核酸质粒药物制备中用于大肠杆菌碱裂解的搅拌、冷却和加压过滤三合一反应罐的制作方法

本实用新型涉及生物制药领域治疗性核酸疫苗或核酸制剂,即质粒pDNA规模化制备中第一个加工步骤，即基因工程大肠杆菌的碱裂解搅拌、裂解液冷却和过滤澄清过程所用的装置，具体是涉及一种核酸质粒药物制备中用于大肠杆菌碱裂解的搅拌、冷却和加压过滤的三合一反应罐。

背景技术：

治疗性质粒核酸（pDNA）疫苗或称治疗性核酸制剂，是目前正在开发的可用于治疗结核病、艾滋病，多种肿瘤等慢性疾病的一类制剂。近年的大量研究显示，尤其是对各种肿瘤的治疗具有十分光明的前景，已有十多种制剂被世界各国批准进入一、二、三期临床试验阶段。

发酵罐培养并富集的基因工程大肠杆菌中，质粒含量仅占菌体的0.5-3‰。需要通过依次加入溶液中的NaOH、EDTA、SDS、KAC等破坏细胞膜释放菌体内容物，同时促使细菌染色体、蛋白质、细胞壁和脂肪等杂质变性和盐析形成不可溶复合物而凝聚经粗滤去除； 再精滤后经过多步中压液相层析逐步去除残留的其它杂质，才能获得药物级的纯化质粒核酸。

目前碱裂解法是采用最广泛的简便有效可逐级放大的细菌破裂方法。其基本步骤是将离心收集的大肠杆菌用P1液（50mM Tris+10mM EDTA,pH 7.2）在适当的桶中重悬浮并搅拌均匀，加入等量碱性P2液（含0.1%SDS和0.2%NaOH混合液）搅拌数分钟后静置数分钟裂解细菌，此时桶中液体呈均匀的粘稠浅灰色胶状液，再加入等量预冷至4-10℃的P3液（用冰醋酸调节pH至5.5的3M乙酸钾液）搅拌，中和掉P2液的碱性。搅拌中在所加物质的共同作用下，使细菌染色体、细胞壁，蛋白质、内毒素等大量杂质凝聚成豆花状白色絮状物，然后放置在冰水浴中冷却1-2小时尽量让上述杂质更充分地凝聚出来以便过滤去除。由于P1、P2和P3液以1:1:1体积比（各8-20ml体积，各试验室用量有所不同但效果差不多，大量制备时以较小体积为宜）依次混合后其中的乙酸钾最终浓度为1M，其密度高使杂质凝聚物大部分漂浮在液体上层，仅有一小部分漂浮在下层。通常用300-350目（约40-50μm孔径）的过滤布或不锈钢筛网垫在大口径布氏漏斗中抽气垂直过滤（粗滤）去除，得到主要含质粒、细菌RNA和内毒素的澄清裂解液。抽气过滤的抽吸力不大（最高一个大气压），布氏漏斗口径通常也不够大，导致豆花状凝聚物很快堵塞滤布或筛网过滤小孔，滤速越来越慢，需要及时多次更换滤布。并收集留在滤布上的粘稠凝聚物，其中仍含有约20-30%的裂解液（含所需要的质粒）不能被挤出回收。采用加压过滤可加快过滤速度，并压出粘稠凝聚物中的裂解液增加回收，但需要另采用商品化的加压过滤罐。小量制备时，裂解过程的搅拌、冰水冷却和过滤分别采用3-4个普通的大口径玻璃、或塑料、或不锈钢桶或容器，和家用汤勺搅拌，各步进行人工操作即可。但大规模制备符合生物制药规范要求的质粒核酸时，应尽量减少人工操作的干预，最好采用半机械化设备。

技术实现要素：

本实用新型的目的是提供一种可将现有技术在质粒核酸制备中上述细菌悬液的搅拌、碱裂解、中和与冰水冷却及加压过滤合并在同一个反应罐中完成的专用三合一反应罐，即一种核酸质粒药物制备中用于大肠杆菌碱裂解的搅拌、冷却和加压过滤三合一反应罐。。

实现上述目的的技术方案是：提供一种核酸质粒药物制备中对大肠杆菌碱裂解过程进行搅拌、冷却和加压过滤的三合一反应罐，该反应罐包括用玻璃、硬质塑料或不锈钢材料制作的罐体、可密封的搅拌器、输入加压空气接头、压力表、过滤组件、阀门、冰水进出循环管道和与之相连的接头，其中，罐体由中部双层罐筒、上盖和下盖三大部件构成，这里，

中部双层罐筒包括内圆筒、套在内圆筒外的外圆筒、在表面上各设有二个圆形沟槽的上法兰盘和下法兰盘，其中，内圆筒和外圆筒上下两端分别通过粘接或焊接固定在上法兰盘和下法兰盘中设置的直径相合的圆形沟槽内，并在内圆筒和外圆筒的筒壁之间形成容纳冰水循环流动的夹套空间，从而形成中部双层罐筒，所述上法兰盘和下法兰盘的边缘平板中钻有几个安装紧固螺杆的垂直穿通安装孔，并且分别在其一侧边缘平板中设有冰水进入或流出的孔道与所述筒壁之间的夹套空间连通，从而形成冰水循环通路；

上盖为一平板，或者为中部弧形上拱而边缘平坦的板，其中央设有安装搅拌器的中心孔、其表面设有安装输入加压空气接头的第一开口、安装压力表的第二开口和安装密封堵头或盖头供液体进入的第三开口，此外，在其边缘的下表面上则设有安放密封垫圈的沟槽；

下盖的上部具有垂直下凹成圆槽的平盘，中间呈漏斗状的漏斗部, 漏斗部下端中央开有出液口，该出液口下固定带外螺纹的圆筒接管，圆筒接管可用带互配的内螺纹和密封圈的外盖帽密封，或以螺接方式直接连接于阀门；

过滤组件自上而下包括密封垫圈、组合式过滤布和不锈钢丝过滤垫和不锈钢冲孔支撑网板，安置在下盖上部的垂直下凹圆槽内，并处于下盖和中部双层罐筒的下法兰盘之间，因此，过滤组件以上的罐体内圆筒空间成为搅拌室；

搅拌器由转动装置、轴棍、套在轴棍上部的滚珠轴承和轴棍下部的可沿搅拌轴棍上下滑动的搅拌浆叶组成，搅拌器安置在上盖中央，轴棍和搅拌浆叶伸入中部双层罐筒搅拌室内；

所述上盖、中部双层罐筒的上下法兰盘和下盖通过它们边缘平板中设置的垂直安装孔用紧固螺杆和密封垫圈固定在一起，使过滤组件夹紧在中部双层罐筒和下盖之间。

如以上所述的三合一反应罐，其特征在于所述搅拌器的转动装置是可拆卸的手摇柄，通过将其安放在搅拌器轴棍顶端，用手旋转该手摇柄带动浆叶进行搅拌，完成搅拌后可取去手摇柄。

如以上所述的三合一反应罐，其特征在于所述搅拌器的转动装置也可以是慢速电动机，其密封安装在上盖的中央并与搅拌轴棍连接固定。

如以上所述的三合一反应罐，其特征在于所述不锈钢丝过滤垫和过滤布组成的过滤层的滤孔孔径优选300-350目。

如以上所述的三合一反应罐，其特征在于所述上盖中的第一开口、第二开口和第三开口的位置优选布置成间隔120度转角分布。

本实用新型的三合一反应罐，可使上述细菌悬液的搅拌、碱裂解、中和与冰水冷却及加压过滤由分别在几个反应罐（或桶）中进行合并在同一个反应罐中完成，也即将原先需要使用几个反应罐（或桶）减少至一个专用罐，并实现了半机械化操作。罐体积可视生产规模扩大的需要逐级线性放大，从而减轻了劳动强度，缩短了生产时间，提高了质粒回收和劳动效率。

附图说明

图1 是三合一反应罐的结构剖视简图，其中上盖上的第一开口、第二开口和第三开口以不同角度都移入可剖视的范围内；

图2 是上盖的主视图；

图3 是图2的上盖以A-O-B线所作的剖面视图，为不同于图1平板上盖的中部弧形上拱边缘平坦的上盖，其上方为与搅拌器轴顶端相配的、可拆卸的方孔套筒（机床）手摇柄；

图4 是三合一反应罐的中部双层罐筒未装配时的各部件的剖面图；

图5是过滤组件的立体视图；

图6 是下盖的立体视图；

图7是图4的中部双层罐筒上法兰盘的CD剖视图，其中央为圆孔，圆孔外侧为八角形边缘平板，所示二个虚线圆圈为安置内圆筒和外圆筒的沟槽，左侧有水平的冰水进入孔和外配接头，四角的四个垂直穿通小孔为紧固螺杆安装孔。下法兰盘的上视剖面简图与此相似，仅冰水流出孔位于右侧。

具体实施方式

参阅图1至图6，核酸质粒药物制备中用于大肠杆菌碱裂解的搅拌、冷却和加压过滤三合一反应罐。该反应罐包括罐体1、可密封的搅拌器2、过滤组件3、加压空气输入接头4、压力表5、阀门6、冰水进出口接头7。其中，罐体1由中部双层罐筒11、上盖12和下盖13三大部件构成，这里，

中部双层罐筒11包括内圆筒111和套装在其外面的外圆筒112、及将此二圆筒上下两端固定并封堵使二者筒壁之间形成间隙空间115的上法兰盘113和下法兰盘114。以制作八角形的上法兰盘和下法兰盘为例，它们的中央部分为安置内圆筒而被加工切除成中空圆孔，剩下外周平板，所述上法兰盘113和下法兰盘114的外缘各设有几个位置相对应的垂直穿通的安装孔，以安置固定螺杆；一侧外壁上还分别设有一个水平的冰水进出孔道1131或1141，与所述间隙空间115连通。于是在内圆筒和外圆筒之间的间隙空间115为冰水循环流动的水套式夹层。在具体制作中，中部双层罐筒11的上法兰盘113和下法兰盘114采用厚度1.5-3.0cm相等的材料制作。具体地说，对于高度不等的内圆筒和外圆筒，上法兰盘113中空圆孔的外周平板下面和下法兰盘114 中空圆孔的外周平板上面各开有相距2-5cm的二个直径相同的圆形沟槽1132、1133和1142、1143，分别安置并固定（粘接或焊接）内圆筒111和外圆筒112，再外侧为平板边缘，相应位置开有穿通的安装孔，用于安放紧固螺杆116。内圆筒和外圆筒的壁厚各为4-10mm，内圆筒因要承受较高压力，壁厚大于外圆筒2-5mm。内圆筒直径（不算壁厚）30-150cm，外圆筒直径（不算壁厚）比内圆筒大4-10cm，二者安置后间隔2-5cm，冰水可在夹层的间隙空间115中流动。内圆筒的高度为其直径的60-70%，外圆筒高度比内圆筒低1-4cm（即上下端各短0.5-2cm），目的是安置成双层夹套罐体后，在上法兰盘113和下法兰盘114使用的平板水平厚度（1.5-3cm）中留出冰水进出孔道位置。上法兰盘平板一侧边的厚度中，比固定的外圆筒上边沿略高2-4mm处，平行钻一个冰水进入孔道1131，接近固定的内圆筒外壁时孔道改为垂直向下进入双筒之间的夹层，孔径0.5-1.5cm。同样，在下法兰盘平板对侧边的厚度中，比固定的外圆筒上边沿略低2-4mm处，平行钻一个冰水流出孔道1141，钻到接近固定的内圆筒外壁时孔道改为垂直向上进入双筒之间的夹层，孔径0.5-1.5 cm。上法兰盘113和下法兰盘114平板位置相对（180度）的冰水进出孔道外面分别固定有孔径相合的冰水进出口接头7，可通过塑胶管连接外置的水泵和冰水池，使冰水在内圆筒和外圆筒之间的夹层115中从上向下循环流动，冷却罐内液体。上法兰盘、内圆筒、外圆筒与下法兰盘装配成中部双层罐筒，以及冰水进出口接头安装时视所用材质，采用粘结或焊结工艺。

上盖12为厚1.2-3cm的平板，或者为中部弧形上拱而边缘平坦的板，无论采用平板或拱形板，其上设置有中心孔121、安装输入加压空气接头4的第一开口123、安装压力表5的第二开口122和用于进液的第三开口124。上盖12周边平坦的下表面边缘经加工开有安置密封垫圈的圆形密封垫圈槽125，槽宽1.0-2.0cm深2-8mm，可容纳相合宽度和厚度的密封垫圈。密封垫圈槽125的外沿直径相当于中部双层罐筒的外圆筒112的外径，再向外为含紧固螺杆116钻孔的平板边缘。上盖12中央钻有穿通孔121以容纳下面所述的搅拌器2，该穿通孔121孔上部1/2厚度处的孔径较大，以安置滚珠轴承；下部1/2厚度的孔径较小刚好容纳搅拌器轴棍22穿入将搅拌浆叶置于中部双层罐筒内。

搅拌器2由转动装置21、轴棍22、套在轴棍上端的滚珠轴承、和通过一个小套管套在轴棍下部可沿轴棍上下滑动的搅拌浆叶23组成。转动装置21可以是可拆卸的含内正方孔的套筒摇手柄21-1（用于小、中型罐），或是可密封固定的慢速电动机（大型罐）。轴棍22的顶端为高出滚珠轴承上平面2-3cm的正方形头，与摇手柄21-1的方孔套筒相合；滚珠轴承外周的上盖表面固定有一个直径相合壁厚2-4mm上部有外螺纹的圆筒，筒高4-8cm，可容纳摇手柄套入或取出，配以尺寸相合含内螺纹和密封圈的外盖帽，取出摇手柄后可用此外盖帽旋紧密封。在一个实施例中，搅拌时将手摇柄安置在轴棍顶端，手摇带动浆叶旋转搅拌；加压过滤时拿掉手摇柄，在圆筒上端旋紧相配的外盖帽使之密封。在另一个实施例中，大型反应罐上盖中央顶部可安置密封的慢速电动机（图中未画出）来转动搅拌浆叶不用手摇。

制作上盖时，三个贯穿上盖的第一开口、第二开口和第三开口位于上盖12密封垫圈槽125内沿向内3-8cm的不同位置，优选布置成间隔120度转角分布：其中，第一开口123为进气孔，其外接的接头4可通过导管连接空气压缩机；第二开口122安置固定的压力表5；第三开口为进液口124，孔径较大3-10cm，用于注入P1、P2和P3液。第三开口（进液口）可套内螺纹，配以相合外螺纹的带密封圈堵头；或在该开口平板上表面设有一个内径相同筒高4-6cm壁厚2-6mm有外螺纹的圆管1241作为进液口，并配以带相合内螺纹和密封圈的外盖帽；从而在加压过滤时，可通过旋紧密封堵头或外盖帽而密封该进液口124。搅拌器安置圆筒、压力表的固定安装、进气孔连通的接头4和进液口圆筒的固定安装，视所用材质可采用粘结或焊结工艺。

下盖13呈浅漏斗状；上端为平盘形，中间呈漏斗状, 漏斗下端中央开一个内径3-8cm的出液口，其下固定有内径相同壁厚2-4mm高4-8cm有外螺纹的圆筒接管131，配以带相合内螺纹和密封圈的外盖帽，或直接连接带相合内螺纹接头的阀门6，如球阀或其他闸阀。在一个实施例中，下盖13漏斗整体高4-10cm，中部先垂直下凹成圆槽，用于安置重叠的过滤组件3 。下凹圆槽的直径相当于中部双层罐筒11的外圆筒外径，深度4-10mm，比过滤组件3叠加的厚度略小0.3-0.5mm。使用时，当加入菌液搅拌使之均匀悬浮和加入P1、P2液裂解细菌时，先旋紧漏斗底部出液口的外盖帽或关闭阀门，罐中液体不会流出。加压过滤时则打开此出液口使经过过滤的澄清裂解液流出，或通过连接阀门的管道和水泵输送到下一步精滤处理装置（如0.22/0.45μm柱式滤器）中。圆筒接管131与出液口的连接固定视所用材质，采用粘结或焊结工艺。

过滤组件3自上而下包括：圆环形密封垫圈31、圆形组合式过滤布和不锈钢丝过滤垫32和厚2-4mm的不锈钢冲孔支撑网板33，它们的外径与下盖的下凹圆槽内径相合，正好紧密安置在下盖的下凹圆槽内，处于中部双层罐筒11下法兰盘下表面与和下盖13外缘上表面之间。在过滤组件3中，所述过滤布和不锈钢丝过滤垫32的滤孔孔径为200-350目，优选300-350目；所述圆环形密封垫圈宽1.0-2.0cm厚2-8mm。

所述上盖12、中部双层罐筒11和下盖13通过其上设置的安装孔用紧固螺杆116紧固在一起时，过滤组件3夹紧在中部双层罐筒11和下盖13之间，其上方内圆筒空间是为搅拌室；下方漏斗状空间为滤过的澄清裂解液收集流通室。

紧固螺杆116采用304不锈钢，粗1.0-2.5cm，两头各有长度8-14cm的螺纹，每根配以尺寸相合的四个上下螺帽（六角或蝶形螺帽）和垫圈，无螺纹的杆中部长度比罐体高度短2-4cm。一个反应罐配4-6根紧固螺杆和相应的螺帽。

制作本反应罐时，市场销售的塑料或不锈钢平板都为大长方形，须先切割成正方形，再切去四个角成八角形的上盖、上下法兰盘和下盖四块平板。在钻床上制作紧固螺杆孔时，将这四块平板重叠对整齐后压紧，在划线选定角度和位置的上盖平板边缘，上法兰盘、下法兰盘二平板边缘和下盖平板边缘的中央，从上向下钻通形成四块平板的螺杆孔道。螺杆孔的内侧边沿与外圆筒边沿的距离至少大于6mm，留出安置螺帽的空间（见图1-2）。

本实用新型反应罐各部件的材质可采用透明的强化玻璃、有机玻璃（亚克力）、不透明的玻璃钢（FRP）、硬质塑料(如聚丙烯、特氟隆、高密度聚乙烯等)或304不锈钢、或铜材质。该反应罐的上盖、中部双层罐筒的上下法兰盘、和下盖三大部件外形可以是尺寸相同的圆形，或四角形，五角形、六角形、八角形等，优选节省材料的不等边八角形（见图2和图6）。三大部件所用材质可相同或不同，如中部罐体的内圆筒和外圆筒用透明的有机玻璃，其他部件用硬塑料或不锈钢。

本实用新型的技术方案在核酸质粒药物制备时实施大肠杆菌碱裂解中的应用：

准备工作：先取上端已固定好滚珠轴承仅露出正方形顶端的搅拌器轴，插入本反应罐上盖的中央孔，安置固定好滚珠轴承，搅拌器轴下端套入连有浆叶的套筒，调节到高低适当的位置后，旋紧套筒上的固定螺丝固定好浆叶。将叠放好的过滤组件3放入下盖的圆形凹槽中。

反应罐安装：将固定好搅拌器的上盖加密封垫圈、中部双层罐筒、安置好过滤组件3的下盖，用四根紧固螺杆从上到下串通连接，旋紧各螺帽固定紧密，关闭下盖出液口，打开上盖的进液口，并将手摇柄安置到上盖中央搅拌器方头上（装有固定的密封电动搅拌机此步省略）。

搅拌、冷却和密封加压过滤：通过输液泵和导管从进液口依次加入P1细菌悬浮液、P2液和P3液，同时通过手摇柄各搅拌2-8分钟，30-60转/分。然后静置并通过水泵和冰水进出入孔道向内圆筒和外圆筒间隙注入冰水循环冷却1-2小时。取掉上盖的手摇柄，在搅拌器口和进液口加盖密封盖密封，将进气导管连接空气压缩机，打开下部出液口，输入加压空气进行加压过滤。遇到的问题是依次加入的液体会不会通过下盖过滤层的筛孔进入下方的漏斗状空间而造成紊乱，我们的巧妙解决方法是，关闭下盖的出液口加入P1悬浮菌液并搅拌前，先加入密度高于P1液许多的1.0-1.2M乙酸钾液使之充满该空间。这样由于过滤层的孔很细小加上高密度乙酸钾液的阻挡，依次加入的P1液悬浮菌液、P2液搅拌形成的胶状粘稠裂解液和加入P3液形成的最终混合液密度均小于或最高仅相当于1.0M乙酸钾液，因而不会进入该空间。开始加压过滤时预先加入的那些1.0-1.2M M乙酸钾液大部先流出，单独收集之；后流出的小部分乙酸钾液即使与经过滤的澄清裂解液混合，二者成分基本相同对后续纯化也无影响。大部分裂解液无需多大压力即可快速滤过，随着凝聚物在滤布上的聚集，滤速减慢，可通过加大空气压缩机的输入气压，使罐内压力越来越大而保持滤速并挤压出凝聚物中的裂解液；滤布上沉积的凝聚物最后被挤压成豆腐状簿圆饼。

此反应罐为大直径扁平罐，目的是使垂直过滤的面积尽量大，每次处理的液体总量通常不超过罐体内空间的50-60%，这是根据实际经验而定。因为密封加压过滤，虽然加快了过滤速度省时，但不能更换滤布，需一次完成过滤。采用过滤面积大的扁平罐和控制待过滤液的体积即可达到此目的。由于过滤时不是完全密封，下部有出液口外通，所加气压不可能很高，通过观察上盖的压力表同时控制出液口阀门，可使塑料或有机玻璃制作罐体的压力保持在0.1-0.4MPa ,不锈钢罐体保持在0.4-1MPa之间(1MPa大约相当于10个大气压，或10kg/cm²压力)。完成加压过滤后，旋松下盖紧固螺杆的螺帽打开下盖，取出过滤层，丢弃滤布和压紧的凝聚物，清洗筛网板，然后更换新滤布重装过滤组件，再重装反应罐作下一步使用。

制作大小不同罐体所需平板的尺寸和罐体容量及可处理菌量的举例说明

注 *外圆筒外径=（内圆筒内半径+壁厚+内外圆筒间距+外圆筒壁厚）x 2

**正方平板边长=外圆筒外径+安置紧固螺杆孔的外缘平板宽度（至少0.6cm x 2=1.2cm）

***可装入的裂解液量=罐体内空间体积的50-60%

实验室常用的5 L发酵罐每次可培养约4 L大肠杆菌，产菌280-320g，用上表中的小罐正好一次处理。50L中试发酵罐每次可培养35-40 L大肠杆菌，产菌2400-3000g，适合用上表中的中罐处理二次。100L生产发酵罐每次可培养70-80 L大肠杆菌，产菌5000-6400g，二次发酵所得菌用上表中的大罐处理一次即可。