本发明属于医药技术领域，具体涉及二氢嘧啶-三氮唑类衍生物及其制备方法与制药用途。
背景技术：
乙型病毒性肝炎(viralhepatitistypeb)，简称乙肝(hepatitisb)，是由乙型肝炎病毒(hbv)所致的重大传染性疾病，长期发展可导致急慢性病毒性肝炎、重型肝炎、肝硬化和原发性肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,hcc)。据世界卫生组织(who)报道，全球近20亿人曾感染过hbv，其中约2.4亿人为慢性hbv感染者，平均每年约有78万人死于hbv感染所致的急、慢性肝炎及相关并发症。目前用于预防和治疗慢性乙型肝炎(chb)的药物主要有疫苗、干扰素、免疫调节药以及dna聚合酶抑制剂。但是由于它们存在耐药性、副作用、停药后反弹和不能彻底的清除乙肝病毒等缺点，因此发现和研究新的安全、高效、低毒和抗耐药性的非核苷类乙肝病毒抑制剂显得至关重要。
核心蛋白是hbv核壳体组成的主要结构蛋白，在病毒进化过程中相对保守，并且核心蛋白的组装在乙肝病毒生命周期中发挥着重要作用。然而，目前还没有相关靶点的药物上市。针对目前进入临床候选药物肝毒性强、水溶性差以及代谢稳定性差的缺点，通过核心蛋白与配体的晶体复合物结构，进行了基于靶点的合理药物设计，设计合成了一类新颖的二氢嘧啶-三氮唑化合物，此类化合物在现有技术中未见相关报道。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供了二氢嘧啶-三氮唑类衍生物及其制备方法，本发明还提供了上述化合物作为非核苷类hbv抑制剂的活性筛选结果及其应用。
本发明的技术方案如下：
一、二氢嘧啶-三氮唑类衍生物
本发明涉及的二氢嘧啶-三氮唑类衍生物，具有如下通式i所示的结构：
其中，
r为氢、不同取代的烷基、含或不含取代基的苯环、含或不含取代基的杂环；
根据本发明优选的，通式i中，r为氢、含苯环、2-氨基取代的苯环、3-氨基取代的苯环、4-氨基取代的苯环、吡啶环、噻吩环、1-羟基戊烷基、对甲基苯甲酰胺甲基、均三甲基苯磺酰胺甲基。
进一步优选的，二氢嘧啶-三氮唑类衍生物是具有下列结构的化合物之一：
表1二氢嘧啶-三氮唑类衍生物结构式
二、二氢嘧啶-三氮唑类衍生物的制备方法
二氢嘧啶-三氮唑类衍生物的制备方法，首先以化合物2-噻唑甲脒盐酸盐、2-溴-4-氟苯甲醛和乙酰乙酸乙酯为起始原料，通过“一锅法”环合得到关键中间体2，在四氯化碳溶液中，中间体2与n一溴代丁二酰亚胺发生溴代反应得到重要中间体3，再与叠氮化钠进行取代反应得到重要中间体4，最后，中间体4与含不同取代基炔环加成得到目标化合物i；
合成路线如下：
试剂及条件:(i)2-溴-4-氟苯甲醛，乙酰乙酸乙酯，醋酸钠，乙醇，80℃；(ii)n-溴代丁二酰亚胺，四氯化碳，50℃；(iii)叠氮化钠，丙酮，25℃；(iv)五水硫酸铜，抗坏血酸钠，水，四氢呋喃，不同取代的炔，25℃；
其中，r同上述通式i中所述；
所述的含不同取代基炔环为2-氨基苯乙炔、3-氨基苯乙炔、2-乙炔基吡啶、2-乙炔基噻吩、苯乙炔、4-氨基苯乙炔、丙炔酸、1-庚炔-3-醇、n-炔丙基-(4甲基)苯甲酰胺、2,4,6-三甲基-n(2-丙炔基)苯磺酰胺。
本发明所述的二氢嘧啶-三氮唑类衍生物的制备方法，具体制备步骤如下：
(1)将2-噻唑甲脒盐酸盐12.22mmol溶于250ml无水乙醇中，下依次加入2-溴-4-氟苯甲醛18.42mmol，乙酰乙酸乙酯12.22mmol，乙酸钠12.22mmol，80℃回流反应6h；反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去无水乙醇，加入水，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，重结晶获取化合物2；
(2)将中间体24.71mmol溶于200ml四氯化碳中，缓慢加入n-溴代丁二酰亚胺4.94mmol，50℃回流反应10h。反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去四氯化碳，加入水，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，重结晶获取化合物3；
(3)将中间体3溶于45ml丙酮中，加入nan33.54mmol，室温搅拌反应过夜。反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去四氯化碳，加入水，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥；浓缩，重结晶获取化合物4；
(4)将中间体40.43mmol溶于6ml四氢呋喃中，依次加入五水硫酸铜0.043mmol，抗坏血酸钠0.13mmol，不同取代炔类化合物0.86mmol，室温搅拌反应过夜。反应结束后，冷却至室温，加入水，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，重结晶得到目标化合物i。
本发明所述的室温为15-25℃。
三、二氢嘧啶-三氮唑类衍生物的应用
本发明公开了二氢嘧啶-三氮唑类衍生物抗hbv活性筛选结果及其作为抗hbv抑制剂的应用。通过实验证明本发明的二氢嘧啶-三氮唑类衍生物可作为经典的hbv非核苷类抑制剂应用。
如表2所示，对所合成的目标化合物i(5a-5j)进行了体外抗hbv活性评价，通过cck-8法测定了20μm和5μm药物浓度下细胞的死亡率；同时，通过pcr法测定了20μm和5μm药物浓度下抑制hbvdna复制活性，选择先导化合物gls4和上市药物拉米夫定为阳性对照，其中5a和5g表现了较好的抑制hbvdna复制活性。
如表3所示，根据初步筛选的结果，对初筛的目标化合物5a和5g进一步的体外抗hbv活性评价，通过cck-8法测定了药物在不同浓度下的细胞毒性；通过pcr法测定了药物在不同浓度下抑制hbvdna复制活性；同时，通过酶联免疫法测定了药物在不同浓度下对hbsag和hbeag抗原的分泌抑制活性。选择先导化合物gls4和上市药物拉米夫定为阳性对照，每个化合物设置五个浓度梯度(50μm，5μm，0.5μm，0.05μm和0.005μm)，分别计算出半数抑制浓度cc50、ic50和选择性系数si。
本发明的二氢嘧啶-三氮唑类衍生物是一类结构新颖的非核苷类hbv抑制剂，可作为抗hbv的先导化合物。
本发明的二氢嘧啶-三氮唑类衍生物可作为非核苷类hbv抑制剂应用。具体地说，作为hbv抑制剂用来制备抗乙肝药物。
一种抗hbv药物组合物，包括本发明的二氢嘧啶-三氮唑类衍生物和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。
本发明公开了二氢嘧啶-三氮唑类衍生物、其制备方法、抗hbv活性筛选结果及其作为抗hbv抑制剂的首次应用。实验证明本发明的二氢嘧啶-三氮唑类衍生物可作为hbv抑制剂用于制备抗乙肝药物。
具体实施方式
通过下述实例有助于理解本发明，但是不能限制本发明的内容，在下列实例中，所有目标化合物的编号与表1相同。
合成路线：
试剂及条件:(i)2-溴-4-氟苯甲醛，乙酰乙酸乙酯，醋酸钠，乙醇，80℃；(ii)n-溴代丁二酰亚胺，四氯化碳，50℃；(iii)叠氮化钠，丙酮，25℃；(iv)五水硫酸铜，抗坏血酸钠，水，四氢呋喃，不同取代的炔，25℃；
实施例1.化合物2的制备
取500ml圆底烧瓶，将2-噻唑甲脒盐酸盐(2.00g,12.22mmol)溶于250ml无水乙醇中，室温条件下依次加入2-溴-4-氟苯甲醛(3.74g,18.42mmol)，乙酰乙酸乙酯(1559μl,12.22mmol)，乙酸钠(1.66g,12.22mmol)，80℃回流反应6h。反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去无水乙醇，加入水(60ml)，乙酸乙酯萃取三次(25mlx3)，合并有机相，饱和食盐水洗三次(30mlx3)，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，二氯甲烷-正己烷混合溶剂重结晶获取黄色固体3.98g，收率76％；熔点153-156℃。
化合物2波谱数据：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.81(d,j＝2.8hz,1h),7.46(s,1h),7.38–7.28(m,2h),6.97(t,j＝8.2hz,1h),6.15(s,1h),4.05(q,j＝7.1hz,2h),2.53(s,3h),1.13(t,j＝7.1hz,3h)；ei-ms:424.3[m+h]+.
实施例2.化合物3的制备
取500ml圆底烧瓶，将中间体2(2.00g，4.71mmol)溶于200ml四氯化碳中，缓慢加入nbs(0.88g，4.94mmol)，50℃回流反应10h。反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去四氯化碳，加入水(50ml)，乙酸乙酯萃取三次(20mlx3)，合并有机相，饱和食盐水洗三次(25mlx3)，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，二氯甲烷-正己烷混合溶剂重结晶获取黄色固体1.21g，收率51％；熔点123-128℃。
化合物1的波谱数据：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.84(d,j＝3.1hz,1h),7.52(s,2h),7.44–7.35(m,1h),7.32(dd,j＝8.1,2.6hz,1h),7.02(t,j＝8.0hz,1h),6.09(s,1h),4.94(d,j＝8.9hz,1h),4.61(s,1h),4.09(d,j＝7.0hz,2h),1.16(t,j＝7.1hz,3h)；ei-ms:502.2[m+h]+.
实施例3.化合物4的制备
取100ml圆底烧瓶，将中间体x-3(0.89g，1.77mmol)溶于45ml丙酮中，加入nan3(0.23g，3.54mmol)，室温搅拌过夜。反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去四氯化碳，加入水(50ml)，乙酸乙酯萃取三次(20mlx3)，合并有机相，饱和食盐水洗三次(25mlx3)，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，二氯甲烷-正己烷混合溶剂重结晶获取黄色固体0.85g，收率91％；熔点123-126℃。
化合物4波谱分析数据：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.64(s,1h),7.85(d,j＝3.1hz,1h),7.55(d,j＝3.1hz,1h),7.48–7.37(m,1h),7.35–7.29(m,1h),7.10–6.92(m,1h),6.29–6.02(m,1h),4.97(s,1h),4.60(d,j＝2.6hz,1h),4.17–4.00(m,2h),1.13(t,j＝7.1hz,3h)；13cnmr(100mhz,cdcl3)δ165.78,165.03,163.31,162.71,162.36,162.09,160.80,160.22,154.83,150.00,143.92,143.54,143.10,142.75,139.59,137.74(d,j＝3.5hz),130.80,130.72,130.61,124.92,123.38,122.07(d,j＝9.7hz),120.23(dd,j＝24.4,17.0hz),115.83,115.62,115.18,114.97,106.27,98.60,77.37,77.06,76.74,60.70,60.32,58.37,51.91(d,j＝2.0hz),49.79,14.07(d,j＝5.7hz)；ei-ms:465.4[m+h]+.
实施例4.化合物5a的制备
取25ml圆底烧瓶，将中间体4(200mg,0.43mmol)溶于6ml四氢呋喃中，室温下依次加入五水硫酸铜(10.8mg,0.043mmol)，抗坏血酸钠(25.6mg,0.13mmol)，邻氨基苯乙炔(101mg,0.86mmol)，室温搅拌过夜。反应结束后，冷却至室温，加入水(40ml)，乙酸乙酯萃取三次(20mlx3)，合并有机相，饱和食盐水洗三次(25mlx3)，无水硫酸钠干燥；浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，二氯甲烷-正己烷混合溶剂重结晶得到黄色固体，收率：73％，熔点：184-187℃。
化合物5a波谱数据：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.08(s,1h),7.79(d,j＝3.1hz,1h),7.52(s,1h),7.47(d,j＝3.1hz,1h),7.43(dd,j＝7.7,1.3hz,1h),7.34(ddd,j＝9.3,8.4,4.2hz,2h),7.16–7.07(m,1h),7.03(td,j＝8.3,2.5hz,1h),6.77(dd,j＝6.6,5.9hz,1h),6.72(dd,j＝11.6,4.3hz,1h),6.17(t,j＝15.1hz,1h),5.94(dd,j＝39.1,15.3hz,2h),5.54(s,2h),4.14(q,j＝7.2hz,2h),1.17(t,j＝7.1hz,3h)；13cnmr(100mhz,cdcl3)δ165.02,162.10(d,j＝252.8hz),161.77,152.47,150.09,147.97,145.20,143.95,137.62,130.77(d,j＝8.8hz),128.78,127.74,125.06,122.04(d,j＝9.7hz),121.84,120.37(d,j＝24.7hz),117.24,116.67,115.85(d,j＝21.1hz),114.17,106.48,60.92,52.12,52.00,14.08；ei-ms:582.3[m+h]+.
实施例5.化合物5b的制备
操作同实施例4，所不同的是将邻氨基苯乙炔换成2-氨基苯乙炔。黄色固体，收率：75％，熔点：148-151℃。
化合物5b波谱数据：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.02(s,1h),7.78(d,j＝3.1hz,1h),7.54(s,1h),7.45(d,j＝3.1hz,1h),7.41–7.28(m,3h),7.23–7.15(m,2h),7.03(td,j＝8.3,2.5hz,1h),6.73–6.58(m,1h),6.17(d,j＝32.5hz,1h),5.92(q,j＝15.4hz,2h),4.13(q,j＝7.1hz,2h),3.77(s,2h),1.16(t,j＝7.1hz,3h)；13cnmr(100mhz,cdcl3)δ165.04,162.08(d,j＝252.8hz),161.82,152.60,150.06,147.41,146.88,143.93,137.66(d,j＝3.4hz),132.04,130.80(d,j＝8.8hz),129.71,125.07,123.28,122.03(d,j＝9.7hz),121.70,120.34(d,j＝24.7hz),116.10,115.82(d,j＝21.1hz),114.69,112.34,106.33,60.90,52.12,52.00,14.08；ei-ms:582.3[m+h]+.
实施例6.化合物5c的制备
操作同实施例4，所不同的是将邻氨基苯乙炔换成2-乙炔吡啶。橙黄色固体，收率：74％，熔点194-197℃。
化合物5c波谱数据：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.59(d,j＝4.8hz,1h),8.39(s,1h),8.22(d,j＝7.9hz,1h),7.84–7.71(m,2h),7.53(s,1h),7.43(d,j＝3.1hz,1h),7.38(dd,j＝8.6,5.9hz,1h),7.32(dd,j＝6.6,4.0hz,1h),7.22(ddd,j＝7.5,4.9,1.1hz,1h),7.04(td,j＝8.3,2.5hz,1h),6.13(d,j＝2.4hz,1h),5.95(dd,j＝31.5,15.3hz,2h),4.14(q,j＝7.1hz,2h),1.16(t,j＝7.1hz,3h)；13cnmr(100mhz,cdcl3)δ164.97,162.08(d,j＝252.7hz),161.83,152.44,150.77,150.12,149.41,148.02,143.87,137.69(d,j＝3.5hz),136.81,130.81(d,j＝8.8hz),125.04,123.71,122.61,122.02(d,j＝9.7hz),120.45,120.27,120.20,115.85(d,j＝21.1hz),106.58,60.91,52.31,51.99,14.07；ei-ms:568.4[m+h]+.
实施例7.化合物5d的制备
操作同实施例4，所不同的是将邻氨基苯乙炔换成2-乙炔噻吩。橙黄色固体，收率：76％，熔点：108-110℃。
化合物5d波谱数据：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.99(s,1h),7.79(d,j＝3.1hz,1h),7.52(s,1h),7.47(d,j＝3.1hz,1h),7.44–7.39(m,1h),7.39–7.27(m,3h),7.08(dd,j＝5.0,3.6hz,1h),7.04(td,j＝8.3,2.6hz,1h),6.13(s,1h),5.91(q,j＝15.5hz,2h),4.21–4.07(m,2h),1.17(t,j＝8.3hz,3h)；13cnmr(100mhz,cdcl3)δ165.01,162.11(d,j＝252.8hz),161.77,152.38,150.07,143.96,142.38,137.61(d,j＝3.6hz),133.53,130.78(d,j＝8.8hz),127.64(d,j＝10.3hz),125.04,124.72,123.91,122.04(d,j＝9.7hz),121.28,120.37(d,j＝24.6hz),115.84(d,j＝21.0hz),106.41,60.93,52.14,52.00,14.07；ei-ms:573.4[m+h]+.
实施例8.化合物5e的制备
操作同实施例4，所不同的是将邻氨基苯乙炔换成苯乙炔。橙黄色固体，收率：71％，熔点：109-112℃。
化合物5e波谱数据：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.07(s,1h),7.90(d,j＝1.3hz,1h),7.88(s,1h),7.78(d,j＝3.1hz,1h),7.54(s,1h),7.48–7.29(m,6h),7.03(td,j＝8.3,2.6hz,1h),6.13(s,1h),5.93(dd,j＝36.0,15.4hz,2h),4.14(q,j＝7.1hz,2h),1.17(t,j＝7.1hz,3h)；13cnmr(101mhz,cdcl3)δ165.04,162.09(d,j＝252.8hz),161.81,152.55,150.06,147.33,137.65(d,j＝3.5hz),131.14,130.80(d,j＝8.8hz),128.91,128.81,127.89,125.84,125.75,125.01,122.05(d,j＝9.7hz),121.66,120.36(d,j＝24.6hz),115.82(d,j＝21.1hz),106.41,60.91,52.13,52.01,14.08；ei-ms:567.4[m+h]+.
实施例9.化合物5f的制备
操作同实施例4，所不同的是将邻氨基苯乙炔换成4-氨基苯乙炔。橙黄色固体，产率：52％，熔点：123-127℃。
化合物5f波谱数据：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.93(s,1h),7.78(d,j＝3.0hz,1h),7.68(d,j＝8.2hz,2h),7.52(s,1h),7.45(d,j＝2.8hz,1h),7.40–7.34(m,1h),7.32(dd,j＝8.1,2.5hz,1h),7.02(t,j＝9.1hz,1h),6.74(d,j＝8.5hz,2h),6.17(d,j＝29.7hz,1h),5.90(q,j＝15.2hz,2h),4.13(q,j＝7.1hz,2h),3.78(s,2h),1.17(t,j＝7.1hz,3h)；13cnmr(100mhz,cdcl3)δ165.05,162.08(d,j＝252.6hz),161.88,152.71,150.04,147.66(s),146.26,143.91,137.64,130.81(d,j＝8.9hz),126.96,125.01,121.98,121.74,120.35,120.33(d,j＝24.6hz),115.81(d,j＝21.1hz),115.27,106.37,60.89,52.08,51.99,14.08；ei-ms:582.3[m+h]+.
实施例10.化合物5g的制备
操作同实施例4，所不同的是将邻氨基苯乙炔换成丙炔酸。橙黄色固体，产率：72％，熔点：115-119℃。
化合物5g波谱数据：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.85(d,j＝0.7hz,1h),7.80(d,j＝3.1hz,1h),7.75(s,1h),7.52(s,1h),7.49(d,j＝3.1hz,1h),7.39–7.28(m,2h),7.03(td,j＝8.3,2.6hz,1h),6.13(d,j＝2.4hz,1h),5.95(s,1h),5.90(s,1h),4.13(q,j＝7.1hz,2h),1.15(t,j＝7.1hz,3h)；13cnmr(100mhz,cdcl3)δ165.00,162.08(d,j＝252.8hz),161.81,152.58,150.03,143.97,137.64(d,j＝3.5hz),133.35,130.76(d,j＝8.8hz),125.23,124.90,122.03(d,j＝9.6hz),120.34(d,j＝24.6hz),115.80(d,j＝21.1hz),106.44,60.88,51.96,51.85,14.05；ei-ms:491.4[m+h]+.
实施例11.化合物5h的制备
操作同实施例4，所不同的是将邻氨基苯乙炔换成1-庚炔-3-醇。橙黄色固体，产率：61％，熔点：79-83℃。
化合物5h波谱数据：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.78(d,j＝3.1hz,1h),7.76(s,1h),7.46(d,j＝2.9hz,1h),7.39–7.25(m,2h),7.02(td,j＝8.3,2.3hz,1h),6.13(s,1h),5.93(dd,j＝15.4,7.7hz,1h),5.82(dd,j＝15.4,7.5hz,1h),4.93(t,j＝6.5hz,1h),4.11(q,j＝7.1hz,2h),2.60(s,1h),1.99–1.84(m,2h),1.63–1.28(m,4h),1.15(t,j＝7.1hz,3h),0.88(t,j＝7.1hz,3h)；ei-ms:577.5[m+h]+.
实施例12.化合物5i的制备
操作同实施例4，所不同的是将邻氨基苯乙炔换成n-炔丙基-(4甲基)苯甲酰胺。橙黄色固体，产率：47％，熔点：85-89℃。
化合物5i波谱数据：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.93(s,1h),7.72(d,j＝8.1hz,2h),7.70(d,j＝3.1hz,1h),7.30(ddd,j＝15.0,7.8,5.2hz,3h),7.20(d,j＝7.9hz,2h),7.15(s,1h),7.00(td,j＝8.3,2.5hz,1h),6.11(s,1h),5.89(dd,j＝40.6,15.7hz,2h),4.76(d,j＝5.2hz,2h),4.11(q,j＝7.1hz,2h),2.37(s,3h),1.14(t,j＝7.1hz,3h)；ei-ms:638.3[m+h]+.
实施例13.化合物5j1的制备
操作同实施例4，所不同的是将邻氨基苯乙炔换成2,4,6-三甲基-n(2-丙炔基)苯磺酰胺。橙黄色固体，产率：61％，熔点：96-99℃。
化合物5j波谱数据：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.81(d,j＝3.1hz,1h),7.69(s,1h),7.51(d,j＝3.1hz,2h),7.36–7.29(m,2h),7.04(td,j＝8.3,2.5hz,1h),6.95(s,2h),6.12(d,j＝2.5hz,1h),5.05(t,j＝6.0hz,1h),4.25(d,j＝6.1hz,2h),4.12(d,j＝7.1hz,3h),2.65(s,6h),2.31(s,3h),1.15(t,j＝7.1hz,3h)；13cnmr(100mhz,cdcl3)δ164.94,162.09(d,j＝252.9hz),161.70,152.26,150.06,144.00,142.94,142.34,139.11,137.63(d,j＝3.5hz),133.50,132.01,130.77(d,j＝8.8hz),125.08,124.14,122.02(d,j＝9.7hz),120.35(d,j＝24.7hz),115.85(d,j＝21.1hz),106.36,60.89,58.31,51.97,38.34,22.98,20.95,14.05；ei-ms:702.4[m+h]+.
实施例14.目标化合物的体外抗hbv细胞活性筛选试验
测试原理
hbv转染的肝癌细胞hepg2.2.15细胞株，在进行细胞培养时能够分泌hbv病毒颗粒(包含hbsag、hbeag和dna)。在抗hbv目标化合物的干预下，细胞分泌hbsag的和hbeag的含量和产生的dna会有所变化，因此检测细胞分泌到培养上清中的hbsag的和hbeag的含量以及产生的hbvdna，参照未加药对照组的含量，可以反映样品药物的抗病毒活性作用。以拉米夫定为阳性对照药，用酶联免疫法(elisa)检测样品药物达到抑制病毒hbsag的和hbeag分泌的50％时的浓度数值为ic50；用聚合酶链反应(pcr)检测药物抑制hbvdna复制量的50％时的浓度数值ic50；运用cck-8检测样品药物导致50％细胞毒性死亡的数值浓度为cc50值；并计算出待测化合物的“选择系数”(selectivityindex)，计算公式：si＝cc50/ic50。
测试方法
(1)细胞毒性实验
配成实验所需样品储备浓度(100μmol/l)，每个样品用hepg2.2.15细胞培养液配制2个稀释浓度(20μmol/l和5μmol/l)进行初步活性筛选，设立空白对照并以拉米夫定作为的阳性对照药。加入96孔板细胞培养板，每浓度3复孔，每4天换同浓度药液并设无药细胞对照组，共培养9天。用cck-8法检测细胞存活率，确定药物对hepg2.2.15细胞的毒性。对活性好的化合物用hepg2.2.15细胞培养液配制5个稀释浓度(50μmol/l和5μmol/l、0.5μmol/l、0.05μmol/l、0.005μmol/l)，设立空白对照并以拉米夫定作为的阳性对照药。加入96孔板细胞培养板，每浓度3复孔，每4天换同浓度药液并设无药细胞对照组，共培养9天。用cck-8法检测细胞存活率，确定药物对hepg2.2.15细胞的毒性。
(2)抑制hbeag和hbsag抗原分泌实验
hepg22.2.15细胞在96孔细胞培养板中培养24小时后，加入所配不同浓度含药培养液，继续培养8天(每4天换液一次)，收集上清液，用hbsag和hbeag诊断试剂盒(elisa)检测hbsag和hbeag。
(3)抑制hbvdna合成实验(pcr方法)
hepg22.2.15细胞在96孔细胞培养板中培养24小时后，加入所配20μmol/l和5μmol/l含药培养液，继续培养8天(每4天换液一次)，收集上清液，用探针法进行pcr检测。
表2.目标化合物抑制hbvdna复制及细胞毒性的初步评价
如表2所示，对所合成的13个化合物进行了体外抗hbv活性评价，通过cck-8法测定了20μm和5μm药物浓度下细胞的死亡率；同时，通过pcr法测定了20μm和5μm药物浓度下抑制hbvdna复制活性。
初步活性筛选结果表明，在20μm浓度下，化合物3、4、5b、5c、5f、5h和5i都表现了较大的细胞毒性，且大部分化合物抑制hbvdna复制活性的抑制率大于50％，与拉米夫定的活性相当，因此又进行了浓度为5μm的初步活性筛选。实验结果表明，在5μm浓度下，所有的化合物都表现了较低的细胞死亡率，且接近或低于先导化合物gls4和阳性药物拉米夫定的细胞毒性；另外，目标化合物5a和5g表现了相对较好的抑制hbvdna复制活性，其抑制率分别为59.9±2.0和68.2±6.8，分别相当于和优于阳性药物拉米夫定(59.4±1.8)，但弱于先导化合物gls4的抑制hbvdna复制活性(83.7±1.6)，可以进一步活性研究。
表3.活性化合物、先导化合物gls4和上市药物拉米夫定抗乙肝病毒活性
如表3所示，根据初步筛选的结果，对初筛的目标化合物5a和5g进一步的体外抗hbv活性评价，通过cck-8法测定了药物在不同浓度下的细胞毒性；通过pcr法测定了药物在不同浓度下抑制hbvdna复制活性；同时，通过酶联免疫法测定了药物在不同浓度下对hbsag和hbeag抗原的分泌抑制活性。选择先导化合物gls4和上市药物拉米夫定为阳性对照，每个化合物设置五个浓度梯度(50μm，5μm，0.5μm，0.05μm和0.005μm)，分别计算出半数抑制浓度cc50、ic50和选择性系数si。
活性结果表明，目标化合物5a表现了较小的细胞毒性，其cc50大于50μm，明显优于先导化合物gls4(22.4±2.1μm)；另外，还表现了较好的抑制hbvdna复制活性，其ic50为0.35±0.04μm，优于上市药物拉米夫定(0.54±0.18μm)，弱低于gls4(0.13±0.05μm)；5a抑制hbvdna复制的选择性系数(si)大于143，优于或相似于先导化合物gls4(22.4±2.1μm)和上市药物拉米夫定(>93)但是，未表现抑制hbsag和hbeag分泌活性。化合物5g表现了一定的细胞毒性，其cc50为20.9±1.2μm，略高于先导化合物gls4和拉米夫定；另外，也表现了一定的抑制hbvdna复制的活性，其ic50为0.86±0.32μm，与gls4和拉米夫定在同一数量级；可能因为其细胞毒性，表现了微弱的抑制hbsag和hbeag分泌活性，其ic50分别为16.5±0.42μm和14.2±0.85μm，因此需要进一步的修饰研究。