苯并噻唑类的溶酶体靶向型pH荧光探针及其制备和应用的制作方法

本发明涉及荧光探针，具体涉及一种苯并噻唑类的溶酶体靶向型pH荧光探针及其制备方法应用。

背景技术：

细胞内H⁺作为一个重要的新陈代谢及细胞内参数，在调控许多生理和病理过程中发挥着关键性的作用，例如细胞的生长与凋亡、细胞周期调控、受体介导的信号转导、酶活性以及钙调控等。细胞内pH值并不是均匀分布的，细胞质呈弱碱性，pH值约为7.2；而一些细胞器，如溶酶体，内涵体和自噬体的pH呈弱酸性，位于4.0-6.0之间。其中溶酶体为单层膜包被的囊状结构，大小约0.025-0.8μm；内含50余种酸性水解酶，其弱酸性环境(pH 4.5-5.5)有利于活化水解酶的功能，促进蛋白质在细胞代谢中的降解。pH异常往伴随着细胞功能紊乱，如溶酶体内水解酶变异，功能丧失进而诱发各类溶酶体贮积症等；特别是在细胞凋亡过程中，早期溶酶体内的pH梯度会消失。因此监测细胞内溶酶体的pH值变化有利于从分子水平上理解细胞的生理和病理过程。

许多方法可用于检测细胞内pH值，主要包括核磁共振法、弱酸平衡法和荧光光谱法等。其中，基于荧光探针与氢离子作用引起荧光信号变化、荧光成像的荧光光谱法，则显示出其独特的时间和空间分辨率高的性质，且具有灵敏度高、操作简便、非破坏性等优点，成为分子水平上实时检测细胞内pH的重要手段。

迄今为止，文献报道了许多性能优良的pH荧光探针，但只有很少部分探针具有溶酶体靶向定位功能，且这些探针大都Stokes位移较小，合成复杂。此外，极少有探针能够同时检测极端环境(如pH<4或pH>9)pH的变化。因此，非常有必要开发酸性pH探针，兼具大的Stokes位移，简易的合成方法，并能够靶向应用于弱酸性溶酶体以及极度酸性环境(pH<4)中大肠杆菌内pH变化的检测。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种苯并噻唑类的溶酶体靶向型pH荧光探针及其制备方法；目的之二是提供该探针的用途，即在检测细胞内弱酸性溶酶体pH变化中的应用，以及在检测极度酸性环境(pH<4)中大肠杆菌内pH变化的应用。

本发明提供的一种苯并噻唑类的溶酶体靶向型pH荧光探针，是2-(喹啉-4-乙烯基)苯并噻唑，其结构式为：

本发明提供的一种苯并噻唑类的溶酶体靶向型pH荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

a.在封管中，将喹啉-4-甲醛，2-甲基苯并噻唑和三甲基氯硅烷(TMSCl)按摩尔比1:1:10溶于二甲基甲酰胺，其中TMSCl为催化剂，搅拌加热100℃反应16小时，冷却后过滤沉淀。

b.用二氯甲烷溶解沉淀，经NaCO3溶液调节pH为8.0，并搅拌30min，然后用含有饱和氯化钠的二氯甲烷萃取3次，合并有机相，并用无水MgSO4干燥，减压蒸馏有机溶液，最后用二氯甲烷重结晶制得纯品。

其合成路线如下：

本发明的探针具有良好的细胞膜通透性，可用于弱酸性溶酶体以及极度酸性环境(pH<4)中大肠杆菌基质内pH变化的检测。

与现有技术相比，本发明合成的苯并噻唑类的溶酶体靶向型pH荧光探针具有如下优点：(1)本探针是基于分子内电荷转移原理(ICT)设计的，喹啉基团为电子受体，苯并噻唑为电子给体，分子体系存在较强的ICT效应；在酸性条件下，苯并噻唑基团发生质子化，降低其给电子能力，导致ICT效应减弱，最终使得荧光发射减弱。(2)该探针具有较大的Stokes位移(110nm)，能有效降低造影过程中激发光的干扰。(3)对H⁺具有较高的灵敏性和选择性，不受其他常见金属离子的干扰。(4)pK_a值为3.52，不仅能够对弱酸性pH环境进行响应，而且能够指示极度酸性(pH<4)环境pH的变化。(5)该探针具有良好的细胞膜通透性，不仅能够特异选择性检测溶酶体pH变化，同时能够检测极度酸性环境中大肠杆菌内pH的变化。(6)该探针合成方法简便，产率高，易于商品化生产。

附图说明

图1.本发明实施例1中探针QVBT随pH变化的紫外吸收光谱图。

图2.本发明实施例1中探针QVBT在自然光下识别H⁺前后颜色变化，由淡黄色变为无色。

图3.本发明实施例1中探针QVBT随pH变化的荧光发射光谱图。

图4.本发明实施例1中探针QVBT在自然光下识别H⁺前后颜色变化，由蓝色变为无色。

图5.本发明实施例1中探针QVBT的荧光强度I₄₂₈随pH值变化的sigmoidal拟合曲线；插图：pH响应线性范围3.0-3.8。

图6.本发明实施例1中探针QVBT分别在pH 7.0和pH 3.0时，在常见金属离子存在下对H⁺的选择性。

图7.本发明实施例1中探针QVBT在人宫颈癌细胞(SiHa)中与市售溶酶体特异选择性染料Lyso Tracker Green DND-26的共定位成像图(pH 7.4)。

图8.本发明实施例1中探针QVBT分别在pH 7.0和pH 3.0时，与SiHa细胞共同孵育20min的激光共聚焦成像图。

图9.本发明实施例1中探针QVBT分别在pH 7.4，4.5，3.5和2.0时，与与大肠杆菌(E.coli)共同孵育2h的激光共聚焦成像图。

具体实施方式

实施例1

2-(喹啉-4-乙烯基)苯并噻唑(QVBT)的合成，步骤如下：

在封管中，将喹啉-4-甲醛(0.471g,3mmol)，2-甲基苯并噻唑(382μL,3mmol)和三甲基氯硅烷(TMSCl,3.8μL,30mmol)按摩尔比1:1:10溶于二甲基甲酰胺，其中TMSCl为催化剂，搅拌加热100℃反应16小时，冷却后过滤沉淀。用二氯甲烷溶解沉淀，经NaCO₃溶液调节pH为8.0，并搅拌30min，然后用含有饱和氯化钠的二氯甲烷萃取3次，合并有机相，并用无水MgSO₄干燥，减压蒸馏有机溶液，最后用二氯甲烷重结晶得到棕色固体0.78g，产率为90％。¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz),δ(ppm)7.39(m,3H),7.48(d,3H),7.66(d,2H),7.73(t,1H),7.88-7.97(d,1H),8.04-8.17(d,1H),9.01(d,1H).¹³C NMR(DMSO-d₆,300MHz),δ(ppm)119.95,112.48,123.27,124.14,125.09,126.04,126.37,126.96,128.15,128.38,130.50,134.23,135.09,139.69,148.48,150.94,163.32,169.09.ESI-HRMS:m/z found 289.0792for[M+H]⁺,calcd 289.0794for[M+H]⁺.Elemental analysis:found C,75.62；H,4.08；N,8.87；S,11.34,calcd C,74.97；H,4.19；N,9.17；S,11.12.

实施例2

将实施例1中的探针QVBT用无水乙醇配制浓度为1mM的储备液保存。实验中用乙醇/水(V/V，1/2)体系将探针稀释为终浓度10μM，用HCl(0.3M,0.6M and 1.0M)和NaOH(0.4M)调节该体系的pH值，记录QVBT随pH变化的紫外吸收光谱(图1)。随着pH值的降低，291nm处的吸收峰依次下降，317nm处的吸收峰逐渐增强，并且在295nm附近出现一个明显的等吸收点。同时溶液颜色由淡黄色变为无色(图2)。

实施例3

同样用乙醇/水(V/V，1/2)体系将探针QVBT稀释为终浓度10μM，用HCl(0.3M,0.6M and 1.0M)和NaOH(0.4M)调节该体系的pH值，固定激发波长为317nm，记录QVBT随pH变化的荧光发射光谱变化(图3)。随着pH值的降低，428nm处的荧光强度逐渐降低。在紫外灯照射下，溶液的颜色由蓝色色变为无色(图4)。根据QVBT在428nm处的荧光强度值随pH变化的Singmoidal拟合曲线计算pK_a值为3.52(图5)，pH响应线性范围为3.0-3.8。线性回归方程为I＝44869.25×pH-114030.27，线性系数R²＝0.9936。

实施例4

将实施例1中的探针QVBT浓度保持在10μM，分别考察该探针在常见金属离子存在下，对H⁺的选择性。如图6所示，分别在不同pH(pH 7.0,pH 3.0条件下，探针对上述物质几乎没有响应，证明该探针对H⁺具有很高的选择性。图6中物质的顺序和浓度依次为：(1)空白；(2)150mM Na⁺；(3)150mM K⁺；(4)10mM Ca²⁺；(5)0.3mM Mg²⁺；(6)0.3mM Zn²⁺；(7)0.3mM Al³⁺；(8)33mM Ba²⁺；(9)0.3mM Ni²⁺；(10)0.3mM Cu²⁺；(11)0.3mM Co²⁺；(12)0.3mM Cd²⁺；(13)0.3mM Pb²⁺；(14)0.3mM Cr³⁺；(15)0.2mM Fe³⁺。

实施例5

为了观察实施例1中的探针QVBT是否靶向定位溶酶体，我们首先进行QVBT与溶酶体特异选择性染料LysoTracker Green DND-26的共定位实验。将贴壁的SiHa细胞与QVBT(终浓度10μM)在pH 7.4的条件下，于37℃、5％CO2的孵育箱中共同孵育20min，然后用磷酸盐缓冲液(pH 7.4)轻轻洗涤3次，除去多余的探针，再加入LysoTracker Green DND-26(终浓度0.1μM)继续孵育25min后，在激光共聚焦显微镜下观察二者的共定位情况。固定激发波长为405nm，分别收集QVBT的蓝色发射通道(420-480nm)和Lyso Tracker DND-26的绿色发射通道(500-520nm)。结果发现，QVBT具有良好的细胞膜通透性，分布于细胞质区域(图7a)。为了更好地观察QVBT与LysoTracker Green绿色荧光(图7c)的复染图像，我们将QVBT的蓝色荧光设置为红色(假色，图7b)，这样由图7d可知，QVBT的红色荧光与LysoTracker Green DND-26的绿色荧光能够很好地重叠，经软件处理得到黄色荧光(图7d)，表明QVBT与LysoTracker Green DND-26具有显著的共定位性，且二者的平均Pearson's共定位系数高达0.95(图7e)。此外，由图7f可知，二者的细胞成像平均荧光强度倾向于同步。这些结果表明，探针QVBT具有显著的溶酶体靶向定位能力。

实施例6

将贴壁的SiHa细胞与实施例1中的探针QVBT在pH 7.0的条件下，于37℃、5％CO₂的孵育箱中共同孵育20min，然后用磷酸盐缓冲液(pH 7.0)轻轻洗涤3次，除去多余的探针，在激光共聚焦显微镜下观察。固定激发波长为405nm和488nm，收集蓝色发射通道(420-480nm)。pH 7.4的细胞在蓝色通道呈现明亮的蓝色(图8b)；当pH降至3.0时，细胞的蓝色荧光明显减弱(图8e)。说明探针QVBT能够检测细胞内弱酸性环境pH的变化。

实施例7

将接种好的大肠杆菌(E.coli)与实施例1中的探针QVBT分别在pH 7.4，4.5，3.5和2.0的条件下于摇床中共同孵育2h，在激光共聚焦显微镜下观察。固定激发波长为405，收集蓝色发射通道(420-480nm)。pH 7.4的大肠杆菌呈现明亮的蓝色荧光(图9a)；随着pH的降低，蓝色荧光依次减弱，当pH值降至极度酸性2.0时，大肠杆菌的蓝色荧光几乎淬灭(图9d)。说明探针QVBT能够检测极度酸性环境中大肠杆菌内pH的变化。