SNP位点的应用及其检测试剂盒的制作方法

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及snp位点的应用及其检测试剂盒。

背景技术：

目前实体器官移植术后移植物的健康监测常采用抽血进行肝功能检查，或穿刺针采集组织进行病理学检查。

对于常规抽血功能检查，其各项指标如肌酐、alt、ast、胆红素等等灵敏度和特异性均不高，无法准确的反应移植物的健康状况。

对于目前金标准的组织活检，其虽可直接的反应移植物的健康状况。但存在以下重大缺点：

1)侵入式检测，对病人造成较大痛苦，同时对移植物造成损伤；

2)检出异常时，移植物实质性损伤已经发生，并且损伤往往已经较为严重，这时对于临床医生来说拯救移植物往往已经太晚；

3)若穿刺针未采集到移植物的病灶组织部分，会对结果准确性造成较大影响，因此准确性和灵敏度不高。

因此，寻求一种可灵敏、特异、准确的评估肝移植物的损伤状况和排斥风险的无创伤检测方法具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供snp位点在制备评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险的产品中的应用及其检测试剂盒，使得该试剂盒能够灵敏、特异、准确的评估肝移植物的损伤状况和排斥风险，无需进行任何创伤检测。

本发明提供了snp位点在制备评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险的产品中的应用，所述snp位点选自：

rs2012852、rs2071985、rs867983、rs218503、rs407930、rs2070849、rs2067003、rs2269951、rs2269952、rs399714、rs469783、rs2074012、rs179785、rs84933、rs2076537、rs2071277、rs2075817、rs1007311、rs400218、rs1064416、rs2076416、rs2076435、rs2074428、rs2070776、rs2071427、rs2071502、rs2073900、rs2071484、rs518471、rs2279096、rs2278945、rs474949、rs1381532、rs2279984、rs2279985、rs1278278、rs2279547、rs2270181、rs2070669、rs2070759、rs1635537、rs2070876、rs624707、rs1289315、rs2070340、rs926027、rs2070777、rs2238354、rs2076237、rs2075852、rs2076393、rs2251252、rs362549、rs2268082、rs2070351、rs2070356、rs2251252、rs2070438、rs521861和rs2282614。

本发明研究表明，将上述60个snp位点作为检测靶点，计算得到的受体游离dna中供体游离dna的含量(gcfdna供受比)能够准确反映出移植排斥的程度，为临床检测器官移植术后移植物损伤和排斥风险提供了一种简单而有效的辅助手段。

本发明还提供了一种用于评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险的试剂盒，包括序列如seqidno.1～120所示的引物和序列如seqidno.121～240所示的探针。

本发明提供的上述试剂盒，seqidno.1～120所示的引物和seqidno.121～240所示的探针用于扩增、检测60个snp位点，序列如下：

优选的，seqidno.121～240所示的探针中，用于检测snp位点的探针对的5’端分别标记不同的荧光基团，3’端标记nfq和mgb。本发明对于荧光基团的种类没有特殊限制，本领域常用的种类即可。在本发明提供的具体实施例中，检测snp位点的两条探针的5’端分别标记fam荧光基团和vic荧光基团。

本发明提供的试剂盒还包括ddpcr^tmprobesupermix和超纯水。

本发明还提供一种检测受体游离dna中供体游离dna含量的方法，包括如下步骤：

步骤1：以待测样品的总的游离dna为模板，加入seqidno.1～120所示的引物和序列如seqidno.121～240所示的探针，制备数字pcr反应微滴，将制备好的反应微滴转移至96孔板中，进行数字pcr反应；

步骤2：反应结束后，将96孔板转移至qx200^tm数字pcr读取仪中，读取结果并独立分析每个snp位点，计算供者游离dna/受者游离dna的比值，即gcfdna供受比，其中，snp位点的分析方法如下：

1)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0.9～1，视该位点数据为无效数据；

2)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0，即仅有一种碱基阳性，视该位点数据为无效数据；

3)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0～0.9，视该位点数据为有效数据；在有效数据中，以snpno#1和snpno#2为例，snpno#1的碱基比约等于snpno#2的两倍(2±0.4)，则判定snpno#1中，移植受者和移植供者在中均为纯合子；在snpno#2中，移植受者为纯合子，移植供者为杂合子；

4)选择判定移植受者和移植供者均为纯合子的snp位点数据，计算平均值，即为gcfdna供受比。

在本发明提供的具体实施例中，数字pcr的反应体系为：

所述snp位点的引物和探针为权利要求3所述试剂盒中的引物和探针。

在本发明提供的具体实施例中，所述pcr反应程序如下：

95℃、10min预变性；95℃、15s，57℃、1min，40个循环；95℃保持10min；10℃保存。

本发明提供了snp位点在评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险中的应用，通过对移植后受体总游离dna的60个特定snp位点进行检测，结合数字pcr技术以及特定的计算方法，最终获得受体游离dna中供体游离dna的含量，即gcfdna供受比，根据gcfdna供受比判断移植排斥的程度，为临床检测器官移植术后移植物损伤和排斥风险提供了一种简单而有效的辅助手段，具有如下优势：

(1)无创，5～10ml静脉采血即可进行检测；

(2)灵敏，选择现有pcr技术中精准度最高的数字pcr设备作为检测平台；

(3)早期，选用核酸分子作为检测靶点，这些靶点的变化发生在器官病变或损伤的最早期；

(4)特异，检测出的特定游离dna直接来源于肝脏移植物，可特异性的反映出肝脏移植物的健康状况；

(5)方便，相比该领域其它技术或检测，例如测序、dsa检测等需要移植受者和移植供者双方的样本相比，该方法无需移植供者样本，仅需受者血液样本即可完成。

具体实施方式

本发明公开了snp位点的应用及其检测试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

对所公开的实施例的说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

本发明提供的snp位点的应用及其检测试剂盒中所用试剂均可由市场购得。引物序列和探针序列由(请补充合成序列的)公司合成。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1采用本发明提供的试剂盒评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险

血浆中总游离dna提取

1、使用streck无创采血管静脉采集一名肝移植术后2周受者血液10ml；

2、将streck无创采血管采集的血液转移至15ml离心管中，低温4℃2000g离心10min；取上层血浆约4～6ml于新的15ml离心管中，继续低温4℃4000g离心10min；取上层血浆4～6ml于新的15ml离心管中；

3、取4ml血浆，使用qiagen公司的qiaampcirculatingnucleicacidkit进行总游离dna的提取，调整dna浓度为10～40ng/ul。

制备数字pcr反应微滴

1、配置数字pcr反应体系，制备数字pcr反应微滴，进行pcr反应；60个snp位点的检测体系，共计60管，反应配制如下：

其中，用于检测snp位点的引物包含上、下游引物，各0.125μl，共0.25μl；探针为两条，各0.125μl，共0.25ul。

2、将配置好的反应体系加入到微滴发生卡dg8^tmcartridges的样品槽中，同时在发生油槽中加入60ul微滴发生油dropletgenerationoilforprobes，最后用封膜dg8^tmgaskets封好，置于微滴发生仪上，进行反应微滴的制备。

3、将制备好的反应微滴缓慢转移至96孔板中，然后用铝制封膜配合封膜机器热封好后进行pcr反应，反应程序设置如下：

结果分析

pcr反应结束后，将96孔板转移至qx200^tm数字pcr读取仪中，读取结果，见表1。

表160个snp位点的原始数据

按照以下方法对表1的数据进行分析：

1)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0.9～1，视该位点数据为无效数据；

2)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0，即仅有一种碱基阳性，视该位点数据为无效数据；

3)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0～0.9，视该位点数据为有效数据；在有效数据中，以snpno#1和snpno#2为例，snpno#1的碱基比约等于snpno#2的两倍(2±0.4)，则判定snpno#1中，移植受者和移植供者在中均为纯合子；在snpno#2中，移植受者为纯合子，移植供者为杂合子；

4)选择判定移植受者和移植供者均为纯合子的snp位点数据，计算平均值，即为gcfdna供受比。

评价标准：gcfdna供受比≤10％，表示受者肝脏移植物相对健康，排斥风险低；gcfdna供受比＞10％，表示受者肝脏移植物存在较重损伤，排斥风险高。

根据表1的数据计算得到gcfdna供受比(供者游离dna/受者游离dna)为35.4±1.2％，表示受者肝脏移植物存在较重损伤，排斥风险高。

实施例2

使用edta采血管采集实施例1中肝移植术后2周受者的血液2ml，进行肝功常规检测，结果如表2所示。

表2受者肝功常规检测结果

结果显示，该肝移植术后2周受者的肝脏移植物存在实质性损伤，和本发明检测结果吻合，此外，采用本发明提供的试剂盒对其他50名肝移植患者进行检测，检测结果均与肝功常规检测结果相吻合，表明本发明试剂盒能够及时、准确并特异地反映肝脏移植物的健康状况。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

sequencelisting

<110>成都仕康美生物技术有限公司

<120>snp位点的应用及其检测试剂盒

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<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>86

agtcaaggatggtggata18

<210>87

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>87

taagaaagctcgcgcata18

<210>88

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>88

agcagatggtcatggtga18

<210>89

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>89

ggtcaccagtcaggagcc18

<210>90

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>90

atacagaaatcacaaaaa18

<210>91

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>91

ggggccatatctccagca18

<210>92

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>92

cgagatgggtgcagaggc18

<210>93

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>93

aacctggcctttcaacat18

<210>94

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>94

ccctctctagctggctct18

<210>95

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>95

gcacggtgcctgcacagc18

<210>96

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>96

tggcagcttaaccctgct18

<210>97

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>97

cctacaacagggttgttg18

<210>98

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>98

tcctgcctccaacctcag18

<210>99

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>99

agaggcccctttcatctt18

<210>100

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>100

cctcttgctatcccttcc18

<210>101

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>101

ccaggagaaccacttgag18

<210>102

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>102

tcaaagcaacgtgtcaat18

<210>103

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>103

gcaggaggcaagaacaag18

<210>104

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>104

ggtcactctgatctcagc18

<210>105

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>105

cactgagcatgacaacca18

<210>106

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>106

catttggggacttccctt18

<210>107

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>107

atctgcgcacaagtcctc18

<210>108

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>108

aaagaaatgtggaggatg18

<210>109

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>109

ccttgttctcaccttttc18

<210>110

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>110

agagccaggtggccgggg18

<210>111

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>111

gaggatccacgtcgccca18

<210>112

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>112

tggctggatgtggaggag18

<210>113

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>113

ggaagcaggaggcaagaa18

<210>114

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>114

ggtcactctgatctcagc18

<210>115

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>115

tcaaagactgccagacac18

<210>116

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>116

gtgaaacaggcaaccatt18

<210>117

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>117

aaatgataactgtaggcc18

<210>118

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>118

tagagccaatggccaatc18

<210>119

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>119

tgttctattaataggcag18

<210>120

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>120

tccctctccatcactccc18

<210>121

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>121

tgcaccagaaccatc15

<210>122

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>122

tgccccagaaccatc15

<210>123

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>123

cacatcctcgctcac15

<210>124

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>124

cacgtcctcgctcac15

<210>125

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>125

ccaaattgctcctgg15

<210>126

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>126

ccagattgctcctgg15

<210>127

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>127

tcacgctatggtgga15

<210>128

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>128

tcatgctatggtgga15

<210>129

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>129

agagctttggtggga15

<210>130

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>130

agatctttggtggga15

<210>131

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>131

agtaactaactttta15

<210>132

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>132

agtagctaactttta15

<210>133

<211>14

<212>dna

<213>人工序列

<400>133

agggacagaggcca14

<210>134

<211>14

<212>dna

<213>人工序列

<400>134

agggactgaggcca14

<210>135

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>135

tgtcctgacctgggt15

<210>136

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>136

tgttctgacctgggt15

<210>137

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>137

tgtaccccaaaatga15

<210>138

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>138

tgtgccccaaaatga15

<210>139

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>139

aggcatatgaactca15

<210>140

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>140

aggtatatgaactca15

<210>141

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>141

actcgcccgatcatt15

<210>142

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>142

acttgcccgatcatt15

<210>143

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>143

attaagtttatttgg15

<210>144

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>144

attgagtttatttgg15

<210>145

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>145

aggcaggcgtggagg15

<210>146

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>146

aggcgggcgtggagg15

<210>147

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>147

cagactagtgagagc15

<210>148

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>148

caggctagtgagagc15

<210>149

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>149

atcctcttttccaca15

<210>150

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>150

atcttcttttccaca15

<210>151

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>151

tgacatctaatctcc15

<210>152

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>152

tgacgtctaatctcc15

<210>153

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>153

cgggatctgcgtgcg15

<210>154

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>154

cgggatttgcgtgcg15

<210>155

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>155

cagaaccccctctgg15

<210>156

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>156

caggaccccctctgg15

<210>157

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>157

cataccaacatgaaa15

<210>158

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>158

catgccaacatgaaa15

<210>159

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>159

accagtttgagagca15

<210>160

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>160

accggtttgagagca15

<210>161

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>161

agcccgtgcagggct15

<210>162

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>162

agccggtgcagggct15

<210>163

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>163

tttcagagcattttt15

<210>164

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>164

ttttagagcattttt15

<210>165

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>165

tggaagttgttttta15

<210>166

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>166

tggacgttgttttta15

<210>167

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>167

ctgccagcagaagtg15

<210>168

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>168

ctgtcagcagaagtg15

<210>169

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>169

tgccagaggtgtggc15

<210>170

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>170

tgccggaggtgtggc15

<210>171

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>171

tcacgcccctcattc15

<210>172

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>172

tcaggcccctcattc15

<210>173

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>173

cgtcgagtgccagga15

<210>174

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>174

cgttgagtgccagga15

<210>175

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>175

tctagagcccaccag15

<210>176

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>176

tctggagcccaccag15

<210>177

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>177

ttacctgtgctgtgt15

<210>178

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>178

ttatctgtgctgtgt15

<210>179

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>179

atacacctcttgtttt16

<210>180

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>180

atacgcctcttgtttt16

<210>181

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>181

tgcaacgtgtcctta15

<210>182

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>182

tgcgacgtgtcctta15

<210>183

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>183

aggctgttacagctg15

<210>184

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>184

aggttgttacagctg15

<210>185

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>185

tcgcagcatctttga15

<210>186

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>186

tcgtagcatctttga15

<210>187

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>187

ttcagcctttgcaaa15

<210>188

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>188

ttctgcctttgcaaa15

<210>189

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>189

tgggcttttatttta15

<210>190

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>190

tgggtttttatttta15

<210>191

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>191

cccaccaggagtggg15

<210>192

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>192

cccgccaggagtggg15

<210>193

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>193

cacagtaaccaaaaa15

<210>194

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>194

cacggtaaccaaaaa15

<210>195

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>195

agacagtgggaaggg15

<210>196

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>196

agacggtgggaaggg15

<210>197

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>197

tgagcggcgagggat15

<210>198

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>198

tgaggggcgagggat15

<210>199

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>199

ataataagcacgact15

<210>200

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>200

atactaagcacgact15

<210>201

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>201

aagcttcctggggac15

<210>202

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>202

aagtttcctggggac15

<210>203

<211>14

<212>dna

<213>人工序列

<400>203

agaccgttctgatg14

<210>204

<211>14

<212>dna

<213>人工序列

<400>204

agactgttctgatg14

<210>205

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>205

ccactgatcctaact15

<210>206

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>206

ccattgatcctaact15

<210>207

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>207

agaacaaagattttc15

<210>208

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>208

agagcaaagattttc15

<210>209

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>209

tgtcatctttttaac15

<210>210

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>210

tgtcgtctttttaac15

<210>211

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>211

ccaatcccgcccgcc15

<210>212

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>212

ccagtcccgcccgcc15

<210>213

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>213

agcagtttgtgggga15

<210>214

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>214

agctgtttgtgggga15

<210>215

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>215

tccatgtctatgttc15

<210>216

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>216

tccttgtctatgttc15

<210>217

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>217

gtgcgatgaaatgga15

<210>218

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>218

gtgtgatgaaatgga15

<210>219

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>219

taccggtaagaaaag15

<210>220

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>220

tactggtaagaaaag15

<210>221

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>221

agaccataccacaaa15

<210>222

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>222

agactataccacaaa15

<210>223

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>223

aggatagctgtagaa15

<210>224

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>224

aggatggctgtagaa15

<210>225

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>225

tggaactttcattcc15

<210>226

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>226

tgggactttcattcc15

<210>227

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>227

ccgagccagatgcca15

<210>228

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>228

ccgtgccagatgcca15

<210>229

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>229

tgcccgatcatgttc15

<210>230

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>230

tgcctgatcatgttc15

<210>231

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>231

cccattctttcccag15

<210>232

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>232

cccgttctttcccag15

<210>233

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>233

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<210>234

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>234

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<210>235

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>235

aaaaagagaagggag15

<210>236

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>236

aaagagagaagggag15

<210>237

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>237

tggccattttatagg15

<210>238

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>238

tgggcattttatagg15

<210>239

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>239

ctgcctctgcaaccc15

<210>240

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>240

ctgtctctgcaaccc15