本发明涉及一种发酵培养基及一种生产奥利万星前体a82846b的生产工艺。
背景技术：
：2014年8月美国fda批准新药奥利万星(商品名为orbactiv)上市。orbactiv用于治疗急性细菌性皮肤和皮肤结构感染，是继万古霉素和替考拉宁后开发的第二代糖肽类抗生素。它是万古霉素的结构类似物，二者都包含一个七肽骨架，作用方式也与万古霉素类似，通过阻断肽聚糖生物合成时转糖苷作用和转肽作用来抑制细菌细胞壁的形成。抗菌活性研究表明，奥利万星是一种广谱抗菌药物，能够快速杀死革兰阳性需氧和厌氧细菌，包括葡萄球菌属、肠球菌属、链球菌属、艰难梭状芽胞杆菌、产气荚膜梭菌、某些消化链球菌种属等。奥利万星对耐药菌株尤其是耐甲氧西林金葡菌(mrsa)和耐万古霉素肠球菌(vre)有良好的抗菌活性，并且与其他糖肽类抗生素相比，奥利万星的血浆蛋白结合率高，半衰期更长，单剂量给药方案使患者只需接受一次输液便可结束治疗，无需多次静脉输注，这样能够显著降低患者的治疗负担并且能够有效防止耐药性的发生。因此，奥利万星有望成为万古霉素的有效替代品。奥利万星是通过半合成方法获得，以a82846b为原料，在回流甲醇和氰基硼氢化钠作用条件下与氯代联苯甲醛经还原胺化反应得到。目前对前体a82846b的生产研究比较少，而该药的上市将极大的刺激前体a82846b的需求量，对其产量和分离纯化效率有了更高的要求，所以有必要研究更加高效的生产方法，提高前体产量，同时降低杂质含量。专利号us005843437a最早公布了a82846b的摇瓶发酵法和罐式发酵法，该专利公布的发酵培养基配方包含葡萄糖、土豆糊精、蛋白胨、糖蜜、caco3。该培养基生产a82846效率较低，且工艺复杂，发酵单位仅为150mg/l。本实验室前期发表的专利cn104805161a公布了该前体的发酵培养基配方，包含葡萄糖、土豆糊精、麦芽糊精、鱼粉蛋白胨、麸质粉、红糖、caco3、kh2po4。发酵单位达到969mg/l；近期发表的文献“奥利万星前体a82846b的菌种选育与培养基优化”也报道了该前体的发酵培养基配方，其中包含葡萄糖、麦芽糊精、糖蜜、热榨黄豆饼粉、水解酪蛋白、氯化钠、碳酸钙。在所报道的a82846发酵配方中，为了减少葡萄糖对a82846合成的抑制作用，发酵配方中的葡萄糖的含量都低于1％，而采用其它碳源如蔗糖、糊精来提高a82846的产量，发酵单位可达1213mg/l，但杂质含量仍较高。技术实现要素：本发明所解决的技术问题在于克服了现有的发酵培养基培养东方拟无枝酸菌nrrl18099生产奥利万星前体a82846b的产量不高，以及杂质含量高等的缺陷，提供一种发酵培养基及生产奥利万星前体a82846b的生产工艺。发明人通过大量研究发现，通过发酵配方碳源与氮源合理的配比，高浓度的葡萄糖不仅不会影响a82846合成，而且还有助于提高发酵的产量，本发明的发酵培养基及该生产工艺能够有效地提高a82846b的产量，并且杂质含量低，适用于发酵罐生产，能够高效生产奥利万星前体a82846b。本发明通过以下技术手段解决上述技术问题。本发明提供的技术方案之一是：一种发酵培养基，其用于生产奥利万星前体a82846b，其包含有机碳源、有机氮源、矿物质和水；所述有机碳源包括葡萄糖，所述葡萄糖的含量为5～10％；所述有机氮源包括酵母粉，所述酵母粉的含量为0.3～1.0％；所述百分比为相对于所述发酵培养基的质量百分比。其中，所述葡萄糖的含量较佳地为6.0％～8.5％。所述有机碳源还可以含有发酵培养基中常用其他有机碳源，如麦芽糊精、麦芽糊精、糖蜜、红糖、蔗糖等。其中，所述酵母粉的含量较佳地为0.5％～0.7％。所述有机氮源还可以含有发酵培养基中常用其他有机氮源，如大豆蛋白胨、鱼粉蛋白胨、麸质粉等。其中，所述矿物质可为本领域常规使用的矿物质，较佳地包括kcl、caco3和kh2po4。所述kcl的含量较佳地为0.3％～0.7％；所述caco3的含量较佳地为0.2％～0.6％；所述kh2po4的含量较佳地为0.01％～0.025％。在本发明的一实施方式中，kcl含量为0.54％，caco3含量为0.5％，kh2po4含量为0.017％。其中，所述的水可为本领域常规使用的水，较佳地为自来水。按本领域常识，本发明的发酵培养基如常规的发酵培养基一样，一般还可以含有消泡剂，如泡敌。所述消泡剂的用量为本领域的常规用量，一般为0.1％。本发明所述的发酵培养基的制备方法为本领域常规，只要将各组分混合，再加以灭菌即可。所述的灭菌较佳地为高温灭菌。本发明提供的技术方案之二是：一种生产奥利万星前体a82846b的生产工艺，其包括下述步骤：(1)将东方拟无枝酸菌(amycolatopsisorientalis)活化后，接种到种子培养基中培养，得到种子液；(2)将种子液接种于所述的发酵培养基中进行发酵培养5-15天即可；步骤(2)中，控制发酵培养的温度为32～38℃，并且对残余糖量进行控制：发酵培养开始后每隔24小时检测残余糖量，当残余糖量在0.9wt％以下时，控制残余糖量在0.05wt％～0.9wt％。步骤(1)中，所述的东方拟无枝酸菌可为本领域常规使用的东方拟无枝酸菌菌株，只要能产生奥利万星前体a82846b即可，较佳地为从诺卡氏土分离的东方拟无枝酸菌nrrl18099。该菌株已在us005843437a中公开。步骤(1)中，所述的活化的方法和条件可为本领域常规的方法和条件。所述活化较佳地为：将东方拟无枝酸菌划线于种子斜面培养基，在28～30℃的条件下培养5～8天，即可。其中，所述的斜面培养基可为本领域常规使用的斜面培养基。步骤(1)中，所述种子培养基可为本领域常规使用的种子培养基。所述的种子培养基较佳地包含酵母粉、聚合蛋白胨、麦芽浸粉和葡萄糖；所述的种子培养基的ph值为6.5～7.5。所述的种子培养基的具体组成和用量可参考cn104805161a。步骤(1)中，所述的种子液的培养方法和条件可为本领域常规的方法和条件。本发明的较佳实施方式中采用摇床培养。所述培养的温度较佳地为20℃～40℃，所述培养的时间较佳地为24～48小时。步骤(2)中，所述种子液的用量较佳地为5％～15％，更佳地为10％，所述的百分比是指种子液的体积与发酵培养基的体积百分比。步骤(2)中，所述发酵培养的方法和条件可为本领域常规的方法和条件。所述的发酵培养的时间较佳地为6～8天。在所述发酵培养的过程中，较佳地，对发酵液的ph值进行控制：在发酵培养开始后17小时时取样，控制发酵液ph值在5.8～7.0，更佳地控制发酵液ph值在6.4～6.7。步骤(2)中，对残余糖量进行控制的优选方式为：当残余糖量在0.5wt％以下时，控制残余糖量在0.1wt％～0.5wt％；对残余糖量进行控制的更优选方式为：当残余糖量在0.3wt％以下时，控制残余糖量在0.1wt％～0.3wt％。当残余糖量低于预设控糖范围下限时，按本领域常识补充碳源，较佳地补充糖蜜和/或葡萄糖，更佳地补充葡萄糖。步骤(2)中，在所述发酵培养的过程中，较佳地控制发酵培养的温度为32～35℃。按本领域常识，在发酵培养结束后，按本领域常规的分离方法从发酵液中分离出前体a82846b。所述分离方法较佳地按下述方式进行：将所述发酵液进行离心处理，取上清液，即可。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。本发明的积极进步效果在于：本发明的发酵培养基使a82846b的产量大幅度提高，且两种杂质a82846a和a82846c比例显著降低。本发明的生产奥利万星前体a82846b的生产工艺，能够有效地提高a82846b的产量，并且杂质含量低，适用于发酵罐生产，能够高效生产奥利万星前体a82846b。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。若无特别说明，所用的百分比均为质量百分比。下述实施例和对比实施例中，所用的种子液配方与cn104805161a中一致，具体为3g/l的酵母粉、11g/l的聚合蛋白胨，3g/l的麦芽浸粉和17g/l的葡萄糖，种子培养基的ph值为6.8。下述实施例和对比实施例中，所用的水均为自来水。下述实施例和对比实施例中，采用高效液相色谱法测定a82846b的含量，具体方法如下：对发酵液进行预处理：取发酵液1ml，加入2倍体积的甲醇，涡旋震荡混匀，超声30min，离心(4000×g)10min，将所得的上清液用hplc法测定。色谱条件为：色谱柱zorbaxsb-c8柱(4.6×150mm，3.5μm)；流动相1％磷酸二氢铵溶液(a)：乙腈(b)，梯度洗脱，0→25min，a：b＝95：5→50:50；流速1.0ml/min；检测波长225nm；柱温30℃；进样量10μl。对比实施例1发酵培养基的组成：酵母粉、葡萄糖、麦芽糊精、kcl、caco3、kh2po4、泡敌和水；其中，葡萄糖含量为3.0％，麦芽糊精含量为5.0％，酵母粉的含量为0.6％，kcl含量为0.54％，caco3含量为0.5％，kh2po4含量为0.017％，泡敌含量为0.1％，百分比均为相对于发酵培养基的质量百分比。发酵培养基的制备方法：将各组分混合，再加以高温灭菌即可。生产奥利万星前体a82846b的生产工艺，其包括下述步骤：(1)取东方拟无枝酸nrrl18099划线于种子斜面培养基，在28℃的培养箱中培养5天后，接种于25ml的种子培养基中，在28℃，200rpm的旋转式摇床培养48h，得到种子液；(2)将相对于发酵培养基10％体积的种子液接种于5l发酵培养罐中进行发酵培养，发酵温度为30℃；发酵开始后17h时取样测定ph值，用氨水调节发酵液ph值在6.0～6.3；发酵开始后每隔24h时取样测残余糖量，当残糖量低于0.3wt％时补充葡萄糖，控制残余糖量在0.3wt％～0.5wt％；发酵培养6天后，将发酵液离心取上清，即得。经hplc测定，a82846b的产量为1438mg/l。百分比为相对于发酵培养基总体积的质量比。对比实施例1作为空白对照，和各实施例进行比较。实施例1本实施例1中，发酵培养基中，碳源采用葡萄糖，其用量为5.0％，其他条件与生产工艺与对比实施例1相同。经hplc测定，a82846b的产量为1600mg/l。可以看出，采用5.0％的葡萄糖为碳源，a82846b产量相对于对比实施例1中提高了11.3％。对比实施例2-6在对比实施例2-6中，改变发酵培养基的碳源，其他条件及发酵过程的控制如对比实施例1所述。经hplc测定，a82846b的产量如下所示：编号碳源a82846b产量(mg/l)对比实施例25.0％土豆糊精939对比实施例35.0％麦芽糊精947对比实施例45.0％糖蜜1134对比实施例55.0％红糖1142对比实施例65.0％蔗糖1032实施例2-3实施例2和3中，发酵培养基中，碳源采用葡萄糖，其用量分别为6.5％和8.0％，其他条件与生产工艺与对比实施例1相同。经hplc测定，a82846b的产量如下所示：编号碳源a82846b产量(mg/l)实施例26.5％葡萄糖1560实施例38.0％葡萄糖1725可以看出，发酵结果最佳的是使用8.0％的葡萄糖为碳源，a82846b产量相对于对比实施例1中提高了19.96％。对比实施例7-8对比实施例7和8中，发酵培养基中，碳源采用葡萄糖，其用量分别为2.5％和4.0％，其他条件与生产工艺与对比实施例1相同。经hplc测定，a82846b的产量如下所示：编号碳源a82846b产量(mg/l)对比实施例72.5％葡萄糖824对比实施例84.0％葡萄糖852对比实施例9-11对比实施例9-11中，发酵培养基中，碳源采用葡萄糖，其用量为8.0％；氮源分别为大豆蛋白胨、鱼粉蛋白胨和麸质粉，其用量均为0.5％；其他条件与生产工艺与对比实施例1相同。经hplc测定，a82846b的产量如下所示：编号氮源a82846b产量(mg/l)对比实施例90.5％大豆蛋白胨1040对比实施例100.5％鱼粉蛋白胨1461对比实施例110.5％麸质粉1511实施例4实施例4中，发酵培养基中，碳源采用葡萄糖，其用量为8.0％；氮源为酵母粉，其用量为0.5％；其他条件与生产工艺与对比实施例1相同。经hplc测定，a82846b的产量为1790mg/l。结合对比实施例9-11可以看出，发酵结果最佳的是使用0.5％的酵母粉为氮源，a82846b产量相对于对比实施例1提高了24.48％。实施例5-8实施例5-8中，发酵培养基中，碳源采用葡萄糖，其用量为8.0％；氮源为酵母粉，其用量分别为0.45％、0.6％、0.75％和0.9％；其他条件与生产工艺与对比实施例1相同。经hplc测定，a82846b的产量如下所示：编号氮源a82846b产量(mg/l)实施例50.45％酵母粉1620实施例60.6％酵母粉1815实施例70.75％酵母粉1805实施例80.9％酵母粉1784可以看出，发酵结果最佳的是使用0.6％的酵母干粉为氮源，a82846b产量相对于对比实施例1中提高了26.26％。从上述实施例和对比实施例中可以看出，最佳的碳源和氮源配比为：8.0％葡萄糖，0.6％酵母粉。实施例9-12实施例9-12中，发酵培养基中，碳源采用葡萄糖，其用量为8.0％；氮源为酵母粉，其用量为0.6％；对发酵培养过程中的ph值控制分别为：发酵开始后17h时取样测定ph值，用氨水调节发酵液ph值分别在5.8～6.1、6.1～6.4、6.4～6.7以及6.7～7.0；其他条件与生产工艺与对比实施例1相同。经hplc测定，a82846b的产量以及杂质的含量如下所示：可以看出，发酵过程的ph值的变化对a82846a、a82846b和a82846c的比例是有关键影响的，可以通过调节ph将杂质的比例降低。发酵结果最佳时ph值是6.4～6.7。此时a82846b产量相对对比实施例1提高了38.2％，杂质比例最低。实施例13-15实施例13-15中，发酵培养基中，碳源采用葡萄糖，其用量为8.0％；氮源为酵母粉，其用量为0.6％；对发酵培养过程中的ph值控制分别为：发酵开始后17h时取样测定ph值，用氨水调节发酵液ph值在6.4～6.7；发酵开始后每隔24h时取样测残余糖量，当残糖量低于控制下限时(分别为0.1wt％、0.5wt％和0.7wt％)补充葡萄糖，控制残余糖量在0.1wt％～0.3wt％、0.5wt％～0.7wt％以及0.7wt％～0.9wt％；其他条件与生产工艺与对比实施例1相同。经hplc测定，a82846b的产量如下所示：编号残余糖量a82846b产量(mg/l)实施例130.1wt％～0.3wt％2011实施例110.3wt％～0.5wt％1987实施例140.5wt％～0.7wt％1552实施例150.7wt％～0.9wt％1244发酵结果表明，控制残余糖量为0.1％～0.3％时，a82846b产量最高，产量比对比实施例1提高了39.85％。实施例16-17实施例16和17中，发酵培养温度分别为32～35℃以及35～38℃；其他条件与生产工艺与对比实施例13相同。经hplc测定，a82846b的产量如下所示：编号发酵培养温度a82846b产量(mg/l)实施例1632～35℃2033实施例1735～38℃1055对比实施例12对比实施例12中，发酵培养温度为28～32℃，但不包含32℃；其他条件与生产工艺与对比实施例13相同。经hplc测定，a82846b的产量为780mg/l。对比实施例13已经公布的技术中，专利号us005843437a公布的a82846发酵培养基中碳源为葡萄糖1.0％、土豆糊精2.0％、糖蜜2.0％。氮源为蛋白胨1.0％，发酵温度为30℃，最终发酵单位为150mg/l。对比实施例14根据专利cn10480505161a公布的发酵培养基配方，碳源为葡萄糖0.1％、麦芽糊精0.4％、红糖0.45％。氮源为鱼粉蛋白胨0.15％、麸质粉0.1。发酵温度为28℃，最终发酵单位为969mg/l。对比实施例15根据文献“奥利万星中间体a82846b的菌种选育与培养基优化”(中国医药工业杂志，2015，46(5):462-466)报道的技术，发酵培养基的碳源包含葡萄糖0.1％、麦芽糊精0.4％、糖蜜0.12％。氮源包含热榨黄豆饼粉0.25％、水解酪蛋白0.4％。控制发酵过程ph在7.0～7.5，温度30℃。a82846b的最终发酵单位为871mg/l，a、b、c三种组分的比例分别为39.0％、35.6％、5.5％。应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求数所限定的范围。当前第1页12