1.一种转基因自然杀伤细胞,包括靶向间皮素抗原特异性嵌合抗原受体基因和沉默NK细胞中酪氨酸磷酸酶SHP基因。
2.根据权利要求1所述的转基因自然杀伤细胞,其特征在于:所述靶向间皮素抗原特异性嵌合抗原受体基因设于Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ基因片段中。
3.根据权利要求1所述的转基因自然杀伤细胞,其特征在于:所述沉默NK细胞酪氨酸磷酸酶SHP基因由靶向SHP基因的siRNA提供或为用靶向SHP基因的siRNA正义/反义序列获得的PCR产物经过电泳获得2.5kb和0.1kb条带基因片段。
4.根据权利要求1所述的转基因自然杀伤细胞,其特征在于:所述SHP基因的siRNA的正义、反义序列如下:
正义SHP-siRNA序列为:
5’-GCCCAGCATACTCAAGAAGA-TCAAGAG-TCTTCTTGAGTATGCTGGGC-TTTTTT-3’;
反义SHP-siRNA序列为:
5’-AAAAAA-GCCCAGCATACTCAAGAAGA-CTCTTGA-TCTTCTTGAGTATGCTGGGC-3。
5.一种转基因自然杀伤细胞的制备方法,包括如下步骤:
将NK细胞被第一慢病毒和第二慢病毒同时感染;所述第一慢病毒含有靶向间皮素抗原特异性嵌合抗原受体基因,所述第二慢病毒含有沉默NK细胞酪氨酸磷酸酶SHP基因。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于:所述第一慢病毒按照如下方法制备获得:
将Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ基因片段与入门载体混合,以使所述Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ基因片段嵌入所述入门载体,而获得带有Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ基因片段的入门载体;以及
将所述带有Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ基因片段的入门载体与慢病毒质粒混合重组,以建立间皮素抗原特异性NK细胞受体表达质粒;
将所述间皮素抗原特异性NK细胞受体表达质粒与病毒包装质粒共转染293T细胞,获得第一慢病毒。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法,其特征在于:所述Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段获得方法包括如下步骤:
获取Meso抗原免疫总cDNA;
将所述Meso抗原免疫总cDNA与Meso抗体重链可变区VH引物和轻链可变区VL引物进行PCR,获得Meso VH和Meso VL基因片段;
将所述Meso VH与Meso VL基因片段采用连接肽连接,获得Meso抗体scFv基因片段;
将所述Meso抗体scFv基因片段与pcDNA载体连接,获得pcDNA-Meso/scFv质粒;
将按照CD8α、CD28及CD3ζ基因序列设计合成嵌合抗原受体的CD8-CD28-CD3ζ表达框克隆进所述pcDNA-Meso/sc Fv质粒,获得pcDNA-Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ质粒,酶切后获得Meso/scFv-CD8-CD28-CD3ζ基因片段。
8.根据权利要求5-6任一所述的制备方法,其特征在于:所述第二慢病毒按照如下方法制备获得:
将靶向SHP基因的siRNA正义和反义序列退火处理,再将所述退火处理获得退火产物与入门载体混合,以使所述退火产物嵌入所述入门载体,而获得带有靶向SHP基因的siRNA的入门载体;以及
将所述带有靶向SHP基因的siRNA的入门载体与慢病毒质粒混合重组,以建立siRNA慢病毒表达质粒;
将所述siRNA慢病毒表达质粒与病毒包装质粒共转染293T细胞,获得第二慢病毒。
9.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于:所述靶向SHP基因的siRNA正义序列如下:
5’-GCCCAGCATACTCAAGAAGA-TCAAGAG-TCTTCTTGAGTATGCTGGGC-TTTTTT-3’
所述靶向SHP基因的siRNA反义序列如下:
5’-AAAAAA-GCCCAGCATACTCAAGAAGA-CTCTTGA-TCTTCTTGAGTATGCTGGGC-3。
10.一种肿瘤药物制剂,包括权利要求1-4任一所述的转基因自然杀伤细胞或者由权利要求5-9任一所述的制备方法制备的转基因自然杀伤细胞。