本发明属于哈维弧菌技术领域，具体涉及一种基于热击的哈维弧菌同源重组基因敲除的方法。
背景技术：
哈维弧菌是一种革兰氏阴性、发光呈弯曲短杆菌，具发酵能力，极生单鞭毛。哈维弧菌在海洋中的自由水体、浮游动植物体表、海底沉积物中大量存在，是一种普遍存在于海洋环境中的病原菌，可感染多种鱼、虾、蟹等并造成大量的死亡，给海水养殖业带来巨大的损失。因此，阐明其致病机制并制备相关疫苗，进行免疫防控迫在眉睫。
基因敲除，又称基因打靶，是一种新型的分子生物学技术，该技术利用接合转化，将构建的打靶载体导入靶细胞后，通过重组载体dna序列和靶细胞内染色体上的同源dna序列，将载体dna定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，或与靶细胞基因组上某一确定片段置换，使机体特定的基因失活或缺失，从而改变细胞遗传特性的方法。
致病机制研究通常涉及基因敲除的基因工程操作，而这些方法通常通过基因接合转移法进行。但是，该方法的接合转移效率对于不同种属细菌存在差异。迄今为止，哈维弧菌的接合转移效率一直很低甚至大多数菌株不能成功接合转移，其基因敲除的常规同源重组法常常受到阻碍。
技术实现要素：
本发明针对因哈维弧菌的接合转化不成功或者效率低从而难以进行基因敲除的难题，通过对接合受体菌哈维弧菌进行热击处理，建立一种基于热击的哈维弧菌同源重组基因敲除的方法。
本发明的上述目的是通过如下技术方案实现的：一种基于热击的哈维弧菌同源重组基因敲除的方法，包括以下步骤：将培养至对数早期的哈维弧菌受体菌热击处理后与培养至对数早期的供体菌进行等体积混匀，室温离心去上清，菌沉淀后重悬，点种至固体平板上，接合过夜，通过对接合受体菌哈维弧菌热击处理，使得哈维弧菌的接合转化效率从无到有，从而对哈维弧菌进行基因敲除。
优选的，本发明热击处理时的温度为35～50℃。
进一步的，本发明热击处理时的温度为35～50℃时，热击处理时的时间为10min以上。
优选的，本发明在28℃接合过夜。
本发明所述的供体菌优选为携带有待缺失片段上下游同源臂的重组自杀质粒。
具体的，本发明中的基于热击的哈维弧菌同源重组基因敲除的方法，包括以下步骤：
(1)确定待突变基因x的上下游序列以及自杀质粒插入位点，利用neb在线软件(http://nebμilder.neb.com/)设计无缝克隆法重组子载体构建引物，得到上游同源臂扩增引物对x-up-f/r、下游同源臂扩增引物对x-down-f/r，自杀质粒线性化引物对p-f/r，重组子质粒检测引物对p-check-f/r及待突变基因缺失检测引物对x-del-check-f/r；
(2)提取哈维弧菌基因组为模板，基于引物对x-up-f/r和x-down-f/r，利用pcr技术获取拟敲除基因长度约为1000bp的上游同源臂片段up及下游同源臂片段down，琼脂糖电泳检测后切胶回收；
(3)提取自杀质粒为模板，基于引物对p-f/r，利用pcr技术获取长度为3309bp的质粒片段p，琼脂糖电泳检测后切胶回收；
(4)利用商品化多片段无缝克隆试剂盒clonexpressmultisonestepcloningkit(vazyme)将步骤(2)获得的上下游同源臂与步骤(3)获得的质粒片段进行等温组装；
(5)将等温组装液转化入大肠杆菌escherichiacoligeb802感受态细胞，pcr检测后获得阳性重组子p-△x；
(6)提取阳性重组质粒p-△x，转化入大肠杆菌escherichiacoligeb883感受态细胞，得到携带重组子的p-△x-e.coligeb883，并以其作为接合供体菌；
(7)将供体菌p-△x-e.coligeb883划线于添加有20μg/ml氯霉素和0.3mmdap(2,6-diaminopimelicacid)的lb固体平板上，于37℃过夜培养活化；
(8)挑取(7)中活化菌体所形成的单克隆菌落，接种于添加有20μg/ml氯霉素和0.3mmdap的lb液体培养基中，37℃、200rpm培养至对数早期od600nm＝0.3～0.7；
(9)配置lbs固体平板，对受体菌哈维弧菌进行28℃下过夜培养活化；
(10)挑取(9)中活化菌体所形成的单克隆菌落，接种于添加lbs液体培养基中，28℃、200rpm培养至对数早期od600nm＝0.3～0.7；
(11)移液器移取0.5ml(10)中准备好的受体菌至1.5ml无菌离心管中，将其置于金属浴，于35～50℃热击处理10min以上，与(8)中准备好的0.5ml供体菌混匀，于6000rpm、室温离心3min；
(12)去上清后，菌沉淀用50μllbs液体培养基重悬，点种到lbs+0.3mmdap固体平板，于28℃培养过夜；
(13)用接菌环刮取过夜接合菌斑，重悬于1mllbs液体培养基中，11,000rpm、室温离心2min离心，去上清，菌体沉淀用1mllbs液体培养基重悬；
(14)11,000rpm、2min离心，去上清，菌体沉淀用0.1mllbs液体培养基重悬，并涂布在lbs+34μg/mlcm+0.2％d-glucose平板上，28℃倒置培养至克隆长出；
(15)发生第一次同源重组的接合克隆在相同平板上纯化两次；
(16)接合克隆划线至lbs+0.2％arabinose固体平板上，接合克隆发生第二次同源重组，载体离开受体菌染色体，从而离开受体菌；
(17)重组克隆在lbs+0.2％arabinose平板上纯化，同时划线至lbs+34μg/mlcm+0.2％arabinose平板上检测其是否具有cm抗性；
(18)基于引物对x-del-check-f/r，对阿拉伯糖抗性、氯霉素敏感性克隆进行pcr检测，获得突变株。
进一步的，步骤(1)中所述的自杀质粒为psw7848，为低拷贝质粒，携带氯霉素抗性，具有需要pir蛋白的r6k复制起始点，转移起始点orit，以及受阿拉伯糖诱导的毒性基因ccdb；
进一步的，步骤(5)中所述的大肠杆菌escherichiacoligeb802可编码pir蛋白，且为2’-deoxythymidine(thy)营养缺陷型；
进一步的，步骤(6)中所述的大肠杆菌escherichiacoligeb883可编码pir蛋白，且为2,6-diaminopimelicacid(dap)营养缺陷型，并且可编码rp4，用于接合转移；
进一步的，步骤(7)中所述的配置添加有20μg/ml氯霉素和0.3mmdap(2,6-diaminopimelicacid)的lb固体平板中含有酵母提取物5g/l、蛋白胨10g/l、nacl10g/l、技术琼脂粉15g/l、20μg/ml氯霉素以及0.3mmdap。
进一步的，步骤(8)中所述的添加有20μg/ml氯霉素和0.3mmdap的lb液体培养基中含有酵母提取物5g/l、蛋白胨10g/l、nacl10g/l、20μg/ml氯霉素以及0.3mmdap，其余为水。
进一步的，步骤(9)中所述的配置lbs固体平板中含有酵母提取物5g/l、蛋白胨10g/l、nacl30g/l、技术琼脂粉15g/l；
进一步的，步骤(10)中所述的lbs液体培养基中含有酵母提取物5g/l、蛋白胨10g/l、nacl30g/l，其余为水；
进一步的，步骤(12)中所述的lbs+0.3mmdap固体平板中含有酵母提取物5g/l、蛋白胨10g/l、nacl30g/l、技术琼脂粉15g/l以及0.3mmdap。
进一步的，步骤(14)中所述的lbs+34μg/mlcm+0.2％d-glμcose固体平板中含有酵母提取物5g/l、蛋白胨10g/l、nacl30g/l、技术琼脂粉15g/l、34μg/ml氯霉素以及0.2％d-glμcose。
进一步的，步骤(16)中所述的lbs+0.2％arabinose固体平板中含有酵母提取物5g/l、蛋白胨10g/l、nacl30g/l、技术琼脂粉15g/l以及0.2％arabinose。
进一步的，步骤(17)中所述的lbs+34μg/mlcm+0.2％arabinose固体平板中含有酵母提取物5g/l、蛋白胨10g/l、nacl30g/l、技术琼脂粉15g/l、34μg/ml氯霉素以及0.2％arabinose。
本发明具有以下优点：
(1)本发明基于热击的哈维弧菌同源重组基因敲除的方法，该方法在传统的接合转移法的技术基础上，通过对接合受体菌哈维弧菌热击处理，使得哈维弧菌的接合转化效率从无到有，成功对哈维弧菌进行基因敲除；
(2)本发明基于两次同源重组原理进行哈维弧菌的基因敲除，操作简单，在接合转化过程对受体菌热击处理，使得接合转化效率从无到有，发生质变，开辟了哈维弧菌同源重组基因敲除平台，同时，该方法不同于传统的转座插入突变，该方法目的明确，不易产生极性效应，且不引入外源基因，使对目的基因的功能分析更为准确。
附图说明
图1为实施例1中以rbsb为例的哈维弧菌片段的构建及基于热击的基因敲除流程图；
图2为实施例1中rbsb上下游同源臂的电泳检测结果图，其中泳道m为dl2000dnamarker，泳道1为rbsb上游同源臂扩增结果，泳道2为rbsb下游同源臂扩增结果；
图3为实施例1中psw7848线性化片段的电泳检测结果图，其中泳道m为dl10000dnamarker，泳道1为psw7848线性化扩增结果；
图4为实施例1中重组子电泳检测结果图，其中泳道m为dl10000dnamarker，泳道1为重组子pcr检测结果；
图5为实施例1中哈维弧菌rbsb突变株电泳检测结果图，其中泳道m为dl2000dnamarker，泳道1为突变株pcr检测结果，泳道2为野生株扩增结果。
具体实施方式
下面接合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
生物材料来源：
本发明所述重组子中间宿主e.coligeb802、供体菌e.coligeb883及自杀质粒psw7848均由巴黎十一大学annickjacq教授赠送；同源臂及质粒线性化扩增所用dna聚合酶为takara公司的高保真酶
一般性说明：
大肠杆菌e.coligeb802或者e.coligeb883感受态细胞的制备
(1)e.coligeb802或者e.coligeb883划线至添加0.3mmthy或者0.3mmdap的lb固体平板上，于37℃培养过夜；
(2)挑取e.coligeb802或者e.coligeb883单克隆至添加0.3mmthy或者0.3mmdap的lb液体培养基中，于37℃、200rpm培养过夜；
(3)1ml过夜菌液稀释至100ml添加0.3mmthy或者0.3mmdap的lb液体培养基，于37℃、200rpm培养至od600nm＝0.6～0.8；
(4)菌液置于冰上冷却10min，于4℃，4000rpm离心15min；
(5)去上清，菌沉淀用50ml灭菌冷却的50mm的cacl2重悬，置于冰上20min；
(6)菌液于4℃，4000rpm离心15min；
(7)去上清，菌沉淀用2.5ml灭菌冷却的含有25％甘油的50mm的cacl2重悬；
(8)重悬的细胞用灭菌的1.5ml离心管分装100μl/管，置于-80℃，待用。
等温组装液或者阳性重组质粒转化入大肠杆菌e.coligeb802或者e.coligeb883感受态细胞
(1)取100μle.coligeb802或者e.coligeb883感受态细胞于冰上融化；
(2)5.0μl等温组装液或阳性重组质粒加入到100μl感受态细胞中，轻柔混匀，冰上孵育20min；
(3)42℃热击2min，立即置于冰上孵育2min；
(4)加入1ml添加0.3mmthy或者0.3mmdap的lb液体培养基，于37℃、150rpm振摇培养1h；
(5)取100μl菌液涂布在添加有20μg/ml氯霉素和0.3mmthy或者0.3mmdap的lb固体平板上，37℃倒置培养过夜，直至克隆长出；
(6)用牙签挑取单克隆培养至添加有20μg/ml氯霉素和0.3mmthy或者0.3mmdap的lb液体培养基中，待菌体长出后，pcr检测，并用灭菌的15％的甘油冻存阳性克隆在灭菌冻存管中，-80℃保存待用。
实施例1
以基因rbsb(abctransportersubstrate-bindingprotein)为例说明一种基于热击方法对哈维弧菌实现同源重组基因敲除的步骤(图1)。
rbsb基因(seqidno.1)orf全长879bp，可编码292个氨基酸组成的核糖体结合蛋白，主要功能参与d-核糖的结合与转运。在某些细菌中，推测该基因还可作为ai-2受体，参与群体感应，介导细菌生长与生物膜形成，但是具体调控机制尚不明晰。
本研究中获得的rbsb基因敲除株为深入研究rbsb基因功能提供了前提，而该基因功能的阐明有助于进一步分析哈维弧菌的致病机制，同时可能作为疫苗开发的潜在靶点。
(1)确定待突变基因rbsb的上下游序列以及自杀质粒psw7848的插入位点，利用neb在线软件(http://nebμilder.neb.com/)设计无缝克隆法重组子载体构建引物，得到上游同源臂扩增引物对rbsb-up-f/r、下游同源臂扩增引物对rbsb-down-f/r，自杀质粒线性化引物对psw7848-f/r，重组子质粒检测引物对psw7848-check-f/r及待突变基因缺失检测引物对rbsb-del-check-f/r；
所述的pcr引物序列如下：
rbsb-up-f：aagcttgatatcgaattcgtcactgattgcactgttatttttg
rbsb-up-r：tttacctgacgttctagtcctttgtgtaggg
rbsb-down-f：ctagaacgtctggtaaagatgtactcatcgttggc
rbsb-down-r：ttggtaacgaatcagacgccgcttcttgtgcgctg
psw7848-f：gtctgattcgttaccaattatgacaac
psw7848-r：gaattcgatatcaagcttatcgatac
psw7848-check-f：tcactgtcccttattcgcacc
psw7848-check-r：ctgcttttgagcactacccg
rbsb-del-check-f：tgggtggtaaaggtcgcataa
rbsb-del-check-r：tcgcctggacgagggaaag
(2)提取哈维弧菌基因组为模板，基于引物对rbsb-up-f/r和rbsb-down-f/r，利用pcr技术获取996bp的上游同源臂片段up及1022bp下游同源臂片段down(seqidno.1，如图2所示)，琼脂糖电泳检测后切胶回收，回收产物-20℃保存，备用；
所述的pcr扩增体系如下：
2×primestarmaxpremix25.0μl，上游引物f(10μm)2.0μl，下游引物r(10μm)2.0μl，基因组模板(20ng/μl)2.0μl，用ddh2o补足50μl；
所述的pcr扩增程序如下：
98℃预变性30sec；98℃变性10sec，55℃5sec，72℃5sec，35个循环；72℃延伸7min。
(3)提取自杀质粒为模板，基于引物对psw7848-f/r，利用pcr技术获取长度为3309bp的质粒线性化片段(如图3所示)，琼脂糖电泳检测后切胶回收，回收产物-20℃保存，备用；
pcr扩增体系如下：
2×primestarmaxpremix25.0μl，上游引物f(10μm)2.0μl，下游引物r(10μm)2.0μl，质粒模板(1ng/μl)2.0μl，用ddh2o补足50μl；
pcr扩增程序如下：
98℃预变性30sec；98℃变性10sec，53℃15sec，72℃17sec，35个循环；72℃延伸7min。
(4)利用商品化多片段无缝克隆试剂盒将步骤(2)获得的上下游同源臂与步骤(3)获得的质粒片段进行等温组装；
(5)将等温组装液转化入大肠杆菌escherichiacoligeb802感受态细胞，基于引物对psw7848-check-f/r，利用pcr检测后获得阳性重组子psw7848-△rbsb(seqidno.2)，琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，长度为2216bp(如图4所示)；
pcr扩增体系如下：
2×premixtaqtm(dnapolymerase、buffer、dntpmixture)25.0μl，上游引物f(10μm)2.0μl，下游引物r(10μm)2.0μl，菌液模板2.0μl，用ddh2o补足50μl；
pcr扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃30sec，72℃2.5min，35个循环；72℃延伸10min。
(6)提取阳性重组质粒psw7848-△rbsb转化入大肠杆菌e.coligeb883感受态细胞，得到携带了重组子的psw7848-△rbsb-e.coligeb883，并以其作为接合供体菌；
(7)将供体菌psw7848-△rbsb-e.coligeb883划线于添加有20μg/ml氯霉素和0.3mmdap(2,6-diaminopimelicacid)的lb固体平板上，于37℃过夜培养活化；
(8)挑取(7)中活化菌体所形成的单克隆菌落，接种于添加有20μg/ml氯霉素和0.3mmdap的lb液体培养基中，37℃、200rpm培养至对数早期od600nm＝0.3～0.7；
(9)配置lbs固体平板，对受体菌哈维弧菌进行28℃下过夜培养活化；
(10)挑取(9)中活化菌体所形成的单克隆菌落，接种于添加lbs液体培养基中，28℃、200rpm培养至对数早期od600nm＝0.3～0.7；
(11)移液器移取0.5ml(10)中准备好的受体菌至1.5ml无菌离心管中，将其置于金属浴，于38℃热击处理30min后，与(8)中准备好的0.5ml供体菌混匀，于6000rpm、室温离心3min；
(12)去上清后，菌沉淀用50μllbs液体培养基重新，点种到lbs+0.3mmdap固体平板，于28℃培养过夜；
(13)用接菌环刮取过夜接合菌斑，重悬于1mllbs液体培养基中，11,000rpm、室温离心2min离心，去上清，菌体沉淀用1mllbs液体培养基重悬；
(14)11,000rpm、2min离心，去上清，菌体沉淀用0.1mllbs液体培养基重悬，并涂布在lbs+34μg/mlcm+0.2％d-glucose平板上，28℃倒置培养至克隆长出；
(15)发生第一次同源重组的接合克隆在相同平板上纯化两次；
(16)接合克隆划线至lbs+0.2％arabinose固体平板上，接合克隆发生第二次同源重组，载体离开受体菌染色体，从而离开受体菌；
(17)重组克隆在lbs+0.2％arabinose平板上纯化，同时划线至lbs+34μg/mlcm+0.2％arabinose平板上检测其是否具有cm抗性；
(18)基于引物对rbsb-del-check-f/r对阿拉伯糖抗性，氯霉素敏感性克隆进行pcr检测，获得突变株△rbsb-哈维弧菌，同时以野生株v.harveyiscs-2的dna为模板，pcr扩增进行对照，琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，野生株长度为1413bp，突变株长度为735bp(如图5所示)。
pcr扩增体系如下：
2×premixtaqtm(dnapolymerase、buffer、dntpmixture)25.0μl，上游引物f(10μm)2.0μl，下游引物r(10μm)2.0μl，菌液模板2.0μl，用ddh2o补足50μl；
pcr扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，58℃30sec，72℃1.5min，35个循环；72℃延伸10min。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。本发明的上述实施例都只能认为是对本发明的说明而不是限制。如可对受体菌哈维弧菌在35～50℃范围内热击处理10min以上，以对哈维弧菌中任何基因或者核苷酸片段进行敲除。因此凡是依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
序列表
<110>中国水产科学研究院南海水产研究所
<120>一种基于热击的哈维弧菌同源重组基因敲除的方法
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>2696
<212>dna
<213>核糖体结合蛋白(rbsb)
<400>1
gtcactgattgcactgttatttttgattgttgtcgtgtcatttttgaacccgaacttttt60
tacggtagacaacattcttaatatccttcgtcaaacctcagttaacgcaatcatcgcggt120
aggtatgacgttggttatcctgaccgcaggcatcgacctaagcgtaggttctgtactcgc180
actatgtggtgcgtttgccgcgagcatgattgcattagaagtgcctgtgcttatcgcagt240
tccgactgcattgttcgctggtgcggctttgggggcgatcagcggtatcatcattgccaa300
aggtaaggttcaagcctttatcgcaacactggttaccatgacgttactacgcggcgtgac360
gatggtttacaccgacggtcgtcctatctctacgggctttactgacacagcagatgcatt420
tgcatggtttggtacaggttacgcacttggtatcccggttccagtttggttgatggtgat480
tgtctttgcggcagcttggtacctactgaaccacactcgttttggtcgctacgtgtacgc540
acttggtggcaacgaatcagcaacgcgcctttctggtatcaacgttgaccgtgtgaaaat600
tggtgtatacgccatctgcggcatgttggcagcgcttgctggcattatcgtgacgtctcg660
tctgtcttcggcacaaccaacagcgggtatgggctacgagctagacgctatcgcagcggt720
tgttcttggcggtaccagcttgatgggtggtaaaggtcgcataatgggaacattgattgg780
tgctctaatcatcggcttcctaaacaacgcgctgaacctactcgatgtttcttcttacta840
ccaaatgattgcgaaagcagtggttatcttgctagcagtactggtagacaacaaaaacaa900
gtaattgatatttaaaataaagagctccattacatcctgaatacaaaccgagccagagga960
cgtgtgctggctcaccctacacaaaggactagaacgatgaaaaaactcgcaactcttatc1020
tctgctgcacttctttcttcaaccgtatcggtagcggcgcacgctcaagatacaatggcg1080
attgtagtttctacattgaataacccgttcttcgtaacgatgaaagacggtgcagaagcg1140
aaagcgaaagaactgggatacgacttgattgtactggactcgcaaaatgacccgagtaaa1200
gaactgtcaaacatcgaagacctaacgattcgtggcgtaaaagcgattctgattaaccca1260
acagattcagacgctgtgtcaaacgcaattcgtatggcgaaccgttctaagatccctgtg1320
ttgacactagaccgtggtgcaagccgtggtgacgtagtgagccacatcgcttctgacaac1380
gtagttggtggcgaaatggctggtcactacatcatggaaaaagtaggtgagaaagcgaaa1440
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atgacagcagtgaagggcagcaacatggagctactagcaagccaacctgctgattttgac1560
cgtactaaaggtctgaacgtaatggaaaacttgcttgcagcgaaccctgacgttcaagca1620
gtatttgctcagaacgatgagatggcactgggtgcgcttcgcgcagttcaagcgtctggt1680
aaagatgtactcatcgttggcttcgacggcactgacgacggcattgcagcagttaaccgt1740
ggcaagctagcagcaactatcgcgcagcagccagatcttattggtgctttgggtgtagaa1800
acggccgacaaagtattgaaaggtgagaaggttgaggagtacattcctgttccgcttaaa1860
gtcgtgactaagtaagtttaactcccaactcagtgattcttctttgttgaagataatgga1920
atgacccaatgaatgtgttgggtcattccaaacaacaaaaatggtacgttagaaaactga1980
atctatttgaatcgtaatacgcttacgttttttcaaagagcgtaaacctattactcctgt2040
tcaaatataaagggttcattcagaaccgaggataaccgtatgaataagttagtggtgtta2100
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gcggaagtactaacaggtgtgacggtaacggacgatgacagcgcacaagaagcggc2696
<210>2
<211>5327
<212>dna
<213>核糖体结合蛋白(rbsb)
<400>2
caattgatatcgcgcgcgtaatacgactcactatagggcgaattgggtaccagcgctttt60
ccgctgcataaccctgcttcggggtcattatagcgattttttcggtatatccatcctttt120
tcgcacgatatacaggattttgccaaagggttcgtgtagactttccttggtgtatccaac180
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