一种6‑溴色胺衍生物及其制备方法和用途与流程

本发明属于医药技术领域，，尤其是涉及一种6-溴色胺衍生物及其制备方法和应用。

背景技术：

阿尔兹海默症（alzheimer’sdisease，ad）俗称老年痴呆，是中枢神经系统的语言、学习、记忆等认识能力受损而产生的神经退行性疾病，是老龄人群中发病率最高的疾病之一。随着老龄化社会的到来，未来几十年ad发病人数势必急剧增加，将给我国医保系统造成巨大压力，抗老年痴呆药物的需求将有广阔的增长空间。目前，世界上较为接受的ad病理学说为“胆碱能缺失学说”，该学说认为老年性痴呆症患者大脑内神经递质-乙酰胆碱（acetylcholine，ach）的缺失是导致ad疾病的关键原因。医学治疗上多采用乙酰胆碱酯酶抑制剂（acetylcholinesteraseinhibitors，achei）抑制乙酰胆碱酯酶（ache）活性，延缓ach水解的速度，提高突触间隙ach的水平，从而发挥其对ad的治疗作用。

目前临床上还没有药物可以完全保护神经元，抑制神经元内部ach的降解是治疗老年痴呆症的主要手段achei是美国fda许可唯一作为治疗ad的药物，也是治疗ad最有效的药物之一。因此，抗老年痴呆药物的研发尤为迫切，寻找和发现新的乙酰胆碱酯酶抑制剂就显得尤为重要。

海洋天然产物历经数十年的研究，已经积累了相当丰富的研究资料，为海洋药物的开发提供了科学依据。从海洋生物中发现的大量活性天然成分，有的可以直接进入新药的研究开发，但有的活性成分存在着活性较低或毒性较大等问题。因此，需要将这些活性成分作为先导化合物进一步进行结构优化，如结构修饰和结构改造，以期获得活性更高、毒性更小的新的化学成分。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种可显著抑制ache的6-溴色胺衍生物及其制备方法和在治疗阿尔茨海默症方面的应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种6-溴色胺衍生物，结构式由（ⅰ）表示：

........（ⅰ）

通式（ⅰ）中r选自-cl或-h；

当r=-cl时，化合物为6-溴色胺氯代苯乙酸；

当r=-h时，化合物为即6-溴色胺苯丙酸。

上述6-溴色胺衍生物的制备方法，包括以下步骤：称取0.35mmol氯代苯乙酸或苯丙酸，用5ml二氯甲烷溶解，接着加入0.096gedc.hcl，出现白色浑浊液体，再加入0.068ghobt，常温下搅拌30min，白色浑浊现象消失，用薄层色谱检测反应过程，发现有新的点出现时，将7ml溶解有0.25mmol6-溴色胺的二氯甲烷滴加到反应液中，室温搅拌反应过夜，用薄层色谱检测，发现原料点消失，停止反应，蒸掉溶剂，得到粗品，最后用半制备型液相色谱分离微量产物，纯化得到6-溴色胺衍生物，其结构式由（ⅰ）表示：

........（ⅰ）

通式（ⅰ）中r选自-cl或-h；

当r=-cl时，化合物为6-溴色胺氯代苯乙酸；

当r=-h时，化合物为即6-溴色胺苯丙酸。

所述的半制备液相色谱条件：粗品用甲醇溶解，0.22μm孔径过滤，采用xbridge制备柱，每次进样量1ml，以甲醇与水按体积比65：35混合液为流动相，流速为8ml/min，pda检测波长为280nm。

上述6-溴色胺衍生物的应用，所述的6-溴色胺衍生物在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂方面的用途。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了一种6-溴色胺衍生物及其制备方法和应用，其对6-溴色胺进行结构改造得到6-溴色胺氯代苯乙酸和6-溴色胺苯丙酸衍生物，该6-溴色胺衍生物可显著抑制乙酰胆碱酯酶活性（ache），ic50分别为溴色胺氯代苯乙酸17.6µm，溴色胺苯丙酸22.3µm，显示易抑制ache，另外溴色胺氯代苯乙酸可竞争性抑制ache。因此，有望将6-溴色胺衍生物开发为治疗阿尔茨海默病药物。

附图说明

图1为体外检测溴色胺氯代苯乙酸对乙酰胆碱酯酶的抑制效率图；

图2为体外检测溴色胺苯丙酸对乙酰胆碱酯酶的抑制效率图；

图3为体外检测溴色胺苯丙酸对乙酰胆碱酯酶的抑制作用的lineweaverburk双倒数图；

图4为图3双倒数直线的斜率对溴色胺苯丙酸浓度的关系图；

图5为溴色胺氯代苯乙酸与乙酰胆碱酯酶的分子对接结果图；（图中配体使用球棍模型，受体氨基酸残基使用棍模型表示。球体表示不同原子。lp：亲脂性。受体表面深浅表示其亲脂性程度，深色表示亲脂性强、浅色表示亲水性强）；

图6为溴色胺苯丙酸与乙酰胆碱酯酶的分子对接结果图；（图中配体使用球棍模型，受体氨基酸残基使用棍模型表示。球体表示不同原子。lp：亲脂性。受体表面深浅表示其亲脂性程度，深色表示亲脂性强、浅色表示亲水性强）。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1

一种6-溴色胺衍生物，结构式由（ⅰ）表示：

........（ⅰ）

通式（ⅰ）中r选自-cl或-h；

当r=-cl时，化合物为6-溴色胺氯代苯乙酸；

当r=-h时，化合物为即6-溴色胺苯丙酸。

实施例2

溴色胺氯代苯乙酸的制备

称取0.35mmol氯代苯乙酸，用5ml二氯甲烷溶解，接着加入0.096g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（edc.hcl），出现白色浑浊液体，再加入0.068g1-羟基苯并三唑(hobt)，常温下搅拌30min，白色浑浊现象消失，用薄层色谱检测反应过程，发现有新的点出现时，将7ml溶解有0.25mmol6-溴色胺（其中6-溴色胺为6-溴色胺盐酸盐用氢氧化钠去除盐酸获得）的二氯甲烷滴加到上面的反应液中，室温搅拌反应过夜，用tlc检测，发现原料点消失，停止反应，蒸掉溶剂，得到粗品，最后用半制备型液相色谱分离微量产物。半制备液相色谱条件：粗品用甲醇溶解，0.22μm孔径过滤，采用xbridge制备柱（19mm×250mm，10μm），每次进样量1ml，以甲醇：水=65：35（v/v）为流动相，流速为8ml/min，pda检测波长为280nm，纯化得到溴色胺氯代苯乙酸，其结构如下：

。

实施例3

6-溴色胺苯丙酸的制备

称取0.35mmol苯丙酸，用5ml二氯甲烷溶解，接着加入0.096g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（edc.hcl），出现白色浑浊液体，再加入0.068g1-羟基苯并三唑(hobt)，常温下搅拌30min，白色浑浊现象消失，用薄层色谱检测反应过程，发现有新的点出现时，将7ml溶解有0.25mmol6-溴色胺的二氯甲烷滴加到上面的反应液中，室温搅拌反应过夜，用tlc检测，发现原料点消失，停止反应，蒸掉溶剂，得到粗品，最后用半制备型液相色谱分离微量产物。半制备液相色谱条件：粗品用甲醇溶解，0.22μm孔径过滤，采用xbridge制备柱（19mm×250mm，10μm），每次进样量1ml，以甲醇：水=65：35（v/v）为流动相，流速为8ml/min，pda检测波长为280nm，纯化得到苯丙酸，其结构如下：

。

实施例4

乙酰胆碱酯酶抑制活性测试实验

1、实验材料和试剂

实验试剂：碘代乙酰硫代胆碱(achi）购自sigma公司，溶于100mmol/lna2hpo4

溶液，浓度为20mmol/l。0.04mol/l的ph=7.4的na2hpo4溶液、0.1mol/l的ph=7.4的磷酸缓冲盐溶液（pbs）。浓度为2wt%的ph=7.4的5,5-二硫代-2-硝基苯甲酸（dithiobis-nitrobenzoicacid，dtnb）溶液（用0.01mol/l,ph=7.4的pbs配制），0.02mol/l碘代硫代乙酰胆碱（acetylthiocholine,achi,用0.1mol/l，ph=7.4的pbs配制），阳性对照6mol/l多奈哌齐（donepezil）。

脑匀浆液制备：小鼠斩首后取脑，在冰上分离取得全脑。全脑称重后，加入10倍重量的裂解缓冲液（hepes为10mmol/l，tritonx-100为0.5%，edta为5mmol/l，egta为5mmol/l，nacl为1000mmol/l，调节ph=7.5），匀浆直至破坏阻止。匀浆液超声处理30s后，3000rpm、4℃离心15min，吸取上清。

配制na2hpo4溶液：将14.2gna2hpo4粉末溶解定容到1000ml，浓度为0.04mol/l，调ph=7.4。

配制pbs缓冲液：将pbs粉末定容至500ml容量瓶中，配制得0.01mol/l，ph=7.4的pbs缓冲液。

5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)(dtnb)的配制：取100mgdtnb加入50ml浓度为0.04mol/l的ph=7.4的na2hpo4溶液，置于4℃保存供使用；

底物achi的配制：取290mg加入50ml浓度0.04mol/l的ph=7.4的na2hpo4溶液，配制得0.02mmol/l的achi。

2、实验方法

2.1化合物的乙酰胆碱酯酶抑制活性实验如下

（1）实验原理：一定条件下，碘代硫代乙酰胆碱在乙酰胆碱酯酶的作用下分解成碘代硫代胆碱，碘代硫代胆碱与显色剂dtnb迅速作用，生成的5-巯基-2-硝基苯甲酸是在412nm处具有紫外光吸收的黄色物质。乙酰胆碱酯酶与碘代硫代乙酰胆碱的作用反应如下：

碘化硫代乙酰胆碱碘代硫代胆碱

含巯基化合物可以与dtnb反应，断裂dtnb的二硫键产生2-硝基-5-硫代苯甲酸（ntb-），若在中性或碱性ph条件下的水中可以离子化，生成ntb2-二价阴离子。这种ntb2-离子呈现黄色。

dtnb5-巯基-2-硝基苯甲酸

(黄色)

（2）实验步骤

样品组：在96孔酶标板上中依次加入85μl浓度为0.04mol/l的ph=7.4的na2hpo4溶液，5μl乙酰胆碱脂酶（脑匀浆），加入5μl浓度为0.02mmol/l底物achi，再加入5μl样品，在37℃条件下反应30min。再加入75μl的2wt%的dtnb，用酶标仪在412nm波长处测定其吸光度值，做三组平行实验。

空白对照组：用5μlna2hpo4溶液代替5μl待测样品溶液，其它条件不变。

阳性对照组：用5μl浓度为6mol/l多奈哌齐（donepezil）溶液代替5μl待测样品溶液，其它条件不变。

抑制率(％)=[(空白对照组-阳性对照组)-(样品组-阳性对照组)]/(空白组-阳性对照组)×100％

根据不同浓度梯度的样品对乙酰胆碱酯酶的抑制率，绘制样品及多奈哌齐对乙酰胆碱酯酶的抑制曲线，并通过spss18软件计算得到化合物的ic50值。结果表明化合物作为抗乙酰胆碱酯酶活性的先导化合物进行后续衍生化开发。

双底物中底物模型ache活性抑制类型确定：实验操作：选择溴色胺苯丙酸进行抑制类型实验。在96孔板的样品测定孔中依次加入85μl浓度为0.04mol/l的ph=7.4的na2hpo4溶液，十种不同浓度的5μl乙酰胆碱脂酶（脑匀浆），5μl浓度为0.02mmol/l底物achi，每种浓度的脑匀浆都对应加入5μl两种浓度的样品，同时设置相应的的空白对照和阳性对照，在37℃条件下反应30min。再加入75μl的2wt%的dtnb，用酶标仪在412nm波长处测定其吸光度值。绘制米氏方程曲线，根据浓度曲线判定化合物的抑制类型。

2.2分子对接

ache结构信息为ache的三维晶体结构来自proteindatabank，其pdb序号为1zgc，是ache与其特异性抑制剂tacrine(10)-hupyridone（他克林衍生物）共结晶后通过x射线衍射得到的结果，分辨率为2.3埃；分子对接流程为分子对接使用软件为sybyl。小分子建模使用软件自带的powell方法优化。软件使用surflex-dock程序模拟配体与受体的对接。该方法模拟时，受体位置相对固定，受体可自由变化。模拟结束后可得到相应的分数（surflex-dockscore）。该分值越高，预测配体受体间的亲和力越强。

3、实验结果

3.16-溴色胺衍生物可直接抑制ache

采用上述ache活力测定方法检测6-溴色胺衍生物对ache的抑制作用。由图1可知，溴色胺氯代苯乙酸可剂量依赖性抑制ache，其半抑制剂量（ic50）为17.6µm，由图2可知，溴色胺丙酸可剂量依赖性抑制ache，其半抑制剂量（ic50）为22.3µm。同样条件下阳性对照donepezil的ic50为15nm。该结果表示岩藻黄素可直接抑制ache，但抑制活性较阳性对照donepezil低。

3.2溴色胺氯代苯乙酸竞争性抑制ache

采用上述ache活力测定方法测溴色胺氯代苯乙酸对ache的抑制模式。在ache活性测定体系中，固定ache浓度，改变底物achi浓度，测定不同浓度溴色胺氯代苯乙酸对酶活力的影响。酶促反应遵循米氏(michaelis-menten)动力学方程。lineweaverburk双倒数作图结果如图3所示，溴色胺氯代苯乙酸竞争性抑制ache。以双倒数直线的斜率对溴色胺氯代苯乙酸浓度作图如图4所示，得到抑制剂常数ki=52.3μm。

3.3分子对接结果

应用分子对接方法模拟6-溴色胺衍生物对ache的分子结合模式。结果如图5、6所示，提示6-溴色胺衍生物可能对ache有抑制作用。ache分子结构中有一个深而狭窄的沟，两个活性中心处于沟内，分别为tyr84、ser200、glu199、his440等氨基酸残基组成的催化阳性中心（cas）和tyr70、tyr121、tyr279等氨基酸残基组成的外周阴离子中心（pas）。分子对接实验结果显示：6-溴色胺衍生物可进入ache沟中。其中溴色胺氯代苯乙酸与ache蛋白的pas活性部位中的tyr84残基形成氢键，溴色胺苯丙酸与pas的glu199残基形成氢键，提示溴色胺氯代苯乙酸可能与pas的结合较紧密。其中ache有cas（催化阴离子位点）和pas（外周阴离子位点）两个活性中心，其中cas是乙酰胆碱与ache反应的作用位点；pas在空间上与cas有一定距离，但pas构象改变可影响乙酰胆碱与ache的结合，进而影响酶的催化活性。因此，6-溴色胺衍生物可通过形成相应氢键竞争性抑制ache的作用。

综上所述，6-溴色胺衍生物可剂量依赖性抑制ache，溴色胺氯代苯乙酸半抑制剂量（ic50）为17.6µm，溴色胺苯丙酸半抑制剂量（ic50）为22.3µm。进一步研究发现6-溴色胺衍生物可能通过结合ache的酶活性中心位点，竞争性抑制ache。6-溴色胺衍生物对ache的非竞争性抑制作用，可能为新型抗阿尔兹海默病药物的开发提供理论基础。本发明化合物溴色胺氯代苯乙酸和溴色胺苯丙酸有治疗阿尔茨海默病的药理作用。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。