸软骨素的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体主要包括抗pl-cs的抗原识别区、铰链区、跨膜区和胞内区串联构成；

其中，所述抗pl-cs的抗原识别区为疟原虫蛋白var2csa、疟原虫蛋白var2csa的部分肽段或pl-cs抗体中的任意一种；

所述疟原虫蛋白var2csa的部分肽段为疟原虫蛋白var2csa中的氨基酸数量大于500的肽段。

本发明中，所述疟原虫蛋白var2csa的部分肽段指的是疟原虫蛋白var2csa中的氨基酸数量大于500的肽段，可以是疟原虫蛋白var2csa中的任意500个氨基酸或是500个氨基酸以上的肽段都是可行的。本发明中，疟原虫蛋白var2csa、疟原虫蛋白var2csa的部分肽段id1-id2a和pl-cs抗体均可以特异性结合pl-cs，pl-cs几乎存在于所有类型的肿瘤细胞表面，而正常细胞的表面不存在pl-cs；选择pl-cs为肿瘤的特异性靶点，以var2csa作为car的识别结构域来识别肿瘤的pl-cs，通过var2csa识别pl-cs的方式，可以使car-t细胞特异的识别肿瘤细胞，更容易靶向到肿瘤微环境，进入到肿瘤组织内部，而不会对正常的细胞和组织造成伤害；此外，pl-cs还是肿瘤细胞外基质的组成部分，是形成肿瘤微环境的物质基础，选择pl-cs为靶点，有利 于car-t细胞突破肿瘤免疫抑制微环境。

优选地，所述疟原虫蛋白var2csa为疟原虫pf3d7的var2csa蛋白和/或疟原虫pffcr3的var2csa蛋白。

优选地，所述疟原虫pf3d7的var2csa蛋白的氨基酸序列为seqidno.3，核酸序列为seqidno.4。

优选地，所述疟原虫pffcr3的var2csa蛋白的氨基酸序列为seqidno.5，核酸序列为seqidno.6。

优选地，所述疟原虫蛋白var2csa的部分肽段为id1-id2a，所述id1-id2a的氨基酸序列为seqidno.7，核酸序列为seqidno.8。

本发明中，所述id1-id2a是这个部分肽段中，长度比较小，是效果最好的一段。

优选地，所述铰链区为人cd8α铰链区。

优选地，所述人cd8α铰链区的氨基酸序列为seqidno.9，核酸序列为seqidno.10。

优选地，所述跨膜区为人cd28跨膜区。

优选地，所述人cd28跨膜区的氨基酸序列为seqidno.11，核酸序列为seqidno.12。

作为优选技术方案，所述胞内区为人cd3ζ胞内区、人cd28胞内区或人4-1bb胞内区中的任意一种或至少两种的组合，例如可以是cd3ζ胞内区、人cd28胞内区、人4-1bb胞内区、人cd28胞内区与人cd3ζ胞内区的串联、人4-1bb胞内区与人cd3ζ胞内区的串联、人cd3ζ胞内区与人4-1bb胞内区的串联或人cd28胞内区、人4-1bb胞内区与人cd3ζ胞内区的串联，优选为cd3ζ胞内区、人cd28胞内区与人cd3ζ胞内区的串联、人4-1bb胞内区与人cd3ζ 胞内区的串联或人cd28胞内区、人4-1bb胞内区与人cd3ζ胞内区的串联。

优选地，所述人cd3ζ胞内区的氨基酸序列为seqidno.13，核酸序列为seqidno.14。

优选地，所述人cd28胞内区与人cd3ζ胞内区的串联的氨基酸序列为seqidno.15，核酸序列为seqidno.16。

优选地，所述人4-1bb胞内区与人cd3ζ胞内区的串联的氨基酸序列为seqidno.17，核酸序列为seqidno.18。

优选地，所述人cd28胞内区、人4-1bb胞内区与人cd3ζ胞内区的串联的氨基酸序列为seqidno.19，核酸序列为seqidno.20。

优选地，所述嵌合抗原受体的氨基末端含有一个人cd8α信号肽。

优选地，所述人cd8α信号肽的氨基酸序列为seqidno.21，核酸序列为seqidno.22。

作为优选技术方案，所述嵌合抗原受体由人cd8α信号肽、var2csa、人cd8α铰链区、人cd28跨膜区和胞内区、人4-1bb胞内区以及人cd3ζ胞内区串联构成。

优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列为seqidno.1，核酸序列为seqidno.2。

优选地，所述的嵌合抗原受体通过其编码的核酸序列转染到t细胞中表达。

优选地，所述转染的方式为病毒载体、真核表达质粒或mrna序列中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述病毒载体为慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体中的任意一种或至少两种的组合。

第二方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包括第一方面所述的嵌合抗原受体。

第三方面，本发明提供如第一方面所述的嵌合抗原受体和/或如第二方面所述的组合物在制备嵌合抗原受体t细胞及其在肿瘤治疗药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的嵌合抗原受体，通过var2csa识别pl-cs的方式，可以使car-t细胞特异的识别肿瘤细胞，更容易靶向到肿瘤微环境，进入到肿瘤组织内部，可以更特异的识别肿瘤细胞，对肿瘤微环境具有更好的靶向性；

(2)本发明表达此嵌合抗原受体的t细胞能最大程度的杀伤肿瘤细胞，对正常组织的伤害程度很小，能突破肿瘤免疫抑制微环境，从而对实体瘤具有更好的疗效，且几乎能治疗各种类型的肿瘤。

附图说明

图1为靶向pl-cs的car慢病毒表达载体示意图；

图2(a)为荧光显微镜下观察慢病毒感染96h后t细胞的绿色荧光(gfp)表达情况，图2(b)为流式细胞仪显示慢病毒感染96h后t细胞的gfp阳性率；

图3(a)为实验组、阴性对照组和野生型t细胞组上清中il-2浓度比较，图3(b)为实验组、阴性对照组和野生型t细胞组上清中ifn-γ浓度比较，图3(c)为实验组、阴性对照组和野生型t细胞组上清中tnf-α浓度比较；

图4(a)为在不同效靶比例情况下，实验组、阴性对照组和野生型t细胞组对肺癌细胞系a549的细胞毒性比较，图4(b)为在不同效靶比例情况下，实验组、阴性对照组和野生型t细胞组对肝癌细胞系huh-7的细胞毒性比较，图4(c)为在不同效靶比例情况下，实验组、阴性对照组和野生型t细胞组对人成骨肉瘤细胞系mg63的细胞毒性比较，图4(d)为在不同效靶比例情况下，实验组、阴 性对照组和野生型t细胞组对人结肠癌细胞系colo205的细胞毒性比较。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例1：靶向pl-cs的car基因序列的确定

从genbank数据库以及文献中搜索到疟原虫var2csa基因、人cd8α信号肽基因、人cd8α铰链区基因、人cd28跨膜区和胞内区基因、人4-1bb胞内区基因以及人cd3ζ胞内区基因序列。将其进行密码子优化，保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞表达。

各基因序列信息见sequencelisting(序列表seqidno.1-22)。

实施例2：慢病毒表达载体plhlenticar004的构建

将上述基因序列依次按人cd8α信号肽基因、var2csa、人cd8α铰链区基因、人cd28跨膜区和胞内区基因、人4-1bb胞内区基因以及人cd3ζ胞内区基因序列进行连接，组成嵌合抗原受体，所述抗原受体的核酸序列如seqidno.2所示，引入合适的酶切位点，进行人工全基因合成，克隆到慢病毒表达载体中得到plhlenticar004质粒。质粒示意图见图1。

将重组质粒送上海英骏生物技术有限公司进行测序，测序结果与拟合成的序列比对以证实序列完全正确。

实施例3：慢病毒表达载体和包装载体的大量提取

将plhlenticar004质粒以及pspax2和pmd2.g包装质粒的stbl3大肠杆菌在lb培养液中大量培养，以碱裂解法大量提取质粒，以备转染，具体过程为：

1)分别将带有plhlenticar004、pspax2、pmd2.g的stbl3大肠杆菌种接 种于含有500mllb/抗生素培养液的培养瓶中，37℃摇床培养12-16小时；

2)3000*g离心10min，收集菌体，倒掉培养基并反扣于吸水纸轻轻拍打以吸尽残液。收集的菌体采用广州美基生物科技有限公司maxpureplasmidmaxikit大提质粒，提取质粒的具体步骤为：

(1)加入20mlbufferp1/rnasea至菌体中，涡旋重悬细菌(确保细菌完全重悬，重悬后的溶液没有细胞团块)；向重悬液中加入20mlbufferp2，颠倒混匀10-15次，静置1-2min(一定要轻轻混匀，注意操作时间不能超过4分钟)；

(2)向裂解液中加入20mlbuffere3，立即颠倒混匀15-20次，混匀过程要轻柔而充分，中和充分的标准是：溶液变得不粘稠，沉淀物分散显白色；3000*g离心10min，然后转移上清液至新的离心管中，加入1/3倍体积buffere4至上清液中，涡旋混匀；

(3)将maxpuremicrocolumn套在50ml离心管中，转移15ml混合液至柱子中，3000*g离心10min；倒掉流出液，把柱子套回收集管中，继续转移剩下的溶液至柱子中，3000*g离心10分钟；倒掉流出液，把柱子套回收集管中，加入20mlbuffere5至柱子，3000*g离心10分钟；倒掉滤液把柱子套回收集管中；

(4)加入20mlbufferpw2(已用无水乙醇稀释)至柱子，3000*g离心10分钟；倒掉滤液把珠子套回收集管中，加入20mlbufferpw2(已用无水乙醇稀释)至柱子，3000*g离心10分钟；倒弃滤液把柱子套回收集管中，4000*g离心10分钟；

(5)把柱子套在灭菌的50ml离心管中，加入30-200ml灭菌水至柱子的膜中央，静置2分钟，10000*g离心5min，收集分离液；

(6)进一步抽提去除内毒素，用灭菌水调整质粒浓度在0.1g-0.6mg/ml之 间；

(7)加入0.1倍体积bufferer1和0.1倍体积bufferer2至质粒溶液中，颠倒混匀；冰上放置20min，期间颠倒混匀多次；42℃水浴5min后室温在10000*g速度下离心3min；

(8)轻轻取出样品，发现底部形成了一层红色的溶液，小心把上清液转移到离心管仲，加入0.7倍体积的异丙醇至上清液中，颠倒混匀多次；室温下，在10000*g速度下离心10min，倒掉上清液，加入1倍体积的70％乙醇至沉淀中。涡旋混匀15-30s；室温下，在10000*g速度下离心3min，小心倒掉上清液；室温下，在10000*g速度下离心1min收集管壁上的液滴，不要吸到沉淀，在空气中干燥10min；

(9)加入适量无菌水到质粒中，涡旋10-20s混匀，室温静置30min让质粒充分溶解，期间颠倒混匀多次；

在nanodrop紫外分光光度计上测量质粒浓度，然后将质粒保存在-20℃中。

实施例4：慢病毒的包装、浓缩和滴定

1)慢病毒的包装

(1)细胞预板：在转染前24h，取长满的293t细胞进行预板，以第二天能达到70％汇合度为宜(75mm培养皿内预板500万)。

(2)第二天：转染

(a)观察预板细胞的生长情况，以细胞的汇合度在90％左右为宜，吸去培养基，加入新鲜预热的完全培养基(75mm培养皿内15ml)；

(b)转染前将转染所需的pei、质粒、opti-memireducedserummedium等放置室温平衡；

(c)制备质粒的混合液：本次包装共10皿293t细胞，每一皿细胞准备混 合液500μl，故需准备混合液总体积为5ml；先根据各种质粒用量加入三种质粒，共420μg(plhlenticar004:pspax2:pmd2.g＝3:2:1)，加入opti-memireducedserummedium调整体积到2.5ml，吹打混匀后室温放置10min；再取pei和opti-memireducedserummedium各1.25ml，混匀后室温放置10min，最后将以上两种溶液混合，混匀后室温放置10min，即为转染用的混合液；

(d)混合液逐滴加入培养皿中，每皿500μl；

(3)转染6h以后，需把每皿培养基换成17mlultracluture无血清培养基；

(4)第三至五天，病毒的收集：转染48h-72h，分别收集培养上清，收集的病毒上清暂存于4℃。

2)慢病毒浓缩

将收集的培养上清用0.45um的膜过滤后用sw-32ti的转子25000rpm(对应离心力为106750g)，4℃离心2h，去上清后，用200ul的pbs重悬，保存于-80℃。

3)慢病毒的滴定

(1)6孔板中预铺板293t细胞，3×10⁵cells/well，37℃5％co2培养箱中培养过夜(大约18-20h)；

(2)配制polybrene母液：灭菌纯水，8mg/ml，0.22μm滤头过滤，分装，保存于-20℃备用；

(3)配制含polybrene的dmem培养基：10％fbs，1％双抗，8μg/mlpolybrene(培养基体积的千分之一)；

(4)融化病毒：从-80℃取出病毒冻存液，在室温融化，融化后置于冰上拿进细胞间备用；

(5)稀释病毒：用配好的含polybrene的5％fbsdmem完全培养基将病 毒原液进行10倍稀释，得到10^-1-10^-4的病毒稀释液，注意每次吸取病毒液进行下一步稀释前要混匀；

(6)弃掉旧培养基，第一孔中加入1ml不含病毒的培养基作为阴性对照。其余每孔中加入1ml对应的病毒稀释液，37℃培养18-20h；

(7)第二天早上去掉含病毒的培养基，替换以2ml不含聚凝胺的5％fbsdmem培养基；显微镜下观察细胞有表达gfp；

(8)吸去培养基，然后用胰酶消化细胞；将细胞吹成单个细胞，加入适量完全培养基终止胰酶反应，300g离心3min收集细胞；

(9)倒去上清，用适量预冷pbs重悬后，300g离心3min，收集细胞，再重复一次；

(10)最后用1ml预冷pbs重悬，置于冰上，用于流式分析。

(11)选择gfp阳性率在1％-20％的孔，各孔分别计算病毒滴度，最后取平均值；

计算公式：titer＝{(f×cn)/v}×df，单位为tu/ml；

其中，f：gfp阳性细胞率；cn：每孔铺板的细胞数量；v：所加入病毒稀释液体积；df：病毒稀释倍数

计算得到病毒滴度为：1.6×10⁸-1×10¹⁰之间。

实施例5：t细胞的分离，培养和感染

1)pbmc细胞的分离

(1)采血50ml，800g离心10min(加速设置为3，降速设置为4)；

(2)取白细胞层，用2％fbs稀释至8ml；

(3)吸取4mllymphoprep加入15ml离心管中，再将稀释血液小心沿管壁加至分层液上，保持两者界面清晰；

(4)800g离心20min(加速设置为6，降速设置为1)；

(5)用巴氏吸管轻轻吸出灰白色的单个核细胞，加入另一支已含有10mlrf-10的离心管中，混匀；

(6)以500g离心5min，弃上清；

(7)加10mlrf-10重悬细胞，trypanblue计数，350g离心10min，弃上清。

2)磁珠分选cd4+t(cd8+t)细胞

(1)涡旋混匀磁珠，取25μl磁珠于试管中，加入1mlbuffer1混匀，将试管放在磁力架上1min，去上清。加25μlbffer1重悬磁珠备用；

(2)pbmc用buffer1重悬至密度为107个/ml；

(3)向1ml的pbmc中加入25μl洗涤的磁珠，2-8℃孵育20min，放在摇床上倾斜旋转；

(4)将试管放在磁铁上2min，收集上清；

(5)移开试管，加1mlbuffer1，吹打混匀，放在磁珠上2min，收集上清，重复一次；

(6)加100μlbuffer2重悬细胞，加10μldetchabead，室温下孵育45min使细胞从磁珠上释放；

(7)将试管放在磁力架上1min，含有细胞的上清转移到新的试管中，加500μlbuffer2洗涤磁珠2-3次，收集上清；

(8)加4mlbuffer2，350g离心5min，去上清，用buffer2重悬细胞；

(9)分选cd4+t细胞过程中收集的上清按试剂盒操作收集cd8+t细胞。

3)t细胞的培养

(1)磁珠分选后的cd4+t(cd8+t)细胞350g离心10min；

(2)rf-10重悬计数；

(3)按照1：1的比例加cd4+t和cd8+t细胞培养板中培养，细胞密度为5×10⁵个/ml；

(4)在t细胞专用培养基加入cd3/cd28抗体磁珠，加入磁珠的量按与细胞的比例1:1加入；

(5)加rhil-2，使终浓度为10ng/ml；

(6)每周计数2-3次，记录细胞的增殖情况。

4)t细胞的慢病毒转染。

(1)磁珠分选后的cd4+t(cd8+t)细胞350g离心10min，加完全培养基重悬计数；

(2)按照1：1的比例加cd4+t和cd8+t细胞于96孔板中培养，细胞密度为5×10⁵个/ml，每孔细胞数为1×10⁵个；

(3)洗涤磁珠，向培养皿中加入与细胞1:1比例的磁珠；

(4)加rhil-2，使终浓度为10μg/l；

(5)刺激24h后，感染细胞，加polybrene，使终浓度为6μg/ml，混匀；

(6)16-24h后换液；

(7)3天后进行荧光显微镜拍照。

荧光显微镜的结果图如图2(a)，流式检测感染效率如图2(b)所示，可见，流式检测的感染效率为50％左右，可以高效制得car-t细胞。

实施例6：car-t细胞体外细胞因子释放及检测

(1)48孔板中，每孔car-t细胞1.5×10⁵个与huh7细胞每孔1.5×10⁵个共培养24h，加500μlrpmi-1640培养基(不含血清和rhil-2)；

(2)样品收集和储存：离心收集上清，直接开始实验或分装保存于-20℃ (100μl每管)；

(3)试剂准备：使用前将所有试剂拿出恢复至室温，用去离子水将washbuffer浓缩液稀释至500ml；底物显色液，将a与b等体积混合，15min内用完，每孔200μl混合液；细胞因子标准品，去500μl储存液，梯度浓度稀释6组；

(4)将样品以及浓度梯度稀释的标准品加入已包被抗体的elisa孔板中，100μl每孔，除去气泡室温孵育2h(样品每组设三个复孔)；

(5)移去孔内液体，每孔加300μlwb洗涤，洗涤三次，最后一次吸干wb；

(6)加200μl对应的检测抗体，室温孵育2h；

(7)移去孔内液体，每孔加300μlwb洗涤，洗涤三次，最后一次吸干wb；

(8)加200μl底物液，室温孵育20min(避光)；

(9)加50μl终止液，溶液由蓝色变为黄色，如果颜色为绿色或者没有改变颜色，轻拍使其混匀；

(10)30min内检测450nm处的吸光度；

(11)根据标准曲线计数各细胞因子浓度，

结果如图3(a)，3(b)和3(c)所示，可见，car-t细胞与肿瘤细胞共培养释放了大量的细胞因子，表明car-t细胞对肿瘤细胞产生了强烈的免疫反应。

实施例7：car-t细胞体外杀伤肿瘤细胞

1)确定最佳的细胞铺板浓度

(1)收集各肿瘤细胞，用分析培养基洗涤，调整细胞浓度为1×10⁵个/ml；

(2)在96孔板中加100μl分析用培养基，铺满；

(3)加100μl细胞悬液于96孔板中，依次稀释，最后一个浓度梯度吸出100μl细胞悬液。设置六个复孔，三孔为highcontrol组，三孔为lowcontrol 组，并设置三孔无细胞的分析培养基作为backgroundcontrol(量程，500-50000)；

(4)培养箱孵育18h；

(5)hc组每孔加入5μl细胞溶解液，孵育15min，震动加速细胞溶解；

(6)每孔加入100μl现配的反应液，15℃-25℃孵育30min(注意96孔板避光)；

(7)每孔加入50μl终止液，震动10s；

(8)490nm测吸光度；

(9)分析数据，确定最佳细胞浓度(hc与lc的最大差值)。

2)细胞介导的毒性检测

(1)收集car-t细胞，用分析培养基洗涤细胞；

(2)根据不同的效靶比和1)中结果的最佳浓度来确定铺于96孔板中的car-t细胞数；

(3)在96孔板中铺的相应细胞悬液每孔体积调为50μl；

(4)收集各肿瘤细胞，调整细胞浓度为最佳浓度的2倍，加50μl细胞悬液于t细胞中；

(5)设置不同对照组；

(6)37度培养箱孵育18h；

(7)每孔加入5μl细胞溶解液，孵育15min，震动加速细胞溶解；

(8)每孔加入100μl现配的反应液，15℃-25℃孵育30min(注意96孔板避光)；

(9)每孔加入50μl终止液，震动10s；

(10)490nm测吸光度；

(11)计算每个样品细胞毒性的百分比。

结果如图4(a)-4(d)所示，可见，car-t细胞具有对肿瘤细胞的毒性，能高效的杀伤肿瘤细胞。

综上所述，本发明表达此嵌合抗原受体的t细胞能最大程度的杀伤肿瘤细胞，对正常组织的伤害很小，能突破肿瘤免疫抑制微环境，从而对实体瘤具有更好的疗效，且几乎能治疗各种类型的肿瘤。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。