表面展示表达谷氨酸脱羧酶的重组工程菌及其构建方法与应用与流程

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及表面展示表达谷氨酸脱羧酶的重组工程菌及其构建方法与应用。

背景技术：

γ-氨基丁酸(GABA)广泛存在于动物、植物和微生物中，是一种天然的功能性非蛋白质氨基酸。它具有降血压、抗惊厥、预防癫痫、改善睡眠、抗抑郁、改善脑细胞、促进激素分泌和保肝利肾等功能，也可作为合成生物可降解材料聚酰胺-4(PA4)和环境友好的塑料溶剂N-吡咯烷酮的前体物质。因此GABA在医药、食品保健、化工、农业等方面具有广泛的应用。

目前国内外GABA主要制备方法有化学合成法、微生物发酵法和生物转化酶法三种。谷氨酸脱羧酶(GAD)能催化L-谷氨酸裂解为GABA和二氧化碳，广泛存在于乳酸菌、大肠杆菌及曲霉菌等微生物中。基于GAD的生物转化酶法具有反应条件温和、产品纯度高、后处理工序简单、生产周期短、环境污染少等优点，是未来GABA制备工艺开发的主要方向。

微生物GAD是胞内酶，制备GAD酶制剂需经细胞破碎、提取与纯化等复杂步骤，加上酶纯化过程中活力的损失均会导致生产成本增加。利用微生物细胞制备GABA，可以省去冗繁的酶制备工艺与时间，大大节省成本，但由于菌体细胞壁与细胞膜的屏蔽作用，限制了底物与产物在细胞内外的交换，使菌体胞内的GAD难以充分发挥，严重影响了微生物的表观催化活力，使底物转化速率降低。有效改善菌体细胞壁与细胞膜对底物的传质阻力来提高GAD的表观催化活力对于高效制备GABA意义重大。

为提高含谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌的表观催化活力，人们采取了多种方法。如专利CN201110020575.6中将短乳杆菌的谷氨酸脱羧酶基因GADB、转运蛋白基因gadC和调控蛋白基因gadR共表达，实现谷氨酸进入细胞的速率与转化速率的提高。专利CN103789246B中报道了对诱导表达的重组菌加热处理提高菌体通透性的方法。专利CN103773731A中报道了诱导重组酶表达同时加入细胞壁合成抑制剂或表面活性剂干扰重组菌细胞壁和(或)细胞膜合成，增加菌体通透性、提高菌体表观催化活力的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服重组表达菌胞内酶需要细胞破碎后再分离纯化，步骤繁琐的弊端；以及利用含胞内酶的重组菌全细胞催化时受细胞壁和(或)细胞膜对底物与产物的传质阻力影响，表观催化活力不足的问题。本发明提供表面展示表达谷氨酸脱羧酶的重组工程菌及其构建方法与应用。本发明技术方案低成本，简便，易于操作，可高效提高菌体的谷氨酸脱羧酶的表观活力。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明首先提供一种表面展示表达谷氨酸脱羧酶的重组工程菌的构建方法，包括以下步骤：

将展示基元编码基因和谷氨酸脱羧酶编码基因融合串联，连接到表达载体上，构建、筛选重组表达载体，再将重组表达载体导入宿主细胞获得表面展示表达谷氨酸脱羧酶的重组工程菌。

所述的展示基元选自冰核蛋白(INP)、金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)、芽孢杆菌外层衣壳蛋白(CotB、CotC、OxdD等)、酵母表面蛋白(a-凝集素、ɑ-凝集素、Flolp等)或乳杆菌S层蛋白SlpA等，及其锚定功能结构域(展示基元蛋白中能起到靶定宿主细胞作用的部分蛋白功能区)。优选为冰核蛋白INP。

所述的谷氨酸脱羧酶编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

所述的谷氨酸脱羧酶编码基因可来源于大肠杆菌、短乳杆菌、乳酸乳球菌、植物乳杆菌、链球菌或酵母菌等。

所述的表达载体包括pET28a、pPIC9、pHT01、pMG36e等。

所述的构建、筛选重组表达载体的具体方法为：

根据大肠杆菌、短乳杆菌、乳酸乳球菌、植物乳杆菌、链球菌或酵母菌的谷氨酸脱羧酶编码基因序列，以及冰核蛋白、金黄色葡萄球菌蛋白A、芽孢杆菌外层衣壳蛋白的展示基元的编码序列设计引物，PCR扩增目的基因，用限制性内切酶双酶切两种目的基因，或通过重叠PCR将两种目的基因连接到一起并酶切，与相应酶切的载体连接，转化，抽提质粒，PCR或酶切鉴定阳性重组子，测序验证阳性重组子。

所述的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母、芽孢杆菌、乳酸菌，优选为大肠杆菌。

通过上述方法能够构建得到表面展示表达谷氨酸脱羧酶的重组工程菌。

本发明还提供所述的表面展示表达谷氨酸脱羧酶的重组工程菌的扩大培养方法，包括以下步骤：

1)构建表面展示表达谷氨酸脱羧酶的重组工程菌；

2)将获得的表面展示表达谷氨酸脱羧酶的重组工程菌接种到培养基中振荡培养，获得种子液；菌种子培养条件为：接种量1-5％，培养温度25-37℃，转速160-220rpm，培养12-16h。

3)将种子液转接到新的培养基中，振荡培养到OD600＝0.8-1.0时，加入诱导剂诱导谷氨酸脱羧酶的表达，收集得到表面展示表达谷氨酸脱羧酶的重组工程菌；

重组菌表达培养条件为：接种量1-5％，培养温度25-37℃，转速160-220rpm，培养至OD600为0.8-1.0左右，依据表达载体类型加入适当诱导剂后，于16-28℃低温继续培养12-20h。

诱导剂的选择依据本领域技术人员的常规知识进行选择。比如，若选择的大肠杆菌表达载体为pET28a，需用β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导；若选择的是酵母表达载体pPIC9，需用甲醇诱导；若选择的是乳酸菌表达载体pMG36e，则不需诱导即可表达。

本发明还提供重组工程菌的应用，利用表面展示表达谷氨酸脱羧酶的重组工程菌转化谷氨酸制备γ-氨基丁酸。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明通过使重组酶表达在宿主细胞表面，直接与底物和产物接触，避免重组全细胞催化过程中细胞壁和(或)细胞膜对底物与产物传质的阻隔作用。因重组酶展示表达在重组菌表面，底物不需进入菌体细胞就可与重组酶接触完成转化，达到提高重组菌体表观活力的目的。

在重组细胞培养过程中不需添加任何细胞壁合成抑制剂或干扰剂，培养并收集细胞后可避免加入有机溶剂、表面活性剂等透性化试剂或进行加热、冻融等后续透性化处理细胞的步骤及相关设备运转的投入。不仅节约了成本，简化了操作，还不会对下游产品(GABA)品质造成影响，为制备高表观活力GAD活性菌体催化剂提供了一种低成本、简便方法。

本发明的方法所需设备简单，成本更低，操作更简便、更易于工业化应用。

附图说明

图1为大肠杆菌胞内表达与表面展示谷氨酸脱羧酶重组质粒的构建流程图。

图2为谷氨酸脱羧酶基因PCR扩增结果。

其中，1为PCR扩增gadB基因；M为DNA Mark IV标准分子量。

图3为重组质粒pET28a-gadB的PCR鉴定结果。

其中1-4分别为挑取转化后平板上的单克隆，M为DNA Mark IV标准分子量。

图4为冰核蛋白(INP)N端171个氨基酸和224个氨基酸编码序列的PCR扩增结果。

其中，1为PCR扩增的INP N端171个氨基酸编码基因；2为PCR扩增的INQ N端224个氨基酸编码基因；M为DNA Mark IV标准分子量。

图5为重组质粒pET28a-INP171-gadB的PCR鉴定结果。

其中1-4分别为挑取转化后平板上的单克隆，M为DNA Mark IV标准分子量。

图6为重组质粒pET28a-INP171-gadB转化BL21(DE3)表达后蛋白的SDS-PAGE图。

其中，1为标准蛋白；2为诱导前的重组菌；3为重组菌株的细胞破碎液上清；4为重组菌株的细胞破碎液的沉淀。

图7为重组质粒pET28a-INP171-gadB的Xho I和BamH I双酶切鉴定结果。

其中，1-4分别为经PCR鉴定后的单克隆，M为DNA Mark IV标准分子量。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

本发明的以下实施例中使用的培养基和试剂信息如下：

LB液体培养基：蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、NaCl 1％、pH 7.0(百分含量是指质量分数)。

LB固体培养基：蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、NaCl 1％、琼脂1.5％、pH 7.0(百分含量是指质量分数)。

改良MRS培养基：蛋白胨10g、酵母提取物5g、K₂HPO₄ 2g、柠檬酸三铵2g、吐温80 1ml、NaAc 5g、MgSO₄ 0.5g、MnSO₄ 0.25g、葡萄糖20g、加水至1L，pH 6.2-6.8。

磷酸盐缓冲液：磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.2mol/L)，pH 7.4。

磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：磷酸氢二钠(0.2mol/L)、柠檬酸(0.1mol/L)，pH 4.0。

硼砂-硼酸缓冲液：含硼砂根(0.2mol/L)、硼酸0.2mol/L、硼砂0.05mol/L，pH 9.0。

反应液：0.2M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(L-MSG 1M，PLP 0.1M,pH 4.0)。

本发明的以下实施例中使用的引物均委托上海捷瑞生物工程技术有限公司合成。测序均委托上海美吉基因测序公司完成。质粒DNA的抽提、回收和纯化分别使用细菌质粒提取试剂盒(购自捷瑞公司)和胶回收试剂盒(购自捷瑞公司)完成。限制性内切酶均购自日本Takara公司。PCR扩增使用Taq DNA聚合酶(购自日本Takara公司)完成，反应体系和反应条件参照说明书设置。

本发明的以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。

本发明的以下实施例中使用的原料或试剂除特别注明外，均市售可得。除特别注明外，％均代表重量体积(w/v)百分比。

实施例1、大肠杆菌胞内表达与表面展示谷氨酸脱羧酶重组质粒的构建

大肠杆菌胞内表达与表面展示谷氨酸脱羧酶重组质粒的构建流程如图1所示。根据GenBank中大肠杆菌的GAD的β亚型基因序列(具体序列见SEQ ID No.1，或GenBank No.EF551361.1)，设计并合成引物gadB-F和gadB-R，其序列如下所示：

gadB-F：5’-AATTGGATCCATGGATAAGAAGCAAG-3’，下划线对应碱基表示BamH I酶切位点；

gadB-R：5’-AAGGCTCGAGGGTATGTTTAAAGCTG-3’，下划线对应碱基表示Xho I酶切位点。

以大肠杆菌菌株的总DNA为模板，使用gadB-F和gadB-R引物对进行PCR扩增，结果见图2，其中1为PCR扩增gadB基因，M为DNA Mark IV标准分子量。由图2可见，泳道1中出现约1400bp，与目标基因大小一致的扩增条带，PCR扩增成功。PCR产物纯化后利用BamH I和Xho I双酶切，琼脂糖电泳后割胶回收。将质粒pET28a(+)利用BamH I和Xho I双酶切，琼脂糖电泳后割胶回收。回收的质粒大片段与酶切回收的目标基因gad B以摩尔比1:3的比例混合后加入连接酶连接过夜，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞。挑取4个单克隆，过夜培养后抽提质粒，BamH I和Xho I双酶切鉴定(图3)。图3显示，挑取的4个单克隆抽提的质粒酶切后均出现约1400bp的目标基因带和约5300bp的pET28a(+)质粒带，说明目的基因可能已成功的克隆到选取的载体上，测序分析证实质粒pET28-gadB构建成功。

根据GenBank中丁香假单胞杆菌的INP的编码基因序列(见GenBank:EU360731.1)，设计并合成引物inp-F、inp171-R和inp224-R，其序列如下所示：

inp-F：5’-ggatccatgGATCTCGACAAGGCGT-3’，下划线对应碱基表示Nco I酶切位点；

inp171-R：5’-gaattcggatccGGTCTGCAAATTCTGC-3’，下划线对应碱基表示BamH I酶切位点；

inp224-R：5’-gaattcggatccAATCAGATCACTGTGG-3’，下划线对应碱基表示BamH I酶切位点。

以丁香假单胞菌的总DNA为模板，使用inp-F和inp171-R或inp-F和inp224-R引物对进行PCR扩增，图4为冰核蛋白(INP)N端171个氨基酸和224个氨基酸编码序列的PCR扩增结果。其中，1为PCR扩增的INP N端171个氨基酸编码基因；2为PCR扩增的INQ N端224个氨基酸编码基因；M为DNA Mark IV标准分子量。由图4可见，泳道1、2的PCR产物大小分别约为500bp和670bp，与目标片段理论大小相符，PCR扩增目标基因成功。PCR产物纯化后利用Nco I和BamH I双酶切，琼脂糖电泳后割胶回收。

将质粒pET28a(+)利用Nco I和Xho I双酶切，琼脂糖电泳后割胶回收。回收的质粒大片段与酶切回收的目标基因gad B及inp 171(或inp224)片段以摩尔比1:3:3的比例混合加入连接酶连接过夜，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞。随机挑取单克隆，PCR鉴定阳性重组子后，抽提质粒，利用BamH I与Xho I双酶切，结果见图5，其中1-4分别单克隆1-4#重组质粒双酶切后的结果，M为DNA Mark IV标准分子量。图5表明，双酶切后约1400bp的gadB目的基因处与约6000bp载体pET28a-INP171大小对应的位置均有条带，说明表面展示的冰核蛋白基因inp171与谷氨酸脱羧酶基因gadB可能已成功构建到表达载体pET28a上获得重组质粒pET28a-INP171-gadB和pET28a-INP224-gadB，测序分析证实结果正确。

实施例2大肠杆菌重组胞内GAD酶及重组表面展示GAD酶的表达

将质粒pET28a-gad B、pET28a-INP171-gadB和pET28a-INP224-gadB分别转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布含有50ug/mL卡那霉素的LB固体培养基的平皿，37℃倒置培养过夜。分别挑取单克隆，接种含有50ug/mL卡那霉素的LB液体培养基，于37℃，180rpm转速的恒温摇床中培养10-12h。取培养液以2％的接种量接种到新鲜的含50ug/mL卡那霉素的LB培养基中，在37℃、180rpm的摇床中振荡培养至OD600达0.6-0.8时，加入终浓度为0.4mM的IPTG，16℃、180rpm继续振荡培养14-16h，诱导GAD酶的表达。

4℃、5000×g离心20分钟收集菌体，用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(50mM，pH4.0)洗涤一次，弃去上清液，并将菌体按20OD/ml的浓度重悬于相应体积的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(50mM，pH4.0)，SDS-PAGE分析重组酶表达情况。

图6为重组质粒pET28a-INP171-gadB转化BL21(DE3)表达后蛋白的SDS-PAGE图。其中，M为标准蛋白；1为诱导前的重组菌；2为重组菌株的细胞破碎液上清；3为重组菌株的细胞破碎液的沉淀。由图可见，IPTG诱导后在约47kD处有目标蛋白INP171-gadB大小一致的新条带产生，重组蛋白表达成功，且主要以可溶的上清形式表达，几乎不形成包涵体。

实施例3含胞内表达GAD酶及表面展示表达GAD酶重组工程菌表观酶活力分析

取10OD实施例2获得的菌体，离心收集菌体。重悬于含有0.1M L-谷氨酸钠、10mM PLP的0.2M pH4.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，30℃，180rpm/min下反应15min。12000rpm离心30min，取10ul上清液，利用Berthelot显色法测定GABA生成量。

经测定，表面展示表达GAD酶重组工程菌表观酶活力为200U/g，而相同培养条件下胞内表达GAD酶重组工程菌表观酶活力为170U/g，前者比后者提高了17.65％。

实施例4含胞内表达GAD酶及表面展示表达GAD酶重组大肠杆菌工程菌转化L-谷氨酸制备γ-氨基丁酸

按实施例2的方法制备重组大肠杆菌工程菌，离心收集菌体沉淀，并精确称重。按反应体系中湿菌体量(W/g)与反应体系(V/mL)比W/V＝1:100的量将菌体加入含有1M L-谷氨酸钠、100mM PLP的0.2M pH4.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中。转化反应在30℃，180rpm/min下反应6h，每小时取样测产物生成量。

图7为重组菌pET28a-gadB与pET28a-INP171-gadB全细胞催化的比较，a为pET28a-gadB重组菌的全细胞催化结果，b为pET28a-INP171-gadB重组菌的全细胞催化结果。由图可见，随着时间的延长，GABA产量呈快速上升-慢速上升-维持平衡的趋势；前6h内，pET28a-INP171-gadB重组菌的催化速率快于pET28a-gadB重组菌，其原因可能是展示于细胞表面的谷氨酸脱羧酶与胞外底物接触机会多，避免了底物进出细胞的限制，表观反应速度增快；6h后两者差异不大主要原因是底物已完全转化成产物引起的；反应24h后，pET28a-INP171-gadB催化形成的产物GABA积累量达到165g/L，高出非展示重组菌pET28a-gadB重组菌23.04g/L，最终的摩尔转化率98.76％也比原始菌高出近10个百分点。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

<110>华东理工大学

<120>表面展示表达谷氨酸脱羧酶的重组工程菌及其构建方法与应用

<160>1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1398

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggataaga aggcgtcggt cgatttaagg tcggaactac tcgattcacg ttttggtgcg 60

aagtctattt ccactatcgc agaatcaaaa cgttttccgc tgcacgaaat gcgcgacgat 120

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