噁二唑类化合物及其在制备预防和/或治疗2型糖尿病药物中的应用的制作方法

本发明涉及一类新的噁二唑类PTP1B抑制剂及其合成方法、药理活性和药学用途。该类衍生物通过抑制PTP1B活性，增强胰岛素受体敏感性，使胰岛素生理功能正常发挥，进而调控血糖，达到对胰岛素抵抗类2型糖尿病的治疗功效。

背景技术：

糖尿病是由胰岛素分泌不足或靶组织对胰岛素的敏感性降低，而引起的慢性代谢性疾病。世界卫生组织(WHO)于2014年11月公布的数据显示，全球的糖尿病患者高达3.47亿。糖尿病分为胰岛素依赖型(1型)和胰岛素抵抗型(2型)，其中2型糖尿病患者占糖尿病病例的90％以上。目前市场上用于治疗2型糖尿病的口服药物主要有α-糖苷酶抑制剂、促胰岛素分泌剂、双胍类和噻唑烷二酮等类型降糖药。由于它们都是针对病症而不是病因靶点的设计药物，存在低血糖、乳酸中毒以及心脏猝中等多种弊端。寻找安全、高效的靶向型新药成为糖尿病治疗的迫切需求。

胰岛素抵抗是2型糖尿病的重要临床指征。作为胰岛素信号通路的负调控因子，PTP1B的过表达可以阻断胰岛素信号的传递，抑制糖原的合成。敲除PTP1B基因或抑制PTP1B酶，可以显著提高受试小鼠对胰岛素的敏感性，有效缓解胰岛素抵抗。因此，设计开发靶向PTP1B的小分子抑制剂，被认为是治疗2型糖尿病的新途径。

PTP1B作为治疗2型糖尿病药物新靶点的研究起步较晚，目前尚无针对此靶点的临床药物上市。处于研究阶段的化合物类型多种多样，主要有二氟亚甲基膦酸酯类、水杨酸类、杂环羧酸类、氨基磺酸类、N-草酰胺苯甲酸类化合物。由于这些化合物大多包含磷酸或羧酸基团，较高的亲水性和电负性导致其细胞透过性和生物利用度太低。研究者认为，PTP1B抑制剂的研发，需要电中性的化合物。

因此，我们从海藻中发现的溴代海洋天然产物为先导，设计合成了一系列电中性且具有PTP1B抑制活性的噁二唑类化合物。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一类噁二唑类化合物，该类化合物通过抑制PTP1B的活性，增强胰岛素受体敏感性，可用于治疗胰岛素抵抗类2型糖尿病。

所述化合物具有下述的结构：

其中：

R选自-CH₂Ph-R₁，-CH₂COOPh-R₂，-CH₂COPh-R₃。R₁,R₂,R₃选自F，Br，C1～C6的饱和烷基，C1～C6的饱和烷氧基。R₁,R₂,R₃的数量为0,1,2。

本发明的噁二唑类化合物的制备方法如下：

3,4-二羟基苯甲酸(1)在无水乙醇中酯化，得到3,4-二羟基苯甲酸乙酯(2)，再经过肼解、环合两步，合成得到噁二唑中间体(3)。化合物3分别与取代苄氯(4)、氯乙酰酯(5)、α-溴代苯乙酮(6)等化合物缩合，即可获得本发明的目标产物(7、8、9)。

对通过上述方法获得的化合物，我们通过多种手段检测了它们的PTP1B抑制能力。结果表明，本发明的上述具有新结构的化合物具有高效的PTP1B抑制活性，能够通过负调控胰岛素信号转导通路，增强胰岛素受体敏感性，使胰岛素生理功能正常发挥，进而调控血糖，达到对胰岛素抵抗类2型糖尿病的治疗功效。

基于此，本发明指出上述噁二唑类化合物可以用于制备PTP1B抑制剂，并进一步用于制备抗2型糖尿病药物。所述的PTP1B抑制剂或相应的抗2型糖尿病药物，可以是化合物的单质剂型，也可以是有效量的噁二唑类化合物与适量的药用辅剂混合形成的组合制剂。

本发明所述的噁二唑类化合物，通过竞争性结合和拮抗PTP1B，从而增强胰岛素受体敏感性，进而调控血糖，实现其作为抗2型糖尿病药物的应用。

附图说明

图1.Western blot法检测蛋白IRβ、IRS1和Akt的磷酸化水平示意图。NC为空白对照，PC为阳性对照，化合物浓度为10μM、1μM、0.1μM。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：4-(5-(苄硫基)-1,3,4-噁二唑-2-取代)苯-1,2-羟基的合成和结构鉴定

将15.4g(0.1mol)3,4-二羟基苯甲酸和200mL无水乙醇加入到500mL烧瓶中，在不断搅拌下慢慢滴加5mL质量分数98％的浓硫酸。混合物加热回流，TLC跟踪反应，减压蒸去80％体积的溶剂，用30mL乙酸乙酯和25mL水稀释，水层用300mL乙酸乙酯萃取，合并有机层，用饱和NaHCO₃水溶液、饱和食盐水洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤，减压脱溶，得3,4-二羟基苯甲酸乙酯15.8g，产率86.8％。

取上步固体3,4-二羟基苯甲酸乙酯15.8g，加入100mL无水乙醇中，加热60℃，搅拌下慢慢滴加37.5g(0.6mol)质量分数80％的水合肼，滴毕，回流6h。冷却，减压蒸去80％体积的溶剂，加100mL水，待固体析出后，过滤水洗，无水乙醇重结晶，得3,4-二羟基苯甲酰肼12g，产率88.9％。

在500mL烧瓶中一次加入12g 3,4-二羟基苯甲酰肼，4g KOH的200mL无水乙醇和12g CS₂，搅拌加热回流4h。反应结束后，减压蒸去80％体积的溶剂，滴加质量分数10％稀盐酸至pH＝6，析出大量固体，过滤，200mL无水乙醇重结晶，得5-苯基-2-巯基-1,3,4-噁二唑10.3g，产率69.1％。

取210mg(1mmol)5-苯基-2-巯基-1,3,4-噁二唑、56mg(1mmol)KOH加入10mL水中，搅拌下滴加120μL苄基氯的20mL无水乙醇溶液，滴完后，常温反应30分钟，过滤，水洗，干燥，得4-(5-(苄硫基)-1,3,4-噁二唑-2-取代)苯-1,2-羟基152mg。

结构表征:M.p.213.2-214.5℃，TOF MS(EI⁺):C₁₅H₁₂N₂O₃S,(m/z):calcd for 300.0569,found 300.0328.

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.79(s,1H),9.52(s,1H),7.43(d,J＝7.4Hz,2H),7.36–7.29(m,3H),7.25(dd,J＝17.4,8.3Hz,2H),6.86(d,J＝8.2Hz,1H),4.51(s,2H).

¹³C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ165.95(s),162.36(s),149.79(s),146.30(s),137.08(s),129.43(s),129.01(s),128.17(s),119.09(s),116.63(s),114.30(s),113.71(s),36.39(s).

DEPT(135°)δ129.43(CH),129.01(CH),128.17(CH),119.09(CH),116.63(CH),113.70(CH),36.38(negative peak,CH₂).

DEPT(90°)δ129.43(CH),129.01(CH),128.17(CH),119.09(CH),116.63(CH),113.70(CH).

实施例2：p-甲苯基-2-((5-(3,4-二羟基苯基)-1,3,4-噁二唑-2-取代)巯基)乙酸酯的合成和结构鉴定

将15.4g(0.1mol)3,4-二羟基苯甲酸和200mL无水乙醇加入到500mL烧瓶中，在不断搅拌下慢慢滴加5mL质量分数98％的浓硫酸。混合物加热回流，TLC跟踪反应，减压蒸去80％的溶剂，用30mL乙酸乙酯和25mL水稀释，水层用乙酸乙酯萃取，合并有机层，用饱和NaHCO₃水溶液、饱和食盐水洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤，减压脱溶，得3,4-二羟基苯甲酸乙酯15.8g，产率86.8％。

取上步固体3,4-二羟基苯甲酸乙酯15.8g，加入100mL无水乙醇中，加热60℃，搅拌下慢慢滴加37.5g(0.6mol)质量分数80％的水合肼，滴毕，回流6h。冷却，减压蒸去80％的溶剂，加100mL水，待固体析出后，过滤水洗，200mL无水乙醇重结晶，得3,4-二羟基苯甲酰肼12g，产率88.9％。

在500mL烧瓶中一次加入12g 3,4-二羟基苯甲酰肼，4g KOH的200mL无水乙醇和12g CS₂，搅拌加热回流4h。反应结束后，减压蒸去80％的溶剂，滴加质量分数10％稀盐酸至pH＝6，析出大量固体，过滤，200mL无水乙醇重结晶，得5-苯基-2-巯基-1,3,4-噁二唑10.3g，产率69.1％。

取210mg(1mmol)5-苯基-2-巯基-1,3,4-噁二唑、56mg(1mmol)KOH加入10mL水中，搅拌下滴加130μL p-甲苯基-2-氯乙酸乙酯的20mL无水乙醇溶液，滴完后，常温反应30分钟，过滤，水洗，干燥，得p-甲苯基-2-((5-(3,4-二羟基苯基)-1,3,4-噁二唑-2-取代)巯基)乙酸酯。

结构表征:M.p.206.4-207.8℃，TOF MS(EI⁺):C₁₇H₁₄N₂O₅S,(m/z):calcd for 358.0674,found 358.0265.

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.87(s,1H),9.59(s,1H),7.32(d,J＝1.7Hz,1H),7.25(dd,J＝8.2,1.7Hz,1H),7.19(d,J＝8.2Hz,2H),6.97(d,J＝8.3Hz,2H),6.87(d,J＝8.2Hz,1H),4.46(s,2H),2.26(s,3H).

¹³C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ167.49(s),166.13(s),161.99(s),149.87(s),148.58(s),146.32(s),135.91(s),130.42(s),121.50(s),119.18(s),116.64(s),114.16(s),113.72(s),34.42(s),20.80(s).

DEPT(135°)δ130.41(CH),121.50(CH),119.18(CH),116.63(CH),113.72(CH),34.42(negative peak,CH₂),20.80(CH₃).

DEPT(90°)δ130.42(CH),121.50(CH),119.18(CH),116.64(CH),113.72(CH).

实施例3：3-乙氧基苯2-((5-(3,4-二羟基苯基)-1,3,4-噁二唑-2-取代)巯基)乙酸酯的合成和结构鉴定

将15.4g(0.1mol)3,4-二羟基苯甲酸和200mL无水乙醇加入到500mL烧瓶中，在不断搅拌下慢慢滴加5mL质量分数98％的浓硫酸。混合物加热回流，TLC跟踪反应，减压蒸去80％的溶剂，用30mL乙酸乙酯和25mL水稀释，水层用300mL乙酸乙酯萃取，合并有机层，用饱和NaHCO₃水溶液、饱和食盐水洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤，减压脱溶，得3,4-二羟基苯甲酸乙酯15.8g，产率86.8％。

取上步固体3,4-二羟基苯甲酸乙酯15.8g，加入100mL无水乙醇中，加热60℃，搅拌下慢慢滴加37.5g(0.6mol)质量分数80％的水合肼，滴毕，回流6h。冷却，减压蒸去80％的溶剂，加100mL水，待固体析出后，过滤水洗，200mL无水乙醇重结晶，得3,4-二羟基苯甲酰肼12g，产率88.9％。

在500mL烧瓶中一次加入12g 3,4-二羟基苯甲酰肼，4g KOH的200mL无水乙醇和12g CS₂，搅拌加热回流4h。反应结束后，减压蒸去80％的溶剂，滴加质量分数10％稀盐酸至pH＝6，析出大量固体，过滤，200mL无水乙醇重结晶，得5-苯基-2-巯基-1,3,4-噁二唑10.3g，产率69.1％。

取210mg(1mmol)5-苯基-2-巯基-1,3,4-噁二唑、56mg(1mmol)KOH加入10mL水中，搅拌下滴加214mg 3-乙氧苯2-氯乙酸酯的20mL无水乙醇溶液，滴完后，常温反应30分钟，过滤，水洗，干燥，得3-乙氧基苯2-((5-(3,4-二羟基苯基)-1,3,4-噁二唑-2-取代)巯基)乙酸酯。

结构表征:M.p.238.2-239.4℃，TOF MS(EI⁺):C₁₈H₁₆N₂O₆S,(m/z):calcd for 388.0729,found 388.0136.

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.84(s,1H),9.56(s,1H),7.34(d,J＝1.5Hz,1H),7.25(dd,J＝8.3,1.5Hz,1H),7.00(d,J＝8.9Hz,2H),6.90(m,3H),4.46(s,2H),3.97(q,J＝6.9Hz,2H),1.28(t,J＝6.9Hz,3H).

¹³C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ167.65(s),166.13(s),161.97(s),156.79(s),149.89(s),146.34(s),144.06(s),122.63(s),119.15(s),116.66(s),115.44(s),114.18(s),113.76(s),63.83(s),34.42(s),15.03(s).

DEPT(135°)δ122.63(CH),119.14(CH),116.66(CH),115.44(CH),113.76(CH),63.83(negative peak,CH₂),34.42(negative peak,CH₂),15.03(CH₃).

DEPT(90°)δ122.63(CH),119.15(CH),116.66(CH),115.44(CH),113.76(CH).

实施例4：1-(2-溴苯基)-2-((5-(3,4-二羟基苯基)-1,3,4-噁二唑-2-取代)巯基)乙酮的合成和结构鉴定

将15.4g(0.1mol)3,4-二羟基苯甲酸和200mL无水乙醇加入到500mL烧瓶中，在不断搅拌下慢慢滴加5mL质量分数98％的浓硫酸。混合物加热回流，TLC跟踪反应，减压蒸去80％的溶剂，用30mL乙酸乙酯和25mL水稀释，水层用300mL乙酸乙酯萃取，合并有机层，用饱和NaHCO₃水溶液、饱和食盐水洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤，减压脱溶，得3,4-二羟基苯甲酸乙酯15.8g，产率86.8％。

取上步固体3,4-二羟基苯甲酸乙酯15.8g，加入100mL无水乙醇中，加热60℃，搅拌下慢慢滴加37.5g(0.6mol)质量分数80％的水合肼，滴毕，回流6h。冷却，减压蒸去80％的溶剂，加100mL水，待固体析出后，过滤水洗，200mL无水乙醇重结晶，得3,4-二羟基苯甲酰肼12g，产率88.9％。

在500mL烧瓶中一次加入12g 3,4-二羟基苯甲酰肼，4g KOH的200mL无水乙醇和12g CS₂，搅拌加热回流4h。反应结束后，减压蒸去80％的溶剂，滴加质量分数10％稀盐酸至pH＝6，析出大量固体，过滤，200mL无水乙醇重结晶，得5-苯基-2-巯基-1,3,4-噁二唑10.3g，产率69.1％。

取210mg(1mmol)5-苯基-2-巯基-1,3,4-噁二唑、56mg(1mmol)KOH加入10mL水中，搅拌下滴加276mg 2-溴-1-(2-溴苯基)乙酮的20mL无水乙醇溶液，滴完后，常温反应30分钟，过滤，水洗，干燥，得1-(2-溴苯基)-2-((5-(3,4-二羟基苯基)-1,3,4-噁二唑-2-取代)巯基)乙酮。

结构表征:M.p.278.6-279.5℃，TOF MS(EI⁺):C₁₆H₁₁BrN₂O₄S,(m/z):calcd for 406.0623,found 406.0328.

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.14(s,1H),8.00(d,J＝7.7Hz,1H),7.86(d,J＝7.8Hz,1H),7.51(t,J＝7.9Hz,1H),7.26(s,1H),7.18(d,J＝7.9Hz,1H),6.82(d,J＝7.5Hz,1H),5.03(s,2H).

¹³C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ192.31(s),137.42(s),136.97(s),131.60(s),131.33(s),127.88(s),122.65(s),119.15(s),116.54(s),40.51(s).

DEPT(135°)δ136.97(CH),131.60(CH),131.33(CH),127.88(CH),119.15(CH),116.54(CH),109.99(CH),40.50(negative peak,CH₂).

DEPT(90°)δ136.97(CH),131.60(CH),131.33(CH),127.88(CH),119.15(CH),116.54(CH).

实施例5：1-(3,4-二氟苯基)-2-((5-(3,4-二羟基苯基)-1,3,4-噁二唑-2-取代)巯基)乙酮的合成和结构鉴定

将15.4g(0.1mol)3,4-二羟基苯甲酸和200mL无水乙醇加入到500mL烧瓶中，在不断搅拌下慢慢滴加5mL质量分数98％的浓硫酸。混合物加热回流，TLC跟踪反应，减压蒸去80％的溶剂，用30mL乙酸乙酯和25mL水稀释，水层用300mL乙酸乙酯萃取，合并有机层，用饱和NaHCO₃水溶液、饱和食盐水洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤，减压脱溶，得3,4-二羟基苯甲酸乙酯15.8g，产率86.8％。

取上步固体3,4-二羟基苯甲酸乙酯15.8g，加入100mL无水乙醇中，加热60℃，搅拌下慢慢滴加37.5g(0.6mol)质量分数80％的水合肼，滴毕，回流6h。冷却，减压蒸去80％的溶剂，加100mL水，待固体析出后，过滤水洗，200mL无水乙醇重结晶，得3,4-二羟基苯甲酰肼12g，产率88.9％。

在500mL烧瓶中一次加入12g 3,4-二羟基苯甲酰肼，4g KOH的200mL无水乙醇和12g CS₂，搅拌加热回流4h。反应结束后，减压蒸去80％的溶剂，滴加质量分数10％稀盐酸至pH＝6，析出大量固体，过滤，200mL无水乙醇重结晶，得5-苯基-2-巯基-1,3,4-噁二唑10.3g，产率69.1％。

取210mg(1mmol)5-苯基-2-巯基-1,3,4-噁二唑、56mg(1mmol)KOH加入10mL水中，搅拌下滴加234mg 2-溴-1-(3,4-二氟苯基)乙酮的20mL无水乙醇溶液，滴完后，常温反应30分钟，过滤，水洗，干燥，得1-(3,4-二氟苯基)-2-((5-(3,4-二羟基苯基)-1,3,4-噁二唑-2-取代)巯基)乙酮。

结构表征:M.p.239.1-240.2℃，TOF MS(EI⁺):C₁₆H₁₀F₂N₂O₄S,(m/z):calcd for 364.0329,found 364.0323.

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.80(s,1H),9.54(s,1H),8.11(t,J＝12Hz,1H),7.94(s,1H),7.64(dd,J＝18.4,8.5Hz,1H),7.28(s,1H),7.21(dd,J＝8.2,1.7Hz,1H),6.85(d,J＝8.2Hz,1H),5.07(s,2H).

¹³C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ191.26(s),165.93(s),162.16(s),149.81(s),146.30(s),132.99(s),126.96(s),119.10(s),118.72(s),118.58(s),118.44(s),118.30(s),116.60(s),114.23(s),113.70(s),40.54(s).

DEPT(135°)δ126.96(CH),119.10(CH),118.72(CH),118.58(CH),118.44(CH),118.30(CH),116.60(CH),113.70(CH).40.54(negative peak,CH₂)

DEPT(90°)δ126.90(CH),119.09(CH),118.72(CH),118.58(CH),118.44(CH),118.30(CH),116.60(CH),113.70(CH).

实施例6：1-(4-甲苯基)-2-((5-(3,4-二羟基苯基)-1,3,4-噁二唑-2-取代)巯基)乙酮的合成和结构鉴定

将15.4g(0.1mol)3,4-二羟基苯甲酸和200mL无水乙醇加入到500mL烧瓶中，在不断搅拌下慢慢滴加5mL质量分数98％的浓硫酸。混合物加热回流，TLC跟踪反应，减压蒸去80％的溶剂，用30mL乙酸乙酯和25mL水稀释，水层用300mL乙酸乙酯萃取，合并有机层，用饱和NaHCO₃水溶液、饱和食盐水洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤，减压脱溶，得3,4-二羟基苯甲酸乙酯15.8g，产率86.8％。

取上步固体3,4-二羟基苯甲酸乙酯15.8g，加入100mL无水乙醇中，加热60℃，搅拌下慢慢滴加37.5g(0.6mol)质量分数80％的水合肼，滴毕，回流6h。冷却，减压蒸去80％的溶剂，加100mL水，待固体析出后，过滤水洗，200mL无水乙醇重结晶，得3,4-二羟基苯甲酰肼12g，产率88.9％。

在500mL烧瓶中一次加入12g 3,4-二羟基苯甲酰肼，4g KOH的200mL无水乙醇和12g CS₂，搅拌加热回流4h。反应结束后，减压蒸去80％的溶剂，滴加质量分数10％稀盐酸至pH＝6，析出大量固体，过滤，200mL无水乙醇重结晶，得5-苯基-2-巯基-1,3,4-噁二唑10.3g，产率69.1％。

取210mg(1mmol)5-苯基-2-巯基-1,3,4-噁二唑、56mg(1mmol)KOH加入10mL水中，搅拌下滴加212mg 2-溴-1-(4-甲苯基)乙酮的20mL无水乙醇溶液，滴完后，常温反应30分钟，过滤，水洗，干燥，得1-(4-甲苯基)-2-((5-(3,4-二羟基苯基)-1,3,4-噁二唑-2-取代)巯基)乙酮。

结构表征:M.p.242.3-242.4℃，TOF MS(EI⁺):C₁₇H₁₄N₂O₄S,(m/z):calcd for 342.01297,found 342.0328.

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.04(d,J＝8.6Hz,2H),7.29(s,1H),7.25(d,J＝8.3Hz,2H),7.20(d,J＝8.2Hz,1H),7.02(d,J＝6.9Hz,4H),6.85(d,J＝8.2Hz,1H),5.04(s,2H),2.30(s,3H).

¹³C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ191.61(s),165.84(s),162.79(s),162.41(s),152.77(s),149.78(s),146.30(s),134.70(s),131.57(s),131.19(s),129.91(s),128.91(s),120.63(s),119.07(s),117.23(s),116.60(s),114.28(s),113.70(s),40.67(s),20.80(s).

DEPT(135°)δ131.56(CH),131.19(CH),128.91(CH),120.63(CH),119.07(CH),117.22(CH),116.59(CH),113.69(CH),40.66(negative peak,CH₂),20.80(CH₃).

DEPT(90°)δ131.57(CH),131.19(CH),129.34(CH),120.63(CH),119.07(CH),117.23(CH),116.60(CH),113.69(CH).

实施例7：蛋白酪氨酸磷脂酶1B抑制活性测定

采用分子生物学方法，构建基因重组的hGST-PTP1B-BL21E.Coli人类PTP1B工程菌，以GST亲和层析柱纯化hGST-PTP1B蛋白质，利用含有磷酸的多肽para-Nitrophenyl Phosphate(pNPP)被PTP1B酶解掉一个磷酸后的产物pNP在波长405nm处有吸收峰的原理，以PTP1B作用后生成pNP的量表示PTP1B酶活性变化以及化合物对酶活性的抑制情况，计算化合物PTP1B酶活力抑制率。

将实施例中的化合物，分别用DMSO配制成0.1μM、1μM、10μM、100μM不同浓度的供试品溶液，取1μL不同浓度的供试品溶液分别加入到99μL标准的测活体系(50mM Tris-HCl,pH 6.5,2mM pNPP,30nM hGST-PTP1B)，阴性对照：DMSO，阳性对照：正钒酸钠的DMSO溶液(浓度0.1μM、1μM、10μM、100μM，测试条件同供试品溶液)，反应温度为37℃，动态测定波长为405nm处的光吸收，时间30分钟。首先计算酶初速度期内单位时间光吸收强度的增量(单位：mO.D./min)，以此代表酶的初速度，然后依据公式％Inhibition＝(V_DMSO－V_Sample)/V_DMSO×100％计算样品对酶活性的抑制率(％Inhibition)，其中V_Sample表示加药组的初速度，V_DMSO表示DMSO组(即不加药组)的初速度。

以供试品化合物摩尔浓度为横坐标，以酶活性的抑制率(％Inhibition)为纵坐标作图，可得PTP1B酶抑制曲线。根据公式％Inhibition＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^(lgIC50-X)*h)对该曲线进行拟合，计算化合物对PTP1B的抑制活性IC₅₀值，即抑制剂抑制酶催化活性50％时所需的化合物浓度。其中，％Inhibition即酶活性抑制率，Bottom为抑制曲线底部值，Top为抑制曲线顶部值，X为供试品化合物浓度，h为hill系数。

表1噁二唑类化合物的PTP1B抑制活性

Table 1PTP1B Inhibitory of oxadiazol compounds

试验结果表明：以上化合物特别对蛋白质酪氨酸磷酸酯酶1B表现出显著的抑制作用,具有良好的抗2型糖尿病临床应用前景。

实施例8：化合物1-(4-甲苯基)-2-((5-(3,4-二羟基苯基)-1,3,4-噁二唑-2-取代)巯基)乙酮的细胞活性测定

将在培养瓶中长满瓶底面积90％的C2C12细胞重悬后以每孔4×10⁵个细胞铺到6孔板中，在培养箱中(37℃，体积95％空气和5％CO₂)用含质量浓度10％FBS(胎牛血清)的高糖DMEM培养C2C12细胞，待其细胞贴壁长满后用含体积浓度10％的马血清的高糖DMEM经过4天诱导成肌管，之后移除培养基并加入未加FBS的DMEM饥饿细胞24小时,随后吸掉每孔的培养基，将每孔重新加入2mL未加FBS的DMEM，并将化合物按1uM，0.5uM和0.25uM的浓度以每孔2ul的量加到试验孔，其中阴性对照孔和胰岛素孔均加入同样体积的DMSO，7.5小时后，胰岛素孔加入2uL10mM的胰岛素并放到培养箱继续培养。

30分钟后取出6孔板倒掉培养基，并每孔加入1mL预冷的4℃PBS清洗两次以除掉残留的培养基，之后将150uL含1mM PMSF的裂解液加入每孔，在冰上静置5分钟使细胞充分裂解，然后将细胞收集于1.5mL EP管中，并置于4℃离心机12000转离心10分钟后收集110uL上清液于新的EP管中。取一干净96孔板，每孔加入16uLPBS后再加入4uL蛋白样品，将样品稀释5倍，之后各孔加入200uLBCA工作液，于37℃放置20min,用酶标仪测定A562，之后根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度及10ug蛋白的上样量。每管加入26.5uL的loading buffer混匀放入95℃金属浴中加热10分钟，放到-20℃储存，用western blot法检测各处理样品中蛋白表达的差异。

如图1，化合物1-(4-甲苯基)-2-((5-(3,4-二羟基苯基)-1,3,4-噁二唑-2-取代)巯基)乙酮能够上调胰岛素信号通路关键蛋白IRβ、IRS1和Akt的磷酸化水平并呈现一定的浓度依赖性，如图1，pIRS1的表达水平随化合物浓度0.1μM、1μM、10μM的升高而依次增加。该化合物可以激活胰岛素信号通路，促进糖吸收降低血糖水平，因此该化合物具有一定的降糖潜力并对于新型降糖药物的开发具有重要意义。