本发明涉及生物检测
技术领域：
，尤其是涉及一种测定defa1-3基因拷贝数的试剂盒、方法及二者的应用。
背景技术：
：人是2倍体生物(diploidgenome)，大多数的基因只有两个拷贝，但是也有一些基因具有多个拷贝。多拷贝的基因在不同的人身上具有拷贝数的变异，如defb1-3基因，在高加索人身上其拷贝数的变异在2-12之间，方向明课题组发现中国人defa1-3基因拷贝数的变异在2-16之间。目前研究发现defa1-3基因拷贝数的变异与人疾病发展预后可能相关，尤其是感染性疾病。目前经常用到的测量基因拷贝数的方法有三种即qpcr，paralogratiotest(prt)和multiplexligation-dependentprobeamplification(mlpa)。它们在具体设计上有所不同，但是都用到的一个原理就是把defa1-3测得的基因数量与一个或者多个拷贝数没有变异的基因数量做比较，以此推断defa1-3拷贝数。前期有学者的研究比较上述三种方法，发现mlpa是这三种方法里最准确，最可靠的方法，但是它的缺点就是方法复杂，耗时长，测量一个标本的费用比较高。mlpa的原理是利用杂交探针的方法扩增defa1-3以及其他30基因片段，然后通过比较defa1-3片段与其他基因片段在扩增后产物的量来计算defa1-3拷贝数。因此，开发一种方法简便、耗时短、成本低，并且准确可靠的测定defa1-3基因拷贝数的方法尤为重要。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的第一个目的在于提供一种测定defa1-3基因拷贝数的试剂盒，本发明的第二个目的在于提供上述试剂盒在测定defa1-3基因拷贝数中的应用，本发明的第三个目的在于提供一种defa1-3基因拷贝数的测定方法，本发明的第四个目的在于提供上述测定方法在测定defa1-3基因拷贝数中的应用，以缓解现有技术中存在的测定defa1-3拷贝数方法复杂，耗时长，费用高的技术问题。本发明提供了一种测定defa1-3基因拷贝数的试剂盒，所述试剂盒包括：微滴数字pcr检测试剂以及微滴发生卡；所述微滴数字pcr检测试剂包括预混液，所述预混液包括特异性检测defa1-3基因的引物及探针；所述特异性检测defa1-3基因的上下游引物分别为：defa1-3-f：5'-ccgtccttccctctagacttagc-3'(seqidno.1)；defa1-3-r：5'-gagcagattgcagcggacat-3'(seqidno.2)；所述特异性检测defa1-3基因的探针为：fam-actgctaactccatactc-mgb(seqidno.3)。进一步地，所述预混液还包括2×ddpcrsupermixforprobes和rnasefreedh2o。进一步地，所述预混液中2×ddpcrsupermixforprobes、defa1-3-f、defa1-3-r、探针和rnasefreedh2o的体积比为55-65：10-20：10-20：1-10：20-30。进一步地，所述微滴数字pcr检测试剂还包括rnasefreedh2o、微滴发生油、2×质控液、阳性对照、阴性对照、10×cutsmartbuffer以及限制性内切酶。进一步地，所述阳性对照包括已知拷贝数为2，4，6，8，10，12，14，16的样品。进一步地，所述微滴数字pcr检测试剂中rnasefreedh2o、预混液、微滴发生油、2×质控液、阳性对照、阴性对照、10×cutsmartbuffer以及限制性内切酶的体积比为250-350：200-250：800-1200：500-700：80-120：8-16：250-350：0.5-2。本发明还提供了上述的试剂盒在测定defa1-3基因拷贝数中的应用。本发明还提供了一种defa1-3基因拷贝数的测定方法，应用上述的测定defa1-3基因拷贝数的试剂盒。进一步地，所述测定方法包括如下步骤：步骤(a)：处理样本dna；步骤(b)：制备微滴数字pcr反应液，所述微滴数字pcr反应液包括待测样本反应液和空白对照反应液，所述待测样本反应液包括所述步骤(a)中处理后的样本dna；步骤(c)：将所述步骤(b)中的待测样本反应液和空白对照反应液分别加入所述微滴发生卡中间的孔内；步骤(d)：在所述微滴发生卡下部的孔内加入微滴发生油，并密封；步骤(e)：将所述微滴发生卡置于微滴生成仪中生成微滴，所述微滴生成于所述微滴发生卡上部的孔内；步骤(f)：取所述微滴，并进行pcr反应；步骤(g)：对完成所述pcr反应的微滴进行检测分析，得到所述基因拷贝数。另外，本发明还提供了上述的测定方法在测定defa1-3基因拷贝数中的应用。本发明提供的测定defa1-3基因拷贝数的试剂盒，包括微滴数字pcr检测试剂以及微滴发生卡，其中，微滴数字pcr检测试剂包括预混液，预混液包括特异性检测defa1-3基因的引物及探针。本发明提供的试剂盒具有高灵敏度、高准确度、高精确性、高可重复性的优点。本发明提供的defa1-3基因拷贝数的测定方法，应用了本发明提供的测定defa1-3基因拷贝数的试剂盒，具有操作方法简便，快速、敏感、准确的优点。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。目前，经常用到的测量基因拷贝数的方法有三种即qpcr，prt和mlpa，其中，mlpa是这三种方法里最准确，最可靠的方法，但是它的缺点就是方法复杂，耗时长，测量一个标本的费用比较高。因此，针对上述问题，本发明提供了一种测定defa1-3基因拷贝数的试剂盒，包括：微滴数字pcr检测试剂以及微滴发生卡；微滴数字pcr检测试剂包括预混液，预混液包括特异性检测defa1-3基因的引物及探针；其中，特异性检测defa1-3基因的上下游引物分别为：defa1-3-f：5'-ccgtccttccctctagacttagc-3'(seqidno.1)；defa1-3-r：5'-gagcagattgcagcggacat-3'(seqidno.2)；特异性检测defa1-3基因的探针为：fam-actgctaactccatactc-mgb(seqidno.3)。微滴数字pcr(dropletdigitalpcr)，这种方法是将配好的pcr反应液用与油通过高压的方法变成上万滴的微小水油混合滴，pcr反应在此微小滴里发生，反应结束以后机器会读取荧光阳性滴的多少，然后程序里的泊松分布方法可以被用以测量核酸序列的浓度。应用该方法测定基因拷贝数，能够缓解依靠传统定量pcr方法不能达到分辨效果的问题，对遗传病、癌症、感染性疾病的研究提供了一种全新的技术思路与手段。在本发明中，defa1-3基因为人defa1-3基因。在本发明中，预混液还包括2×ddpcrsupermixforprobes和rnasefreedh2o。在本发明中，预混液中2×ddpcrsupermixforprobes、defa1-3-f、defa1-3-r、探针和rnasefreedh2o的体积比为55-65：10-20：10-20：1-10：20-30。其中，2×ddpcrsupermixforprobes、defa1-3-f、defa1-3-r、探针和rnasefreedh2o的体积比例如可以为，但不限于55：10：10：1：20、60：15：15：5：25或者65：20：20：10：30。在一个优选的实施方式中，2×ddpcrsupermixforprobes、defa1-3-f、defa1-3-r、探针和rnasefreedh2o的体积比为60：15：15：5：25。其中，defa1-3-f、defa1-3-r和探针的浓度均为10μm。在本发明中，微滴数字pcr检测试剂还包括rnasefreedh2o、微滴发生油、2×质控液、阳性对照、阴性对照、10×cutsmartbuffer以及限制性内切酶。其中，微滴发生油为探针法ddpcr微滴发生油，2×质控液为2×ddpcr探针法质控液，阳性对照包括已知拷贝数为2，4，6，8，10，12，14，16的样品，阴性对照为rnasefreedh2o，限制性内切酶为msel酶。选择已知拷贝数为2，4，6，8，10，12，14，16的阳性模板，使用0.01mph8.0的tris-edta缓冲液稀释后冷冻保存，将检验合格的阳性对照制剂定量分装。其中，检验阳性对照是否合格的方法为：采用实时荧光定量pcr，利用目的基因defa1-3和内参基因alb的荧光定量pcr检验阳性对照的拷贝数为2，4，6，8，10，12，14，16，荧光定量pcr反应条件为95℃，3min；95℃30s；54℃30s，72℃30s，40个循环；72℃1min。在本发明中，微滴数字pcr检测试剂中rnasefreedh2o、预混液、微滴发生油、2×质控液、阳性对照、阴性对照、10×cutsmartbuffer以及限制性内切酶的体积比为250-350：200-250：800-1200：500-700：80-120：8-16：250-350：0.5-2。其中，rnasefreedh2o、预混液、微滴发生油、2×质控液、阳性对照、阴性对照、10×cutsmartbuffer以及限制性内切酶的体积比例如可以为，但不限于250：200：800：500：80：8：250：0.5、300：225：1000：600：100：12：300：1或者350：250：1200：700：120：16：350：2。在一个优选的实施方式中，rnasefreedh2o、预混液、微滴发生油、2×质控液、阳性对照、阴性对照、10×cutsmartbuffer以及限制性内切酶的体积比为300：225：1000：600：100：12：300：1。在本发明中，测定defa1-3基因拷贝数的试剂盒中的各试剂用合适的外包装盒包装，贴标签标示名称、批号、生产日期、有效期。本发明提供的试剂盒具有高灵敏度、高准确度、高精确性、高可重复性的优点。本发明还提供了上述的试剂盒在测定defa1-3基因拷贝数中的应用。本发明还提供了一种defa1-3基因拷贝数的测定方法，应用上述的测定defa1-3基因拷贝数的试剂盒。在本发明中，测定方法包括如下步骤：步骤(a)：处理样本dna；其中，单个dna样本处理体系组成为：ddh2o20.3μl；10×cutsmartbuffer2.5μl；msel酶0.2μl；样本dna2μl(50ng左右)。配置完成后，37℃，60min后，65℃，20minpcr仪器中进行酶切反应。步骤(b)：制备微滴数字pcr反应液，微滴数字pcr反应液包括待测样本反应液和空白对照反应液，待测样本反应液包括步骤(a)中处理后的样本dna；其中，待测样本反应液和空白对照反应液的体积分别为20μl，待测样本反应液包括18μl的预混液和处理后的样本dna；步骤(c)：将步骤(b)中的待测样本反应液和空白对照反应液分别加入微滴发生卡中间的8个孔内，不足8个样品时用20μl1×ddpcr探针法质控液补足；步骤(d)：在微滴发生卡下部的8个孔内各加入70μl微滴发生油，并盖胶垫密封；步骤(e)：将微滴发生卡置于微滴生成仪中生成微滴，微滴生成于微滴发生卡上部的孔内；步骤(f)：取40μl生成的微滴，加入96孔板中，封膜，并进行pcr反应；其中，pcr反应条件为：预变性：温度96℃10min，1个循环；变性：温度98℃30s，退火：温度58℃45s，共40个循环；结束反应：温度98℃10min，1个循环；其中，pcr反应仪升降温速度小于2.5℃/秒；步骤(g)：对完成pcr反应的96孔板放入plateholder中组装好，之后放入微滴读取仪中，打开quantasoft软件，对微滴进行检测分析，得到待测基因拷贝数。本发明提供的defa1-3基因拷贝数的测定方法，应用了本发明提供的测定defa1-3基因拷贝数的试剂盒，具有操作方法简便，快速、敏感、准确的优点。另外，本发明还提供了上述的测定方法在测定defa1-3基因拷贝数中的应用。为了有助于更清楚的理解本发明的内容，现结合具体的实施例详细介绍如下。实施例1引物及探针的设计与筛选根据genbank中目的基因defa1-3相应序列(编号：mgi:mgi:99588)，选择长度为50～150bp的保守片段、采用primerexpress2.0软件设计特异性探针和引物，最终选择灵敏度最高、特异性强的目的基因的探针和引物进行实验。所得到的特异性检测defa1-3基因的上下游引物分别为：defa1-3-f：5'-ccgtccttccctctagacttagc-3'(seqidno.1)；defa1-3-r：5'-gagcagattgcagcggacat-3'(seqidno.2)；特异性检测defa1-3基因的探针为：fam-actgctaactccatactc-mgb(seqidno.3)。实施例2试剂盒的选择及试剂的预处理选择本发明提供的测定defa1-3基因拷贝数的试剂盒，包括微滴数字pcr检测试剂以及微滴发生卡。其中，微滴数字pcr检测试剂包括rnasefreedh2o，1支，1.2ml；ddpcr探针法预混液，一支，1.1ml；探针法ddpcr微滴发生油，一支，4ml；2×ddpcr探针法质控液，2.4ml；阳性对照，已知拷贝数为2，4，6，8，10，12，14，16的样品各一支，每支40μl；阴性对照(rnasefreedh2o)，一支，48μl；10×cutsmartbuffer1.2ml；msel酶一支，40单位(4μl)。选择已知拷贝数为2，4，6，8，10，12，14，16的阳性模板，使用0.01mph8.0的tris-edta缓冲液稀释100倍后，于-80℃冷冻保存，将检验合格的阳性对照制剂按400μl定量分装。ddpcr探针法预混液其1.1ml的组成为：600μl的2×ddpcrsupermixforprobes，上、下游引物分别为150μl，特异探针为50μl，引物和探针的浓度均为10μm，rnasefreedh2o250μl。实施例3待测样本的提取和处理随机选择15例危重病人和5例健康人从外周静脉中抽取2ml全血放入edta抗凝管中。使用dna提取试剂盒(qiagen，valencia，ca)提取样品总dna，并编号。将提取的每个总dna配置为处理体系并反应，其中，处理体系如下：样品体积(μl)ddh2o20.310×cutsmartbuffer2.5msel酶0.2样本dna2反应条件如下：温度(℃)时间(min)37606520实施例4待测样本defa1-3基因拷贝数的测定利用本发明实施例2提供的测定defa1-3基因拷贝数的试剂盒和本发明实施例3提供的待测样本dna，进行defa1-3基因拷贝数的测定，步骤如下：步骤(a)：制备ddpcr反应液，总体积20μl，向扩增管中加入下列反应物：ddpcr探针法预混液18μl，本发明实施例3提供的处理过的dna模板2μl。空白对照：以rnasefreedh2o代替dna模板，同样条件下扩增；步骤(b)：取微滴发生卡置于卡托中固定，将20μl反应液加入微滴发生卡中间一排的8个孔内，不足8个样品时用20μl1×ddpcr探针法质控液补足；步骤(c)：在微滴发生卡最低下一排8个孔中各加入70μl微滴发生油，并盖胶垫密封；步骤(d)：将以上卡托轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴；步骤(e)：微滴生成于微滴发生卡最上面一排孔内，缓慢吸取40μl，再打入96孔板相应位置孔内；步骤(f)：封好膜之后在96孔pcr仪内进行pcr反应，升降温速度小于2.5℃/秒；其中，pcr条件如下：步骤(g)：将完成pcr的96孔板放入plateholder中组装好，之后轻轻地平稳放入微滴读取仪中，顺序吸取每个样品的微滴并随载液流逐一通过双色检测器，有荧光信号的微滴为阳性，无荧光信号的微滴为阴性，打开quantasoft软件进行检测分析，软件记录每个样品里阳性微滴的比例，并自动分析数据。扩增已知拷贝数为a(值为2，4，6，8，10，12，14，16)，阳性对照defa1-3信号为m，rpp30信号为n，样品defa1-3的信号为m’，rpp30信号为n，则样品的拷贝数为(m’/m)×a。根据病人携带的defa1-3拷贝数量，可以判断该病人重症脓毒症发生的易感性。当defa1-3基因拷贝数大于8时，重症脓毒症易感性明显增加。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。sequencelisting<110>浙江大学<120>测定defa1-3基因拷贝数的试剂盒、方法及二者的应用<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列<400>1ccgtccttccctctagacttagc23<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2gagcagattgcagcggacat20<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列<400>3actgctaactccatactc18当前第1页12