一种黄原胶纳米微凝胶的制备方法与流程

本发明涉及天然高分子在生物医用材料技术领域的应用，尤其涉及一种ph敏感、可还原降解生物多糖黄原胶纳米微凝胶的制备方法。

背景技术：

由于纳米粒子对特定组织具有靶向性，而且在药物控释和缓释方面有很好的效应，所以近几年来载药纳米粒子的制备成为研究的热点，其中纳米粒子载药体系的关键是制备纳米粒子材料的选择。

而黄原胶作为一种生物发酵多糖，具有良好的生物降解性和相容性等特点，受到广泛的关注与研究。特别是作为药物载体有独特的优势。黄原胶主、侧链上含有大量活性基团，可容易发生化学反应，进行接枝功能化基团，从而赋予黄原胶新的性能，可将其改性之后作为注射抗癌药物阿霉素的载体研究。黄原胶作为口服药物载体的应用已有大量报道，例如文献报道将黄原胶羧甲基化制备双氯芬酸钠口服药片，研究了药物释放效果；还有人开发了三偏磷酸钠交联黄原胶的凝胶体系，并探讨了其在口服药物控释方面的应用前景；有研究将氯代十六烷基接枝到黄原胶链段，形成具有两亲性的聚合物结构，研究了黄原胶纳米胶束作为药物格列本脲的控制释放前景。然而刺激响应性黄原胶纳米颗粒的制备及其应用尚未见报道。为了拓展黄原胶药物载体应用范围，本研究合成了具有ph和还原双重敏感应性的黄原胶纳米微凝胶。微凝胶中游离的酰肼基团与阿霉素分子上酮羰基反应可形成具有ph敏感的酰腙键，在增加纳米粒子载药量的同时，可使抗癌药物在肿瘤部位酸性环境快速释放。另外纳米微凝胶中双硫键在高浓度的谷胱甘肽作用下断裂，微凝胶的交联结构破坏，促使药物快速释放。本专利直接在水中“一步法”制得黄原胶纳米微凝胶，工艺简单、绿色环保，形成的纳米粒子结构稳定。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种生物相容性良好的ph敏感、可还原降解生物多糖黄原胶纳米微凝胶的制备方法。

本发明提供一种注射剂型黄原胶纳米微凝胶，先将4.68g胱胺盐酸盐与7.86g丙烯酸甲酯溶于50ml无水甲醇中，用4.2g三乙胺作为缚酸剂，合成胱胺四甲酯，再将2.81g胱胺四甲酯再与2.4g无水肼溶于20ml无水甲醇回流反应12h得到胱胺四酰肼。该聚合物是由天然多糖黄原胶与胱胺四酰肼通过酰胺化反应合成，其中黄原胶水溶液与胱胺四酰肼甲醇溶液的体积比分别为：100:2、100:4、100:7、100:14、100:28和100:56，体系要求反应物浓度很稀，更有利于形成微凝胶。因为黄原胶分子量为2×10⁵～2×10⁶，得到的微凝胶粒径分布较宽，所以制备纳米微凝胶时可以用截留分子量为14000的透析袋透析除去小分子和一些杂质，有利于形成均一的纳米微凝胶。胱胺四酰肼在纳米微凝胶中具有功能作用：1)胱胺分子中含有双硫键，使载体具有还原响应性，在谷胱甘肽还原作用下二硫键断裂，使载体遭到破坏，从而达到靶向药物释放；2)胱胺四酰肼分子中含有氨基，黄原胶分子中含有羧基，具有两性离子的功能，赋予载体抗蛋白质非特异性吸附性能以及ph敏感性；3)胱胺四酰肼交联黄原胶中含有的二硫键，二硫键作为疏水链段形成的微凝胶可使聚合物具有一定的疏水性，同时随着疏水性的增强，形成的纳米粒子形貌从椭圆变为圆形，为聚合物载药和循环性能奠定基础。

本发明还提供一种负载阿霉素的黄原胶纳米微凝胶的制备方法，依次包括以下步骤：

1)将胱胺盐酸盐和丙烯酸甲酯通过迈克尔加成反应得到胱胺四甲酯粗液；

2)粗液经过洗涤、干燥和柱层析之后，得到无色液体；

3)将胱胺四甲酯与无水肼肼解反应得到胱胺四酰肼；

4)向黄原胶水溶液中，加入胱胺四酰肼，在持续搅拌下，反应12h后，将产物移至透析袋透析，形成聚合物纳米微凝胶；或者将粗产物沉淀干燥，再进行溶解透析之后得到黄原胶纳米微凝胶；

5)将制备得到的黄原胶纳米微凝胶进行抗肿瘤药物阿霉素的负载，得到载药纳米微凝胶。

本发明还提供一种黄原胶纳米微凝胶在制备化疗药物载体中的应用方法。合成胱胺四酰肼，再利用酰肼基团和黄原胶侧链上的羧基进行酰胺化反应，制得胱胺四酰肼交联黄原胶纳米颗粒，聚合物结构中同时含有双硫键、氨基、羧基以及酰肼基团这些多功能响应性基团。利用肿瘤组织与正常组织温度、ph以及氧化还原电位等较大的差异设计具有刺激响应性的纳米载体，可以实现药物在靶向部位的释放。黄原胶纳米微凝胶在体内循环时，其结构内双硫键在细胞外低谷胱甘肽浓度(2μmol·l^-1)下能够保持稳定，而一旦进入细胞内，2～10mm谷胱甘肽会使双硫键迅速破坏，药物从中释放出来；又由于肿瘤组织的ph比正常组织低(<6.5)，而且细胞内溶酶体和内涵体的ph在4.5～6，载药纳米微凝胶中的具有ph响应性的结构，所以在酸性条件下会使酰腙键断裂，达到在肿瘤部位快速释放药物的目的。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

1.针对黄原胶侧链上羧基官能团，利用具有四个活性酰肼基团的交联剂cta进行酰胺化反应，反应条件温和，无其他副产物生成。

2.天然生物多糖黄原胶作为原料，不仅可以替代peg作为稳定纳米粒子的亲水部分，而且其电荷性赋予其优异的抗蛋白吸附功效，可延长药物载体在体内循环时间。

3.在水溶液中制备黄原胶纳米微凝胶，无任何有机溶剂残留，无细胞毒性，有利于提高药物载体的生物利用度，具有良好的生物相容性和生物降解性能。

4.黄原胶纳米微凝胶中同时含有双硫键、氨基、羧基和酰肼等结构单元，因而赋予了纳米微凝胶灵敏的ph和还原响应性，在肿瘤细胞内部弱酸性和还原性环境中，黄原胶纳米微凝胶结构和酰腙键化学键被破坏，整个纳米颗粒破裂降解，无其他毒性小分子残留，在实际应用中可避免材料残留而引发的副作用，可顺利释放药物。

6.纳米微凝胶可以利用双硫键形成的疏水空腔、酰肼基团与阿霉素的酰腙键化学键作用和黄原胶的阴离子与阿霉素阳离子之间的电荷作用进行药物负载，有利于提高药物负载量，提高治疗效果。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如下。

附图说明

图1为本发明中黄原胶纳米微凝胶合成反应示意图；

图2为本发明中合成黄原胶纳米微凝胶的原料和产物红外谱图；

图3为本发明中不同比例黄原胶纳米微凝胶的扫描电镜图片；

图4为本发明中不同配比反应后黄原胶纳米粒子在ph7.4时的粒径分布；

图5为本发明中黄原胶纳米微凝胶在ph10.0、7.4、6.5、5.0、3.0下的粒径变化和zeta电位变化，图中x1、x2、x3、x4、x5、x6分别代表黄原胶水溶液与胱胺四酰肼甲醇溶液的体积比分别为：100:2、100:4、100:7、100:14、100:28和100:56时反应所得到的ph敏感、可还原降解纳米微凝胶；

图6为本发明中黄原胶纳米微凝胶x6负载药物之后和体外模拟释放之后的透射电镜图；图中a：x6负载药物之后的纳米粒子，b：x6纳米粒子在10mm谷胱甘肽孵育24h后投射电镜图；

图7为本发明中x6载药黄原胶纳米微凝胶的体外药物释放曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

1)胱胺四甲酯和胱胺四酰肼的合成：

将4.68g胱胺二盐酸盐和7.86g丙烯酸甲酯溶于50ml无水甲醇中，搅拌完全溶解，加入4.2g三乙胺，氮气氛围下室温磁力搅拌反应24h。反应完成后，粗产品用150ml二氯甲烷溶解，分别用50ml的超纯水洗涤三次，50ml的饱和氯化钠溶液洗涤一次，最后用无水硫酸钠干燥后抽滤，滤液旋蒸浓缩后，得到黄色液体。粗产物用硅胶层析柱分离提纯，得到无色液体cte。取2.81g胱胺四甲酯溶于20ml无水甲醇中，完全溶解后加入2.4g无水肼，氮气保护回流反应反应12h。反应完成后旋蒸除去甲醇和无水肼，将得到产物40℃真空干燥24h，得到产物交联剂cta。

2)胱胺四酰肼交联黄原胶xan-cta的合成及纳米微凝胶的制备：

配置低浓度的黄原胶水溶液，在250ml三口烧瓶中，将100mg黄原胶边搅拌边加入至100ml去离子水中，磁力搅拌完全溶解均匀后，分别取1mg/ml的胱胺四酰肼甲醇溶液2ml、4ml、7ml、14ml、28ml和56ml加入上述三口烧瓶中，再添加催化剂38.3mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和23.0mgn-羟基丁二酰亚胺，搅拌均匀后，氮气氛围下60℃反应12h，反应后冷却至室温，得到1mg/ml黄原胶纳米微凝胶反应液，反应液用300ml乙醇沉淀，抽滤，置于60℃真空干燥箱中干燥24h，干燥完成后研磨成粉保存。可利用两种方法制备纳米微凝胶溶液。一：反应液稀释制备纳米微凝胶，即取1.2ml浓度为1mg/ml黄原胶与胱胺四酰肼的反应液，用120ml超纯水直接稀释后转入截留分子量为14000的透析袋中，超纯水溶液透析处理不少于12h，将小分子量的杂质去除，得到粒径均一的浓度为0.01mg/ml纳米微凝胶溶液；二：干燥状态聚合物直接溶解制备纳米微凝胶，即将100ml浓度为1mg/ml黄原胶与胱胺四酰肼的反应液用300ml乙醇沉淀，过滤，60℃真空干燥，再取5mg干燥样品用超纯水溶解定容至500ml，取120ml纳米微凝胶溶液至截留分子量14000的透析袋中，在超纯水透析外液中透析12h，制得浓度为0.01mg/ml黄原胶纳米微凝胶溶液。取纳米微凝胶溶液冷冻干燥样品表征其结构，如图2，合成各物质的红外图谱。如图3所示，为黄原胶纳米微凝胶的扫描电镜图片，图中x1-x6分别对应上述六种不同的反应配方，由图中可见，该纳米微凝胶随着交联强度的增大，粒径逐渐减小，形状逐渐由椭球形变为球形。这是因为黄原胶具有较强的亲水性，微凝胶更多的以椭球形状存在，随着交联强度增加，疏水作用增强，黄原胶纳米粒子更多的呈现球形，且粒径分布比较均一。

根据注射剂型纳米微凝胶尺寸不同的应用需要，可以调节黄原胶与胱胺四酰肼的配比，以得到不同粒径的纳米微凝胶，如图4所示，随着胱胺四酰肼含量的增加，纳米微凝胶的粒径降低，这与扫描电镜得到的结果一致，这是因为随着交联密度的上升，导致疏水作用增强，微凝胶内部更加紧密。

实施例2

黄原胶纳米微凝胶的ph敏感性：

将实施例1中所得0.01mg/ml黄原胶纳米微凝胶，取20ml纳米微凝胶溶液，用0.1mhcl和0.1mnaoh调节纳米微凝胶溶液ph值分别为3、5、6.5、7.4、10，观察黄原胶纳米粒子的粒径和zata电位随ph变化，由动态激光光散射系统检测微凝胶粒径随ph值的变化以反映微凝胶的ph敏感性，结果从图5之左图可以看出，黄原胶纳米粒子的粒径随着ph值的上升，粒径总体呈上升趋势，是因为黄原胶作为阴离子多糖，碱性环境下羧基负电荷增强，纳米粒子间的电荷排斥增强，粒径随之增加。在酸性条件下，粒径变小，因为聚合物氨基质子化带正电与黄原胶本身的负电荷相互吸引，粒径减小。从图5之右图可以看出,黄原胶纳米粒子的zeta电位随着ph值的增大，纳米粒子的负电荷增强；随着胱胺四酰肼的加入，形成了更多的自由氨基，更容易在酸性条件下质子化，这与zeta电位显示纳米粒子在酸性条件下正电荷逐渐增强的现象相符，说明黄原胶纳米微凝胶具有一定ph敏感性。其中选用样品x6作为以下性能的研究对象。

实施例3

黄原胶纳米微凝胶的还原敏感性：

将实施例1中所得淡红色载药纳米微凝胶，取120ml载药纳米微凝胶溶液均分成6份装入截留分子量为3500透析袋内，分别置于20mlph＝5、ph＝6.5、ph＝7.4和含有10mm谷胱甘肽条件的醋酸盐缓冲溶液中，置于37±0.5℃的恒温震荡器中回旋震荡，在12h和24h处各取3ml纳米微凝胶溶液，用激光光散射仪测试纳米微凝胶的粒径变化，观察还原响应性，测试之后样品立刻移至原透析袋内。观察结果发现24小时内，纳米微凝胶在不含谷胱甘肽的pbs缓冲溶液中粒径及其分布基本没有变化，但在10mm谷胱甘肽溶液中，12小时后，粒径增加，同时也出现了小粒径的聚集体，说明黄原胶侧链交联的双硫键在谷胱甘肽作用下断裂，重新形成黄原胶链段聚集体，随着时间的增加，聚集体的体积增加，导致粒径增加。如图6可以观察在10mm谷胱甘肽浓度下，纳米粒子被破坏，与上述现象一致，说明黄原胶纳米粒子具有还原敏感性。

实施例4

黄原胶纳米微凝胶的抗蛋白非特异性吸附性能：

将实施例1中所得黄原胶纳米微凝胶与含有10％胎牛血清的rpmi-1640的培养基混合，或者与50μg/ml、ph7.4的bsa溶液混合，其中bsa为牛血清白蛋白，fbs为胎牛血清。将上述混合溶液在37℃下孵育24h，利用动态激光光散射仪来检测纳米微凝胶的粒径变化，观察微凝胶抗蛋白质非特异性吸附性能。纳米微凝胶接触不同蛋白质后的粒径与接触蛋白质前的粒径比较，x6黄原胶纳米微凝胶溶液在与不同蛋白质接触24小时后，粒径为133±2nm，与其在无蛋白质的缓冲溶液中一样，没有聚集或崩解现象，此结果说明纳米微凝胶与蛋白质之间无相互吸附作用，可在人体内实现较长时间的循环。

实施例5

黄原胶纳米微凝胶的载药和释放性能：

将实施例1中得到的x6黄原胶纳米粒子负载抗癌药物阿霉素。取120ml浓度为0.01mg/ml纳米微凝胶溶液于避光的锥形瓶中，添加2.4ml浓度为1mg/ml阿霉素三氯甲烷溶液，室温下避光磁力搅拌24h后转入截留分子量为3500的透析袋透析24h，每隔3h换一次透析液，去除未负载的阿霉素，得到淡红色载药纳米微凝胶溶液。再将120ml载药纳米微凝胶溶液均分成6份装入截留分子量为3500透析袋内，分别置于20mlph5、ph6.5、ph7.4和含有10mm谷胱甘肽条件的醋酸盐缓冲溶液中，置于37±0.5℃的恒温震荡器中回旋震荡，每隔一段时间取3ml透析液测试吸光度a483，由标准曲线计算释放介质中的阿霉素浓度。每次取样后补加相同体积的新鲜介质保持缓冲溶液体积不变。如图6之左图a为负载药物之后的黄原胶纳米粒子的透射电镜图；将负载药物的黄原胶纳米微凝胶在10mm谷胱甘肽溶液中进行药物释放实验，12h和24h后取出3ml样品测试其粒径变化，并通过透射电镜观察药物释放后其形貌如图6之右图b，谷胱甘肽断链之后，载药纳米颗粒被破坏，更好的释放药物。如图7，为负载阿霉素x6黄原胶纳米粒子在不同ph值谷胱甘肽浓度下药物释放进度，利用紫外测试波长为483nm处的吸光度，根据标准曲线计算出阿霉素释放量。可以看出随着ph降低和释放时间的增长，药物释放量逐渐增多，因此基本达到在肿瘤部位靶向释放的目的。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。