本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种鸡卵黄抗体的纯化方法。
背景技术：
：卵黄抗体(eggyolkimmunoglobulin,igy)是母鸡产生的主要免疫球蛋白，存在于血清和卵黄中。与哺乳动物igg相比，使用卵黄抗体具有独特的优势，包括小剂量抗原免疫鸡可产生高滴度抗体，收集鸡蛋进行抗体分离纯化十分方便，鸡对哺乳动物保守蛋白能产生更好的抗体应答，卵黄抗体具有良好的热稳定性和ph耐受性。因此，卵黄抗体在疾病防治、诊断试剂等研究领域越来越受到重视和青睐。然而，卵黄抗体的实际应用受到纯化方法的制约，主要原因是卵黄含大量难以去除的脂质成分。传统的卵黄抗体纯化方法有硫酸铵沉淀法、聚乙二醇沉淀法、水稀释与超滤法、凝胶过滤法和层析法等，这些方法不仅步骤复杂、耗时，而且纯化的卵黄抗体纯度和产量均较低。链球菌g蛋白(spg)是一种免疫球蛋白结合蛋白，可用于哺乳动物igg的纯化，但不能用于禽卵黄抗体的纯化。最近的研究资料显示，spg免疫球蛋白结合区氨基酸替换可以改变其抗体亲和性，从而能与鸡卵黄抗体结合。类弹性蛋白多肽(elastin-likepolypeptide，elp)是根据人或动物体内弹性蛋白重复序列合成的聚合分子，具有温度敏感的可逆相变特性，在低于特定温度(相变温度)的溶液中呈舒展的可溶状态，在高于相变温度的溶液中形成不溶性凝聚物，而且此过程是可逆的。因此，类弹性蛋白多肽融合蛋白不仅可用离心等简单方法进行分离纯化，而且纯化效率与亲和层析法相当，具有很好的应用前景。本发明将elp的可逆相变特性与spgc2结构域的免疫球蛋白亲和力相结合，用大肠杆菌表达的elp-c2融合蛋白进行鸡卵黄抗体的纯化，旨在简化纯化工艺、降低制备成本。尽管这种策略在理论上是可行的，但在设计时还面临以下具体问题：elp-c2融合序列能否在大肠杆菌中高效表达？表达的融合蛋白能否用相变循环进行分离纯化？纯化的融合蛋白能否与鸡卵黄抗体结合及其最佳条件是什么？技术实现要素：为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种鸡卵黄抗体纯化方法。本发明的鸡卵黄抗体方法用elp-c2融合蛋白进行，经与冷乙醇和硫酸铵沉淀法比较证明具有简单、快速、经济和纯化效率高等优点。本发明所述的鸡卵黄抗体纯化方法，是用类弹性蛋白多肽(elp)与链球菌g蛋白(spg)c2结构域融合蛋白与粗制卵黄抗体结合，用相变循环沉淀结合复合物；然后洗脱卵黄抗体，用相变循环去除elp-c2融合蛋白。其中，所述类弹性蛋白多肽与链球菌g蛋白c2结构域融合蛋白可通过下列方法制备：(1)将spgc2结构域编码序列优化成大肠杆菌密码子序列，将合成序列插入elp融合表达载体，获得重组载体pelp-c2；(2)将重组载体转化大肠杆菌，用优化条件诱导elp-c2融合蛋白表达；(3)利用温度敏感的可逆相变循环纯化elp-c2融合蛋白。其中，步骤(1)中spgc2结构域编码序列为大肠杆菌密码子优化序列如seqidno.1所示。进一步地，在优化的elp-c2浓度为125μg/ml、结合温度为16℃、时间为60min条件下，将elp-c2融合蛋白与粗制卵黄抗体结合，用相变循环沉淀结合复合物；所述的洗脱卵黄抗体的优化条件是ph9.5、28℃、5min，用相变循环去除elp-c2融合蛋白，获得的鸡卵黄抗体纯度达96.3％，回收率达64％。与现有的卵黄抗体纯化方法相比，本发明的鸡卵黄抗体纯化方法具有简单、快速、经济和纯化效率高等优点。附图说明图1.elp-c2融合表达载体的结构示意图。spg为链球菌g蛋白，c为免疫球蛋白结合结构域，d为重复区，pt7为t7启动子，elp为类弹性蛋白多肽编码序列。图2.elp-c2融合蛋白的纯化及电泳分析。1为重组菌裂解液，2为第一轮相变循环沉淀的融合蛋白，3为第二轮相变循环纯化的融合蛋白。图3.elp-c2融合蛋白与家禽igy结合的免疫转印检测。图4.elp-c2融合蛋白纯化鸡卵黄抗体的电泳分析。1为粗制卵黄抗体，2为elp-c2融合蛋白与卵黄抗体形成的复合物，3为洗脱和去除融合蛋白后的卵黄抗体。图5.冷乙醇和硫酸铵沉淀法纯化鸡卵黄抗体的电泳分析。1为粗制卵黄抗体，2为冷乙醇沉淀法纯化的卵黄抗体，3为硫酸铵沉淀法纯化的卵黄抗体。具体实施方式生物材料：1.pet-elp载体：本实验室构建(文献：wen-junliu,qianwu,bixu,xin-yuzhang,xiao-lixia,huai-changsun.single-steppurificationofrecombinantproteinsusingelastin-likepeptide-mediatedinversetransitioncyclingandself-processingmodulefromneisseriameningitidesfrpc.proteinexpressionandpurification,2014,98:18-24)。2.dh5α大肠杆菌：从美国bdbiosciencesclontech公司引进，本实验室保存。3.blr(de3)大肠杆菌：从美国novagen公司引进，本实验室保存。4.puc57载体：由金斯瑞生物科技(南京)有限公司保存和提供。具体实施步骤如下：1.表达载体构建(1)从genbank下载链球菌g蛋白c2结构域编码序列(x06173.1)，用javacodonadaptiontool(文献：grotea,hillerk,scheerm,münchrb,hempeldc,jahnd.jcat:anoveltooltoadaptcodonusageofatargetgenetoitspotentialexpressionhost.nucleicacidsresearch,2005，1:33)优化为大肠杆菌(k12株)密码子序列(seqidno.1)。序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，插入puc57载体；5-acctacaaactggttatcaacggtaaaaccctgaaaggtgaaaccaccaccgaagctgttgacgctgctaccgctgaaaaagttttcaaacagtacgctaacgacaacggtgttgacggtgaatggacctacgacgacgctaccaaaaccttcaccgttaccgaataa-3(seqidno.1)。(2)用限制酶sali和noti将c2结构域编码序列从puc57载体上切下，插入pet-elp载体，获得重组载体pelp-c2(图1)。2.融合蛋白表达(1)将pelp-c2载体转化blr(de3)大肠杆菌，在卡那霉素(50μg/ml)lb培养液培养过夜；(2)按1：100体积比接种卡那霉素2×yt培养液(tryptone16g，yeastextract10g，nacl5g，ph7.2)，37℃摇床培养至od600＝0.8，加入0.2mmiptg，37℃诱导6h；(3)4℃、12000g离心5min，沉淀菌体用tn缓冲液(50mmtris-hcl,150mmnacl,1mmedta，ph7.4)悬浮，超声波裂解(30w，10s，间隔15s，共5min)；(4)4℃、12000g离心10min，收集上清液，沉淀用同体积pbs悬浮。sds-page分析结果显示：与未诱导组相比，iptg诱导组出现约55kda额外蛋白条带，约90％表达产物存在于离心上清中(可溶性蛋白)，但表达水平较低；(5)将pelp-c2重组菌在不同温度(24、26、28、30℃)用不同浓度iptg(0.1、0.15、0.2、0.5、1.0mm)诱导不同时间(6、12、18、24、30h)，sds-page分析结果显示：elp-c2融合蛋白的最佳表达条件为0.1mmiptg、26℃、30h。3.融合蛋白纯化(1)将200mlpelp-c2重组菌在26℃、0.1mmiptg诱导30h，离心沉淀菌体，超声波裂解，菌体裂解液用tn缓冲液稀释至5mg/ml蛋白；(2)加等量4m氯化钠，分别在20、25、28、32℃孵育10min，室温、14000g离心5min，沉淀用适量pbs溶解；(3)蛋白样品用12％sds-page分离，考马斯蓝染色后，用moleculargeldoctmxr+system(bio-rad,usa)进行蛋白条带灰度扫描，用imagelabtmsoftware(bio-rad,usa)计算蛋白纯度，结果显示：沉淀elp-c2融合蛋白最佳温度为32℃；(3)分别加不同浓度(1.5、2.0、2.5、3.0m)氯化钠，32℃孵育10min，室温、14000g离心5min，沉淀用适量pbs溶解，定量sds-page分析结果显示：沉淀elp-c2融合蛋白最佳氯化钠浓度为3.0m；(4)用优化条件(32℃、3m氯化钠)纯化elp-c2融合蛋白，用0.5％tritonx-100pbs离心洗涤1次，定量sds-page分析结果显示：纯化elp-c2融合蛋白的纯度达99％，回收率达91.3％(图2)。4.融合蛋白igg结合鉴定(1)将纯化elp-c2融合蛋白及elp对照进行12％sds-page分离，用常规方法转印硝酸纤维素膜，在5％脱脂乳粉pbst(含0.1％tween20pbs)中37℃封闭1h；(2)加1：1000稀释辣根过氧化物酶标记兔、羊、人、牛、猪igg和鸡、鸭和鹅igy(上海生工生物工程有限公司或自行标记)，37℃孵育1h，pbst洗涤3次；(3)按照化学发光试剂(thermofisherscientific,usa)说明书进行染色，用fluorcheme化学发光凝胶成像与分析系统(proteinsimple,usa)进行杂交信号扫描。结果显示：elp-c2融合蛋白能与牛、猪、鼠、羊、兔、人igg以及鸡igy结合，不能与鸭和鹅igy结合(图3)。5.卵黄抗体纯化(1)从新城疫弱毒疫苗免疫鸡蛋(江苏广大禽业有限公司)吸取卵黄液5ml，用45ml去离子水稀释，用盐酸调节ph5.0，室温10000g离心20min，收集上清即粗制卵黄液；(2)将500μl粗制卵黄液与等量纯化elp-c2融合蛋白(100μg/ml,ph7.0)混合，分别在不同温度(4、16、22、28、32、37℃)孵育60min，用上述相变循环沉淀蛋白复合物，pbs离心洗涤1次，sds-page分析结果显示：elp-c2结合鸡卵黄抗体的最佳温度为16℃；(3)将不同浓度(25、50、75、100、125、150μg/ml)elp-c2融合蛋白与定量(500μl)粗制卵黄液混合，分别在16℃孵育60min，用上述相变循环沉淀蛋白复合物，pbs离心洗涤1次，sds-page分析结果显示：结合鸡卵黄抗体的最佳elp-c2浓度为125μg/ml；(4)将elp-c2融合蛋白(125μg/ml)与等量(500μl)粗制卵黄液混合，16℃孵育60min，用相变循环沉淀蛋白复合物，pbs离心洗涤1次，分别用200μl不同ph(2.5、3.0、3.5、4.0、8.0、8.5、9.0、9.5)0.1m甘氨酸室温洗脱10min，立即用5m氢氧化钠或2m盐酸中和至ph7.0，用上述相变循环去除elp-c2融合蛋白，sds-page分析结果显示：从elp-c2融合蛋白洗脱卵黄抗体的最佳ph为9.5；(5)用ph9.5甘氨酸在不同温度(4、16、22、28、32、37℃)洗脱卵黄抗体，立即中和至ph7.0，用上述相变循环去除elp-c2，sds-page分析结果显示：从elp-c2融合蛋白洗脱卵黄抗体的最佳温度为28℃；(6)用ph9.5甘氨酸在28℃洗脱卵黄抗体不同时间(5、15、30、45、60min)，立即中和至ph7.0，用上述相变循环去除elp-c2融合蛋白，sds-page分析结果显示：从elp-c2融合蛋白洗脱卵黄抗体的最佳时间为5min；(7)在上述(2)-(6)的优化条件下，用elp-c2融合蛋白从5ml粗制卵黄液纯化卵黄抗体，在用相变循环沉淀获得蛋白-抗体复合物后，保留上清液用于第二轮和第三轮卵黄抗体纯化，将三轮相变循环纯化的卵黄抗体合并。同时用硫酸铵沉淀法(文献：koky，ahndu.preparationofimmunoglobulinyfromeggyolkusingammoniumsulfateprecipitationandionexchangechromatography.poult.sci.2007,86:400-407)和冰乙醇沉淀法(文献：horikoshit,hiraokaj,saitom,hamadas.iggantibodyfromheneggyolks:purificationbyethanolfractionation.j.foodsci.1993,58:739-742)从5ml粗制卵黄液纯化卵黄抗体，用定量sds-page检测三种方法纯化的卵黄抗体的纯度和回收率，结果显示：elp-c2融合蛋白纯化的卵黄抗体的纯度为96.3％，回收率为64％(图4)；硫酸铵沉淀法纯化的卵黄抗体的纯度为77.9％，回收率为38.8％(图5)；冰乙醇沉淀法纯化的卵黄抗体的纯度为76.3％，回收率为55.9％(图5)。三种鸡卵黄抗体纯化方法的结果比较见表1：表1三种方法纯化鸡卵黄抗体的比较(n＝3)方法卵黄液(ml)纯度(％)回收率(％)产量(mg)时间(h)硫酸铵沉淀577.9±0.3238.8％±1.6520.5±1.8030.3±0.26冰乙醇沉淀576.3±0.5555.9％±0.7632.7±1.754.3±0.25elp-c2融合蛋白596.3±0.7264.0％±1.7338.5±1.802.8±0.26.纯化卵黄抗体的活性检测检测纯化卵黄抗体反应原性的elisa按发表方法(文献：makkayam,krellpj,nagye.antibodydetection-baseddifferentialelisaforndv-infectedorvaccinatedchickensversusndvhn-subunitvaccinatedchickens.vetmicrobiol.1999，66:209-222)进行。用碳酸盐缓冲液(ph9.6)将鸡新城疫病毒(ndv)lasota株接种鸡胚尿囊液(江苏农牧科技职业学院)稀释至10μg/ml蛋白，包被elisa板，100μl/孔，37℃孵育1h，用含5％bsa的pbst在37℃封闭1h；加不同浓度纯化的鸡igy，37℃孵育1h；洗涤后加1：5000辣根过氧化物酶标记羊抗鸡igy(上海生工生物工程有限公司)，37℃孵育1h；加入四甲基联苯胺底物后，用elx808tmelisareader(bio-tek,usa)读取od450值；以od450值为纵坐标，以稀释倍数为横坐标，描绘卵黄抗体反应曲线。结果显示：用三种方法从ndv免疫鸡卵黄纯化卵黄抗体均能与ndv反应，而且反应具有浓度依赖性，但elp-c2融合蛋白纯化的卵黄抗体反应原性优于其他两种方法纯化的卵黄抗体。sequencelisting<110>扬州大学<120>一种鸡卵黄抗体的纯化方法<130><160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>168<212>dna<213>人工序列<400>1acctacaaactggttatcaacggtaaaaccctgaaaggtgaaaccaccaccgaagctgtt60gacgctgctaccgctgaaaaagttttcaaacagtacgctaacgacaacggtgttgacggt120gaatggacctacgacgacgctaccaaaaccttcaccgttaccgaataa168当前第1页12