一种口山酮类化合物及其制备方法和应用与流程

本发明属于天然产物化学
技术领域：
，具体涉及一种从黑紫獐牙菜中首次提取得到的口山酮类化合物及其制备方法和应用。
背景技术：
：獐牙菜属（Swertia）是龙胆科下的一个属，全球约170种，我国有80余种，主要分布于云南、四川等地。在我国该属植物入药历史悠久，药用有35种，具有清热利胆、除湿解毒等功效，常用于治疗急性黄疽型肝炎、骨髓炎等疾病。该属植物的化学成分丰富，主要有口山酮、黄酮、环烯醚萜、三萜和生物碱等化合物。黑紫獐牙菜（Swertiaatroviolacea）为獐牙菜属多年生草本植物，生于海拔3400～4575m的山坡草地、多石山顶或岩石缝中，是云南省迪庆藏族地区特有品种。口山酮又名二苯并吡喃酮，它的衍生物广泛存在于自然界中，是药用植物的重要有效成分之一。由于口山酮类衍生物是线形排列的三个环上具有酚性官能团，大多具有丰富的生物活性和药用价值；口山酮衍生物具有广泛的生理学和药理学活性,具有抗肿瘤、保护心血管、降低血糖、抗氧化、抗菌等药理作用，但很多药理作用机制尚处于研究探索阶段,从而使其药理活性及其与构型关系的研究倍受关注。为了研究这类化合物的构效关系，可进一步研究和开发更多的口山酮类化合物，从中寻找有效的先导化合物和活性基团。本发明从黑紫獐牙菜中分离得到了一种新的口山酮类化合物，该化合物至今尚未见到相关报道，值得一提的是该化合物具有显著的抗菌活性。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种新的口山酮类化合物；第二目的在于提供所述口山酮类化合物的制备方法；第三目的在于提供所述口山酮类化合物在制备抗菌药物中的应用。本发明的第一目的是这样实现的，所述的口山酮类化合物是从黑紫獐牙菜中分离得到，其分子式为C17H16O5，具有下述结构式：该化合物的命名为：6-(2-羟甲基)-1,7-二甲氧基-3-甲基-口山酮，英文名为6-(2-hydroxymethyl)-1,7-dimethoxy-3-methyl-xanthone，为浅黄色胶状物。本发明的第二目的是这样实现的，所述口山酮类化合物的制备方法，是以黑紫獐牙菜为原料，经浸膏提取、硅胶柱层析、高压液相色谱步骤，具体为：A、浸膏提取:以黑紫獐牙菜为原料，将黑紫獐牙菜粉碎或切成小段，用有机溶剂浸泡24h～72h，提取3~5次，合并提取液、过滤，减压浓缩成浸膏；B、硅胶柱层析：浸膏用重量比2～4倍量的160～300目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析；以氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，合并相同的部分，收集各部分洗脱液并浓缩；C、高压液相色谱分离纯化：B步骤洗脱液的7:3部分进一步用高压液相色谱分离纯化即得所需的口山酮类化合物。以上述方法制备得到的口山酮类化合物的结构是通过以下方法鉴定出来的：本发明化合物为浅黄色胶状物；高分辨质谱(HRESIMS)给出准分子离子峰m/z323.0887[M+Na]+(计算值323.0895)。结合1H和13CNMR谱给出一个分子式C17H16O5，不饱和度为10。紫外光谱在335、254和210nm处有最大吸收，证实化合物中存在芳环结构；红外光谱数据也证实化合物中存在羟基(3415cm-1)、羰基(1652cm-1)和芳环1610、1524、1465cm-1)功能团。化合物的1H和13CNMR数据(表-1)显示化合物中有17碳和16个氢信号,包括一个1,3,6,7-四取代的口山酮骨架[Ind.Crop.Prod.,58,125(2014)](C-1~C-9，C-4a，C-8a~C10a；H-2，H-4，H-5和H-8)，一个羟甲基(C-1′；H2-1′)，一个芳环上取代的甲基(C-2′和H3-2′)，2个甲氧基(δH56.0q和56.3q；3.81s和3.86s)。化合物中存在H2-1′(δH4.64)和C-5(δC119.4)、C-6(δC143.4)、C-7(δC157.6)，以及H-5(δH6.97)和C-1′(δC58.9)的HMBC相关(图3)，可证实羟甲基取代在化合物的C-6位。根据H3-2′(δH2.39)和C-2(δC112.4)、C-3(δC147.4)、C-4(δC108.9)的HMBC相关，可证实该甲基取代在化合物的C-3位。两个甲氧基取代在C-1和C-7可由两个甲氧基氢(δH3.81和3.86)分别与C-1(δC160.4)和C-7(δC157.6)的HMBC相关得到证实。化合物中典型的质子信号[δH7.08d(2.2)、6.85d(2.2)、6.97s、7.34s]也支持本发明的口山酮B环为6,7-二取代，C环为1,3-二取代。至此本发明化合物的结构得以确定，化合物命名为6-(2-羟甲基)-1,7-二甲氧基-3-甲基-口山酮。化合物的红外、紫外和质谱数据：UV(甲醇),λmax(logε)210(4.02)、254(3.57)、335(3.42)，IR(溴化钾压片)νmax3415、3079、2932、1652、1610、1524、1465、1357、1268、1162、1078、864cm-1；、ESI-MS(正离子模式)m/z323[M+Na]+;HR-ESI-MS(正离子模式)m/z[M+Na]+323.0887(计算值323.0895，C17H16NaO5)。表-1.化合物的1HNMR和13CNMR数据(溶剂为C5D5N)No.dCdH(m,J,Hz)No.dCdH(m,J,Hz)1160.4s4a154.6s2112.4d7.08d(2.2)8a114.8s3147.4s9a110.4s4108.9d6.85d(2.2)10a148.9s5119.4d6.97s1′58.9t4.64s6143.4s2′24.3q2.39s7157.6s1-OMe56.0q3.81s8111.9d7.34s7-OMe56.3q3.86s9176.9s本发明的第三目的是这样实现的，所述的口山酮类化合物在制备抗菌药物中的应用。所述的口山酮类化合物在制备抗菌包装中的应用。本发明化合物是首次从黑紫獐牙菜中分离出来的，通过核磁共振和质谱测定方法确定为口山酮类化合物，并表征了其具体结构。对该化合物进行了抗菌活性筛选，其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、埃希菌、枯草杆菌、变形杆菌等具有显著的活性，。该化合物经安全性评价，表明对动物无毒，使用安全。该化合物应用到卷烟接装纸中，和对照相比较，添加过本化合物的接装纸检测细菌总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、溶血性链球菌、真菌总数显著减少；对大肠杆菌(ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC6538)的抑菌率全部达到88.3%以上，能够降低或消除卷烟接装纸及在贮存过程中细菌滋生和繁殖的可能性，另外，在卷烟吸食、传递过程中，该抗菌作用也能够对卷烟烟支上的接装纸被污染的微生物起到抑制作用。与现有技术相比，本发明具有以下突出优点：(1)本发明的化合物原料易得，提取方法简单，容易分离得到；分子结构也简单，容易实现人工合成。(2)采用了常规柱层析和高效液相色谱结合的制备方法，化合物制备操作流程简单，所获得的本发明化合物纯度高，后续的工业化生产容易实现。(3)本发明化合物对动物无毒，使用安全，展现出良好的抗菌活性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等的抑菌率全部达到88.3%以上；应用于卷烟接装纸，能够对卷烟接装纸被污染的微生物起到抑制作用。卷烟接装纸直接和口腔接触，该化合物在卷烟接装纸中的使用可避免在卷烟在吸食、传递过程中被微生物污染，有效提高了卷烟的卫生和安全性。附图说明图1为本发明口山酮类化合物化合物的核磁共振碳谱；图2为本发明口山酮类化合物化合物的核磁共振氢谱；图3为本发明口山酮类化合物化合物的主要HMBC相关。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。本发明所述的口山酮类化合物，是从黑紫獐牙菜中分离得到，其分子式为C17H16O5，命名为：6-(2-羟甲基)-1,7-二甲氧基-3-甲基-口山酮，英文名为6-(2-hydroxymethyl)-1,7-dimethoxy-3-methyl-xanthone，具有下述结构式：本发明所述的口山酮类化合物的制备方法，是以黑紫獐牙菜为原料，经浸膏提取、硅胶柱层析、高压液相色谱步骤，具体为：A、浸膏提取:以黑紫獐牙菜为原料，将黑紫獐牙菜粉碎或切成小段，用有机溶剂浸泡24h～72h，提取3~5次，合并提取液、过滤，减压浓缩成浸膏；B、硅胶柱层析：浸膏用重量比2～4倍量的160～300目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析；以氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，合并相同的部分，收集各部分洗脱液并浓缩；C、高压液相色谱分离纯化：B步骤洗脱液的7:3部分进一步用高压液相色谱分离纯化即得所需的口山酮类化合物。所述A步骤的有机溶剂为80%～100%的甲醇或乙醇、60%～90%的丙酮。所述A步骤有机溶剂与黑紫獐牙菜的重量比是2～4:1；所述B步骤中浸膏在经硅胶柱层析粗分前，用重量比1.5～3倍量的纯甲醇或纯乙醇或纯丙酮溶解后，用重量比0.8～1.2倍的80～100目硅胶拌样。所述B步骤中氯仿-丙酮溶液的体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2。所述C步骤中高压液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的C18色谱柱，流速为20mL/min，流动相为50%的甲醇，紫外检测器检测波长为335nm，每次进样200μL，收集22.6min的色谱峰，多次累加后蒸干。所述C步骤中高压液相色谱分离纯化后的化合物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化。本发明的应用为所述口山酮类化合物在制备抗菌药物中的应用。所述的口山酮类化合物在制备抗菌包装中的应用。所述的口山酮类化合物在制备抗菌卷烟用接装纸中的应用。本发明所述的黑紫獐牙菜不受地区和品种限制，均可以实现本发明，下面以来源于云南不同产地的黑紫獐牙菜烟叶原料，对本发明做进一步说明：实施例1烟草样品来源于云南丽江。将黑紫獐牙菜取样2.0kg粉碎以95%的甲醇提取5次，每次提取24h，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏105g。浸膏用重量比2.0倍量的纯甲醇溶解后用120g的100目粗硅胶拌样，0.6kg的160目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为7:3的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以50%的甲醇为流动相，ZorbaxSB-C18(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流速为20ml/min，紫外检测器检测波长为335nm，每次进样200μL，收集22.6min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用SephadexLH-20凝胶柱层析分离，即得该新化合物。实施例2黑紫獐牙菜样品来源于云南香格里拉，将黑紫獐牙菜取样3.5kg切碎，以95%的乙醇提取4次，每次提取48h，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏250g。浸膏用重量比2.0倍量的纯甲醇溶解后用250g的80目粗硅胶拌样，1.2kg的200目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为7:3的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以50％的甲醇为流动相，ZorbaxSB-C18(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流速为20ml/min，紫外检测器检测波长为335nm，每次进样200μL，收集22.6min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用SephadexLH-20凝胶柱层析分离，即得该新化合物。实施例3黑紫獐牙菜样品来源于云南维西，将黑紫獐牙菜取样5kg粉碎，以75%的丙酮用超声提取3次，每次提取72h，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏380g。浸膏用重量比1.6倍量的纯甲醇溶解后用400g的90目粗硅胶拌样，2.4kg的180目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为7:3的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以50％的甲醇为流动相，ZorbaxSB-C18(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流速为20ml/min，紫外检测器检测波长为335nm，每次进样200μL，收集22.6min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用SephadexLH-20凝胶柱层析分离，即得该新化合物。实施例4取实施例1制备的化合物，为浅黄色胶状物；测定方法为：用核磁共振，结合其它波谱技术鉴定结构。高分辨质谱(HRESIMS)给出准分子离子峰m/z323.0887[M+Na]+(计算值323.0895)。结合1H和13CNMR谱给出一个分子式C17H16O5，不饱和度为10。紫外光谱在335、254和210nm处有最大吸收，证实化合物中存在芳环结构；红外光谱数据也证实化合物中存在羟基(3415cm-1)、羰基(1652cm-1)和芳环1610、1524、1465cm-1)功能团。化合物的1H和13CNMR数据(表-1)显示化合物中有17碳和16个氢信号,包括一个1,3,6,7-四取代的口山酮骨架[Ind.Crop.Prod.,58,125(2014)](C-1~C-9，C-4a，C-8a~C10a；H-2，H-4，H-5和H-8)，一个羟甲基(C-1′；H2-1′)，一个芳环上取代的甲基(C-2′和H3-2′)，2个甲氧基(δH56.0q和56.3q；3.81s和3.86s)。化合物中存在H2-1′(δH4.64)和C-5(δC119.4)、C-6(δC143.4)、C-7(δC157.6)，以及H-5(δH6.97)和C-1′(δC58.9)的HMBC相关(图3)，可证实羟甲基取代在化合物的C-6位。根据H3-2′(δH2.39)和C-2(δC112.4)、C-3(δC147.4)、C-4(δC108.9)的HMBC相关，可证实该甲基取代在化合物的C-3位。两个甲氧基取代在C-1和C-7可由两个甲氧基氢(δH3.81和3.86)分别与C-1(δC160.4)和C-7(δC157.6)的HMBC相关得到证实。化合物中典型的质子信号[δH7.08d(2.2)、6.85d(2.2)、6.97s、7.34s]也支持本发明的口山酮B环为6,7-二取代，C环为1,3-二取代。至此本发明化合物的结构得以确定，化合物命名为：6-(2-羟甲基)-1,7-二甲氧基-3-甲基-口山酮。实施例5取实施例2-3制备的任一化合物，为浅黄色胶状物。测定方法与实施例4相同，确认实施例2-3制备的化合物为所述的口山酮类化合物——6-(2-羟甲基)-1,7-二甲氧基-3-甲基-口山酮。实施例6取实施例1-4制备的任一口山酮类化合物进行抗菌活性试验，试验情况如下：体外抗菌实验用琼脂扩散法进行，首先将受试菌均匀地涂在普通琼脂培养基(牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、血清、琼脂)的平板上，再将待测化合物(苯并呋喃丙素化合物用10mLDMSO溶解，加水稀释成50μg/mL的溶液)浸泡好的药片(直径5mm)放在带菌的培养基上，放入恒温箱内，于25℃孵育24-72h后观察抑菌圈大小。结果表明：本发明化合物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、埃希菌、枯草杆菌、变形杆菌等具有很强的活性；抑制率超过88.3%。实施例7对本发明化合物进行了安全性评价，通过小鼠骨髓微核实验、Ames实验和TK基因突变实验,证明本发明化合物对动物无毒，使用安全。本化合物以50μg/mL的浓度加到卷烟接装纸上；按中华人民共和国《一次性使用卫生用品卫生标准》GB15979-2002的检测方法，取加过本发明化合物的卷烟用接装纸,2.0×3.0mm大小，检测细菌总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、溶血性链球菌、真菌总数。结果表明，添加过本发明化合物的接装纸菌落总数明显减少，本化合物对几种测试的细菌都有明显抑制作用，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等的抑菌率全部达到88.3%以上。当前第1页1 2 3