用于构建融合蛋白的连接肽的制作方法

文档序号:11294070阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种用于构建融合蛋白的连接肽,由柔性肽和刚性肽组成(优选刚性肽位于柔性肽的C末端),所述柔性肽包含1个或多个柔性单元,和所述刚性肽包含1个或多个刚性单元;其中,所述柔性单元包含2个或更多个选自Gly、Ser、Ala和Thr的氨基酸残基;和所述刚性单元包含人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽。

2.如权利要求1所述的连接肽,其特征在于,所述柔性单元包含2个或更多个选自Gly和Ser的氨基酸残基,

优选地,所述柔性单元氨基酸组成的结构通式为(GS)a(GGS)b(GGGS)c(GGGGS)d,其中a,b,c和d是大于或等于0的整数,且a+b+c+d≥1。

更优选地,所述柔性单元选自如下序列:

(i)GSGGGSGGGGSGGGGS;

(ii)GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS;

(iii)GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS;

(iv)GSGGGGSGGGGSGGGGS;

(v)GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS;

(vi)GGSGGSGGSGGS。

3.如权利要求1所述的连接肽,其特征在于,所述刚性单元包含如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列或其片段,其中,所述片段包含至少2个糖基化位点,

优选地,所述刚性单元选自如下序列:

(i)SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ;

(ii)PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ;

(iii)SSSSKAPPPS;

(iv)SRLPGPSDTPILPQ;

(v)SSSSKAPPPSLPSPSR。

4.如权利要求1所述的连接肽,其特征在于,所述人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽与权利要求3所述连接肽中刚性单元的氨基酸序列至少具有70%,80%,90%或95%的同一性。

5.如权利要求1所述的连接肽,其特征在于,所述刚性肽包含1,2,3,4或5个刚性单元。

6.如权利要求1所述的连接肽,其特征在于,所述连接肽具有如SEQ ID NO:2、3、4、5、6或7所示的氨基酸序列。

7.一种融合蛋白,其结构通式表示为K1-L-K2,其中K1是第一种生物活性分子;L是如权利要求1-6任一项所述连接肽;K2是第二种生物活性分子;且所述活性分子K1或K2选自蛋白或蛋白结构域、多肽、抗体或抗体片段,优选为蛋白或蛋白结构域、抗体或抗体片段。

8.如权利要求7所述的融合蛋白,其特征在于,所述活性分子K1包含可溶性或者膜信号分子、细胞因子、生长因子、激素、共刺激分子、酶、受体或对于受体具有配体功能的蛋白或者多肽;和所述活性分子K2为延长循环半衰期的蛋白或蛋白结构域,优选为人血白蛋白、转铁蛋白或免疫球蛋白Fc片段。

9.如权利要求7所述的融合蛋白,其特征在于,所述活性分子K1包含毒素、酶、细胞因子、膜蛋白或免疫调节细胞因子;和所述活性分子K2包含抗体或抗体片段,且K1和K2通过所述连接肽L连接形成抗体融合蛋白。

10.如权利要求7所述的融合蛋白,其特征在于,所述生物活性分子K1包含腺苷A1受体、血管紧张素转换酶ACE、Activin家族、ADAM家族、ALK家族、α-1-抗胰蛋白酶、细胞程序性死亡相关蛋白家族、神经生长因子及受体家族、骨形态发生蛋白BMP及受体家族、补体因子、降钙素、癌症相关抗原、组织蛋白酶家族、CCL趋化因子及受体家族、CD超家族、CFTR、CXCL趋化因子及受体家族、EGF、表皮生长因子EGF及受体家族、凝血因子IIa、因子VII、因子VIII、因子IX、铁蛋白、成纤维细胞生长因子FGF及受体家族、促卵泡激素、FZD家族、HGF、胰高血糖素、心肌肌球蛋白、生长激素、Ig、IgA受体、IgE、胰岛素样生长因子IGF及结合蛋白家族、白细胞介素IL超家族及其受体超家族、干扰素INF家族、iNOS、整联蛋白家族、激肽释放酶家族、层粘连蛋白、L-选择蛋白、黄体生成素、MMP家族、粘蛋白家族、钙粘蛋白超家族、血小板衍生生长因子PDGF及受体家族、甲状旁腺激素、血清白蛋白、T-细胞相关受体超家族、TGF-α、转化生长因子TGFβ超家族、促甲状腺激素、促甲状旁腺激素、肿瘤坏死因子TNF超家族及其受体TNFRSF超家族、尿激酶、WNT信号通路蛋白家族、胸腺肽α1、胸腺肽β4、VEGF、血管内皮生长因子VEGF及其受体家族。

11.如权利要求8所述的融合蛋白,其特征在于,所述活性分子K1为人凝血因子VII、人凝血因子VIII、Exendin-4、人白介素7或人生长激素;和所述融合蛋白的连接肽L如SEQ ID NO:2,3,4,5,6或7所示;和所述活性分子K2为人IgG Fc;其中,Fc可以是野生型或突变体,所述Fc突变体包含位于野生型人IgG Fc中的至少一种氨基酸修饰,且变体具有降低的效应子功能和/或与新生儿受体FcRn的结合亲和力增强。

12.如权利要求11所述的融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白从N端至C端依次含有IL-7、连接肽和人IgG Fc;

优选地,所述IL-7具有如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列;和所述连接肽具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列;和所述人IgG Fc具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。

13.如权利要求11所述融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白从N端至C端依次含有hGH、连接肽和人IgG Fc。

14.如权利要求7所述的融合蛋白,其特征在于,所述活性分子K1包含第一种抗体、或者抗体片段;和所述活性分子K2包含第二种抗体、或者抗体片段,且K1和K2通过所述连接肽L连接形成双特异性抗体。

15.如权利要求14所述的融合蛋白,其特征在于,所述活性分子K1为Anti-CD20的双链抗体,K2为Anti-CD3的单链抗体,K1和K2通过所述连接肽连接形成双特异性抗体,

优选地,所述双特异性抗体包含的Anti-CD20双链抗体的重链具有如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列,且所述轻链具有如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列;和所述双特异性抗体包含的Anti-CD3单链抗体具有如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列;和所述连接肽具有如SEQ ID NO:4或6所示的氨基酸序列;且所述Anti-CD20双链抗体的重链通过所述连接肽与所述Anti-CD3单链抗体连接。

16.如权利要求7所述的融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白是糖基化的,优选是通过在哺乳动物细胞(如,中国仓鼠卵巢细胞)中表达而糖基化的。

17.制备或生产如权利要求7-16任一项所述的融合蛋白的方法,所述制备方法包括可以使K1和K2通过L相连接的步骤;

优选地,所述方法包括如下步骤:

(a)将编码所述融合蛋白的第一种活性分子K1和第二种活性分子K2的DNA序列通过连接肽L的DNA序列连接组成融合基因;

(b)将步骤(a)中获得的融合基因引入真核或原核表达宿主;

(c)培养步骤(b)筛选到的高产量表达宿主,表达融合蛋白;

(d)收获步骤(c)得到的发酵液,并分离纯化融合蛋白。

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