一种米糠抗氧化活性肽的分离制备方法与流程

本发明涉及一种米糠抗氧化活性肽的分离制备方法。

背景技术：

米糠是大米生产工厂中产生较多的副产物，其蛋白质氨基酸组成与大米中蛋白质氨基酸组成相似，氨基酸组成合理，均为优质蛋白。我国每年工业生产都会产生大量的米糠，而其中大部分未得到有效利用，因此需要对米糠蛋白进行深加工以提高其附加值，实现资源充分利用。大米以及米糠中的蛋白溶解性差，严重影响其应用。而米糠中的分子量较小的肽段则具有较好的溶解性，且不同的肽段具有不同的功效，如抗氧化性、降血压、免疫活性等。大米抗氧化活性肽具有良好的自由基清除能力，在预防自由基诱发的心脑血管疾病方面有很大的开发潜力。大米活性肽对氧化损伤诱导的自由基有很好的清除作用，可提高人体细胞抗氧化能力。

经过调研，未见我国学者利用中性蛋白酶提取米糠谷蛋白中抗氧化活性肽的相关文献报道，因此中性蛋白酶提取米糠谷蛋白中抗氧化活性肽等研究领域尚处于空白阶段。本研究发现利用中性蛋白酶提取米糠蛋白中的大米活性肽具有清除自由基、抑制细胞氧化的作用，有效提高米糠的附加价值，实现米糠的高值化利用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种米糠抗氧化活性肽的分离制备方法，是以米糠为原料，利用中性蛋白酶制备具有抗氧化活性的肽产品，以实现米糠的高值化利用。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述米糠抗氧化活性肽的分离制备方法是通过碱提酸沉法和Osborne分级提取脱脂米糠来获得米糠谷蛋白，然后选用离子交换和凝胶层析技术对米糠谷蛋白进行分离纯化，再将分离纯化后的米糠谷蛋白用碱性蛋白酶水解、离心、真空浓缩、冷冻干燥，之后利用离子交换层析、凝胶层析、制备RP-HPLC及分析型RP-HPLC分离纯化得到抗氧化活性肽，所述抗氧化活性肽的序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述碱性蛋白酶水解的条件为[E]/[S]1.5％—1.8％、pH值为10.0、温度为50℃、反应时间为4.2h。

优选地，所述方法具体包括如下步骤：

(1)谷蛋白的提取：脱脂米糠→加水并调pH值为9.0，料液比为1:10，所述料液比的单位为mL/g，40℃水浴4h→离心→取上清液→pH值为4.0条件下酸沉→离心→取沉淀→水洗，调pH值为7.0→冷冻干燥→碱提米糠谷蛋白→Osborne分级提取，得到米糠谷蛋白；

(2)选用pH值为10.0，浓度为0.1mol/L的Na₂CO₃-NaHCO₃作为缓冲液对大米谷蛋白进行初步的分离；以pH值12.0，浓度为0.05mol/L Na₂HPO₄-NaOH缓冲液溶解碱提米糠谷蛋白，利用DEAE-52阴离子交换层析介质对碱提米糠谷蛋白进行进一步分离纯化；

(3)制备米糠蛋白悬浮液，按碱性蛋白酶/谷蛋白质量比为1.5％-1.8％的比例添加碱性蛋白酶→调pH值为10.0→50℃下超级恒温水浴酶反应器中溶解30min→酶解4.2h→灭酶→离心→取上清液→真空浓缩→冷冻干燥，得大米谷蛋白肽；

(4)对大米谷蛋白肽进行分离纯化后得抗氧化活性肽。

下面对本发明作进一步说明：

本发明所述大米活性肽的制备方法包括以下步骤：

(1)谷蛋白的提取：通过碱提酸沉法提取谷蛋白，选用离子交换和凝胶层析技术对大米谷蛋白进行分离纯化；

(2)米糠谷蛋白的水解：5％(w/v，g/mL)米糠谷蛋白悬浮液→调pH值→一定温度下超级恒温水浴酶反应器中溶解30min→按一定的底物浓度、加酶量、pH值、温度进行酶解(恒pH滴定仪使体系pH稳定)→85℃，10min灭酶→3500r/min离心15min→上清液→真空浓缩→冷冻干燥→米糠谷蛋白肽；

(3)米糠谷蛋白肽的分离纯化

①利用SP-Sephadex G-25作为离子交换层析介质，pH4.0，0.02mol/L HAc-Na Ac为起始缓冲液，流速2mL/min，用平衡缓冲液、含0.5mol/L NaCl的平衡缓冲液和含1mol/L NaCl的平衡缓冲液梯度洗脱，选取米糠谷蛋白水解产物多个肽组分中自由基清除能力最强的组分。

②利用Sephadex G-15凝胶层析将①所选组分分离成几个组分，选取自由基清除能力最强的组分。

③利用制备RP-HPLC将上个步骤所选组分进一步分离，选取几个主要组分，通过测定各主要组分的自由基清除能力筛选出抗氧化活性较强的组分，再经RP-HPLC分析是否为相对单一峰。

(4)采用MALDI-TOF/TOF MS质谱分析法测得提取出的大米活性肽的相对分子量。结合TOF-MS/MS串联质谱得出其氨基酸组成和其排列顺序。

与现有技术相比，本发明方法制备的米糠活性肽更有效的利用了米糠，提高了大米生产中副产物的利用，也节约了生产成本，对实现米糠蛋白的综合利用和提高其附加值具有重要的意义。

附图说明

图1为TOF-MS/MS串联质谱测定结果图；

图2为离子交换层析分离得到的组分PA-PG的ABTS·⁺自由基清除能力；**表示清除率最高的组分和其他组分之间存在显著性差异；

图3为凝胶层析分离得到的组分PF₁-PF₄的ABTS·⁺自由基清除能力；**表示清除率最高的组分和其他组分之间存在显著性差异；

图4为RP-HPLC分离得到的组分PF₃-α到F₃-γ的ABTS·⁺自由基清除能力；**表示清除率最高的组分和其他组分之间存在显著性差异。

具体实施方式

实施例1

所述米糠抗氧化活性肽的分离制备方法包括如下步骤：

(1)碱提酸沉法提取米糠谷蛋白的工艺流程为：脱脂米糠(过60目筛)→加水并调pH9.0(料液比1:10，所述料液比的单位为mL/g，水浴：40℃，4h)→离心(8000r/min，15min)→取上清液→酸沉(pH 4.0)→离心(8000r/min，15min)→取沉淀→水洗三次，调ph7.0→冷冻干燥(48h)→碱提米糠谷蛋白(4℃密封储藏+硅胶)→Osborne分级提取，得到较纯的谷蛋白；

(2)选用Na₂CO₃-NaHCO₃(pH10.0，0.1mol/L)作为缓冲液对大米谷蛋白进行初步的分离。以0.05mol/L Na₂HPO₄-NaOH(pH12.0)缓冲液溶解碱提米糠谷蛋白，利用DEAE-52阴离子交换层析介质对碱提米糠谷蛋白进行了进一步分离纯化，依次用0.15mol/L、0.25mol/L、0.35mol/L、0.45mol/L、0.55mol/L的含盐缓冲液阶段洗脱碱提大米谷蛋白，分离得到五个洗脱峰R₁、R₂、R₃、R₄、R₅，采用HPLC对R₃组分进行纯度分析，其纯度为71.55％。收集R₃采用Sephadex G-75凝胶过滤层析进一步纯化，得到R₃-α、R₃-β、R₃-γ三个洗脱峰，经HPLC检测，其中R₃-γ洗脱峰的分子量为37530.34，纯度达93.45％；

(3)5％(w/v，g/mL)米糠谷蛋白悬浮液，按照碱性蛋白酶/谷蛋白为1.5％-1.8％(g/g)的比例添加碱性蛋白酶→调pH值为10.0→50℃下超级恒温水浴酶反应器中溶解30min→酶解4.2h(用pH滴定仪使体系pH稳定)→85℃，10min灭酶→3,500r/min离心15min→上清液→真空浓缩→冷冻干燥→大米谷蛋白肽；

(4)大米谷蛋白肽的分离纯化

①利用SP-Sephadex C-25作为离子交换层析介质，pH4.0，0.02mol/L HAc-NaAc为起始缓冲液，流速2m L/min，用平衡缓冲液、含0.5mol/L NaCl的平衡缓冲液和含1mol/L NaCl的平衡缓冲液梯度洗脱，谷蛋白中性蛋白酶水解产物混合肽组分被分离出七个组分(PA-PG)，组分PF的ABTS·⁺自由基清除能力最强(71.09％，图2)。

②利用Sephadex G-15凝胶层析以超纯水为缓冲液，进样浓度为15mg/mL又将组分PF分成了4个组分PF₁、PF₂、PF₃和PF₄。检测发现，组分PF₃的ABTS·⁺自由基清除能力最强，达到69.24％(图3)。

③利用制备RP-HPLC将PF₃进一步分成了5个主要组分，通过测定各组分的自由基清除能力筛选出抗氧化活性最强的组分为PF₃-γ(图4)，其ABTS·⁺自由基清除能力达到78.59％，经RP-HPLC分析为相对单一峰。

(5)采用MALDI-TOF MS质谱分析法测得抗氧化活性肽PF₃-γ的相对分子量为1002.06(图1)。

结合TOF-MS/MS串联质谱得出；PF_3-γ由8个氨基酸组成，其排列顺序为Lys-His-Asn-Arg-Gly-Asp-Glu-Phe(KHNRGDEF)。经查新发现，本发明得到的活性肽为具有抗氧化活性的新的活性肽序列。

实施例2米谷蛋白活性肽体内抗氧化活性的检测

选择对数生长期的细胞，用无EDTA胰酶消化后制成细胞悬液，用计数板测定悬液中的细胞浓度，按照每孔5000个细胞接种于96孔板，每孔接种100μL，每组设6个复孔，在37℃5％CO₂培养箱中培养6小时后分为正常组、H₂O₂处理组、H₂O₂+米谷蛋白活性肽保护组，将原有培养基吸出，所有组先加入80μL的培养基，正常组、H₂O₂处理组加入10μL的无血清培养基，H₂O₂+米谷蛋白活性肽保护组分别加入相应浓度等体积米谷蛋白活性肽，使药物终浓度分别为100、150、200μmol/L，于37℃5％CO₂培养箱预保护4h后，H₂O₂处理组和H₂O₂+米谷蛋白活性肽保护组每孔加入10μL H₂O₂，其终浓度为100μml/L，正常对照组加入10μL无血清培养基，于37℃5％CO₂培养箱孵育24h后，MTS法检测细胞活力(见表1)。与正常组比较，H₂O₂损伤组的细胞存活率显著下降；而与H₂O₂处理组比较，米谷蛋白活性肽的高剂量组(200μmol/L)对H₂O₂诱导的细胞活力有明显改善。

表1米谷蛋白活性肽对H₂O₂损伤的内皮祖细胞的细胞活力的影响