技术领域本申请涉及分子标记技术领域，具体涉及一种棉蚜的微卫星标记组合及其引物和应用。
背景技术：
棉蚜AphisgossypiiGlover是广泛分布于世界各国的一种常见害虫，其植物寄主广泛，目前记载的世界范围内的棉蚜寄主植物多达76科285种。在我国大部分地区，棉蚜为完全世代，即以卵在越冬寄主的枝条上越冬，第二年春天迁移到夏寄主上为害，以孤雌生殖方式进行繁殖，秋末迁回冬寄主，孤雌生殖繁殖数代后，产生性蚜，交配后产卵。木槿、石榴和花椒是已报道的棉蚜在黄河流域主要越冬寄主；棉花和葫芦科瓜类为棉蚜的主要侨居寄主。棉蚜的繁殖能力很强，平均气温稳定在12℃以上就开始繁殖，在夏季一个世代只需4-5天，每龄期只需1天。一头雌蚜一生可产若蚜60-70头，多者100头。棉蚜在长期的进化和取食过程中，种群间出现明显的遗传多样性，最明显的例子就是不同国家或地区的棉蚜已分化形成了明显的寄主专化型。在美国，木槿、木豆和棉花上棉蚜为一种专化型，黄瓜上为另一种寄主专化型；荷兰有黄瓜和菊花两种寄主专化型；在我国，棉蚜表现出了瓜类和棉花寄主上的显著分化。具有不同遗传背景的棉蚜在寄主偏好、环境适应、生长发育、寄主选择和生理生化等方面具有明显的差异，而二者外形几乎没有差异。在生产实践和科学研究过程中，需要对棉蚜按照遗传背景进行分类，从而进行针对性的研究，制定不同的治理策略。分子标记是对生物进行遗传背景分类的重要工具，如今较成熟的技术是微卫星分子标记检测，该方法针对于广泛分布于真核生物基因组的微卫星分子标记，该检测方法具有多态性高，特异性好，共显性遗传，成本低，通量高等优点。开发棉蚜微卫星标记对于进行棉蚜的遗传背景分类具有重要意义，同时也可应用于棉蚜谱系地理格局、群体结构和遗传多样性的分析。
技术实现要素：
本发明的目的是提供高通量、准确高效的棉蚜微卫星标记组合，包括19个棉蚜微卫星标记：Ago34、Ago40、Ago47、Ago55、Ago91、Ago96、Ago98、Ago100、Ago127、Ago133、Ago139、Ago141、Ago148、Ago151、Ago156、Ago161、Ago170、Ago184、Ago188；所述19个棉蚜微卫星标记的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1-19所示。本发明所述的19个棉蚜微卫星标记是申请人通过创造性劳动筛选获得的能够通过组合使用显著的反映棉蚜的遗传背景的棉蚜微卫星标记，上述19个棉蚜微卫星标记具有以下优点：(1)多态性高在棉田79头棉蚜中，19个棉蚜微卫星标记的多态性数量为2-16个，所有标记均表现出扩增稳定性和较好的多态性。(2)片段大小间隔适当，易于检测所述19个标记的扩增片段长度均介于94-209bp之间，所选各标记长度间隔差异适当，利用所述荧光标记，易于同时检测，实现高通量分型。(3)标记间不连锁19个标记分布在多条染色体上，即便在在同一条染色体上的标记间遗传距离较远，处于连锁不平衡状态的可能性非常低。可以理解的是，选取所述棉蚜微卫星标记组合中的至少4-8个所形成的组合也能够在相当程度上实现棉蚜遗传背景、谱系地理结构、群体结构和遗传多样性的分析，这样的组合也应属于本发明的保护范围。而利用本发明的19种棉蚜微卫星标记所形成的棉蚜微卫星标记组合能够更好的实现棉蚜遗传背景、谱系地理结构、群体结构和遗传多样性的分析。本发明的另一个目的是提供一种棉蚜微卫星引物组，包括SEQIDNO.20-57所示的引物。所述棉蚜微卫星引物组分别用于扩增和/或检测棉蚜微卫星标记Ago34、Ago40、Ago47、Ago55、Ago91、Ago96、Ago98、Ago100、Ago127、Ago133、Ago139、Ago141、Ago148、Ago151、Ago156、Ago161、Ago170、Ago184、Ago188。具体的，各个棉蚜微卫星标记的引物如下所示：微卫星位点Ago34的引物：F：GCTGCAGGTGATTGTGGAC；R：GTCGTCGTCTTCCGACCA。微卫星位点Ago40的引物：F：GAGTTTCCGGGACTCTGGTT；R：AGTAGTGTAAACCAACGGCTACG。微卫星位点Ago47的引物：F：ATTTATCGTGTATACCTACGGCG；R：CGAGCACGCAATTAAAAATAACA。微卫星位点Ago55的引物：F：CACGACCATTGTCCCGTC；R：GTCTCGGGTAAAACAGTGACGAT。微卫星位点Ago91的引物：F：AAACTTCTGCCTCCTCCTCTAC；R：CAAGGTGATGATTGGGGTAGTAA。微卫星位点Ago96的引物：F：ATCGGTGTGTCTGTCTGCTCTA；R：TCCGTCGACATAATATTTACGCT。微卫星位点Ago98的引物：F：ACAGAGTTTTCGAGTGTGGAG；R：CGAAATAATTTTCATCGACAACG。微卫星位点Ago100的引物：F：ACTGTACGACAATCGGTCAAATG；R：CGAATCCAGGACGAATAAAGTT。微卫星位点Ago127的引物：F：AGAAGACGCACTACCCGAAGTT；R：CTCCAAAATTACCCAACCCTC。微卫星位点Ago133的引物：F：GATAGTTCAGGTGACTCAGACGG；R：ATCACAGGCACTACCAACCC。微卫星位点Ago139的引物：F：GAACTCGCCCGAGTAGATGAC；R：GCCGGATGACAGACGAGT。微卫星位点Ago141的引物：F：TATCAGTGCACGTGTTTGAAAAT；R：GCTTCTGTTGCTGCAAACATC。微卫星位点Ago148的引物：F：GTTTGGCGTGGTCATCATC；R：ACAAGGAGAATGACGTGAAACC。微卫星位点Ago151的引物：F：ATACCCCAACAAGTACACTACGC；R：ATGCTCTGCGACGGTTTTAC。微卫星位点Ago156的引物：F：AAACAACAGCAACAGAAGAGCAC；R：CTGCTGGTGCAGGTGTAAGC。微卫星位点Ago161的引物：F：AAAGTGAACACCGAACAGTGAAC；R：CAAGAAAATCGAGTTCTCCTTCA。微卫星位点Ago170的引物：F：TTCAACACTTGAACAACAATACGA；R：ATTCCCTGTCCAACATACATACG。微卫星位点Ago184的引物：F：ATCAGATGGTTCTGGTTGTTCTG；R：CCTACAACCAACAGGTGTCCATA。微卫星位点Ago188的引物：F：AGCTGCAACAGCACAACAACTA；R：GTAAACTTCTTGTTGGCCACG。本发明的第三个目的是提供一种用于检测棉蚜微卫星标记组合的试剂盒，所述试剂盒含有用于扩增和/或检测棉蚜微卫星标记的引物组，所述引物组包括SEQIDNO.20-57示引物。所述试剂盒还包括以下试剂中的一种或几种：PCR缓冲液，Mg2+、DNA聚合酶、dNTPs。所述试剂盒可以用于进行棉蚜遗传背景、谱系地理结构、群体结构和遗传多样性的分析。本发明的第四个目的是提供一种棉蚜微卫星标记的检测方法，包括以下步骤：(1)提取棉蚜基因组DNA；(2)合成SEQIDNO.20-57所示的引物，并使用荧光染料对正向引物5’端进行标记，获得荧光标记后的棉蚜微卫星引物组；(3)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，利用荧光标记后的棉蚜微卫星引物组进行PCR扩增获得扩增产物；(4)对扩增产物中的单色荧光标记DNA片段进行分离和多态性检测。可选的，所述荧光标记为荧光染料FAM、HEX和VIC中的至少一种。可选的，PCR扩增体系为：10×缓冲液2.5μL，10mmol/LdNTPs2.0μL，10μmol/L正向引物0.4-2.0μL，10μmol/L反向引物0.4-2.0μL，5U/μLTaq酶0.2μL，25ng/μLDNA1-2μL，使用PCR纯等级水补足至25μL体系。可选的，PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54-58℃退火30s，72℃延伸15-60s，28-36个循环；72℃延伸10min；14℃保存。具体的，可以利用遗传分析仪测序，从而对扩增出的单色荧光标记DNA片段进行分离和多态性检测。其中，根据DNA片段长度的差异对扩增出的单色荧光标记DNA片段进行分离。检测结束后使用软件进行位点分析，提取出微卫星位点数据。通过贝叶斯聚类的方法分析种群遗传结构，采用混合祖先模型和等位基因频率关联模型进行750000次重复的马尔科夫蒙特卡罗链搜索，并舍弃最初的500000次重复的聚类结果，使用Evanno的ΔK方法确定最佳可能簇数(K)，即分类数。本发明进一步还提供了所述棉蚜微卫星标记组合、微卫星引物组和试剂盒在棉蚜遗传背景分类中的用途。本发明通过对棉蚜进行微卫星位点多态性研究，创造性的开发了19个多态性丰富的棉蚜微卫星位点。本发明中所开发的19个棉蚜微卫星位点引物退火温度严格保持一致，在实际应用中可以使用同一退火温度进行PCR扩增反应，提高了应用的便捷性。利用本发明公开的19个棉蚜微卫星引物组对棉田采集的棉蚜进行检测，结果表明，所有位点在群体中都能得到100％的扩增。利用测序仪对扩增出的单色荧光标记DNA片段进行分离和多态性检测，结果表明该组位点存在明显的多态性。利用本发明公开的棉蚜微卫星引物组对采集自棉花、石榴和黄瓜上的棉蚜进行检测，结果表明，3种寄主上面的棉蚜存在明显的分化。说明本发明提供的棉蚜微卫星引物组可以应用于棉蚜依照遗传背景的分类。本发明公开了一组能够高效扩增棉蚜群体微卫星标记的特异性引物及检测方法，可应用于棉蚜谱系地理格局、群体结构和遗传多样性的分析。附图说明图1为棉花、石榴和黄瓜上的棉蚜贝叶斯分析结果；1-102为黄瓜上采集的棉蚜，103-211为棉花上采集的棉蚜，212-300为石榴上采集的棉蚜。图2为79头棉田棉蚜多态性结果。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1(1)棉蚜基因组DNA的提取2015年6月-8月，在中国农业科学院棉花研究所试验农场棉田(36.13°N，114.85°E)、黄瓜田及石榴树上采集棉蚜。在棉花和黄瓜田每个植株采集1头，在石榴树上，每个方向枝条采集1头。带回实验室，加入液氮进行单头研磨，使用天根生化科技(北京)有限公司生产的血液组织细胞基因组提取试剂盒(DP304)进行DNA提取。分别成功提取109个、102个和89个在棉花、黄瓜及石榴上采集的棉蚜DNA。(2)微卫星引物在棉蚜群体中扩增利用本发明的微卫星位点特异性引物对步骤(1)中所提取的109个、102个和89个在棉花、黄瓜及石榴上采集的棉蚜DNA样品进行PCR扩增。对棉蚜微卫星标记特异引物进行荧光标记，方法为使用荧光染料FAM对正向引物5’端进行标记。PCR扩增反应的扩增体系为：10×缓冲液(含Mg2+)2.5μL，10mmol/L的dNTPs2.0μL，10μmol/L正向引物1.0μL，10μmol/L反向引物1.0μL，5U/μL的Taq酶0.2μL，25ng/μL的DNA2μL，使用PCR纯等级水补足至25μL体系。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；14℃保存。利用ABI3700遗传分析仪测序，对扩增出的单色荧光标记DNA片段进行分离和多态性检测。检测结束后使用GeneMarkerV1.51软件进行位点分析，提取出微卫星位点数据。使用Structurev.2.3.4软件进行贝叶斯聚类的方法分析种群遗传结构，参数设定为采用了混合祖先模型和等位基因频率关联模型进行了750000次重复的马尔科夫蒙特卡罗链搜索，并舍弃最初的500000次重复的聚类结果，共检测1-10的10个可能簇数(K)，每个K进行了19次重复计算，并使用Evanno的ΔK方法确定最佳的K值，即分类数。图1的结果显示3种寄主上面的棉蚜存在明显的分化；79头棉田棉蚜多态性结果如图2所示。通过以上结果可以证实，利用本发明所提供的棉蚜微卫星引物组和检测方法能够应用于棉蚜遗传背景分类，可以取得具有较高区分度的准确效果。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。