本发明涉及植物病理学领域，具体地，本发明涉及磷酸二酯酶EdpX1用于降低细菌致病性的应用。
背景技术：
水稻白叶枯病是水稻生产中的重要细菌性病害，由水稻白叶枯病菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)引起。每年在各稻产区都有一定面积的发生，一般造成减产10-20％，严重时可减产50-60％。目前主要使用化学杀菌剂进行病害的防治。然而，杀菌剂的使用对细菌存活带来很大的选择性压力，容易诱导产生耐药性。同时，杀菌剂的大量使用也造成了水和土壤的污染，进一步增加了耐药细菌环境中抗药微生物的产生。因此，为保证水稻的安全生产，亟需发展出更高效的、且环境友好的抑菌剂。以细菌的毒性因子为靶标，筛选获得小分子化合物抑制剂被认为是合理的替代途径。
研究表明在水稻白叶枯病菌中存在多种毒性因子，包括粘附素、胞外酶、胞外多糖、生物膜等，在侵染的不同阶段发挥作用。此外，细菌的III型分泌系统，可以分泌效应因子至寄主细胞中，它们可以诱导或者抑制寄主的免疫反应。通常，III型分泌系统及其效应因子决定了水稻白叶枯病菌对不同水稻品种的致病性。已有实验证据表明，以III型分泌系统为靶标的小分子化合物抑制剂在实验室条件下可以降低水稻白叶枯病菌的致病性。然而，目前以III型分泌系统为靶标的筛选途径还很有限，需要发展更多适合做高通量筛选的靶标。
C-di-GMP是广泛存在于各类细菌中的小分子第二信使，通过与受体的结合调控细菌运动性、生物膜形成、胞间信号、细胞周期等诸多方面的功能。二鸟苷酸合成酶(diguanylate cyclase,DGC)和磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)分别控制c-di-GMP的合成和降解。通常，高浓度c-di-GMP促进生物膜的生成，同时抑制细菌的运动性和毒性，而低浓度c-di-GMP促进细菌中毒性因子的表达。已有报道发现干扰二鸟苷酸合成酶活性的小分子化合物，可以抑制铜绿假单胞菌的生物膜形成能力。说明c-di-GMP代谢酶可以作为毒性抑制剂筛选的靶标。
技术实现要素：
本发明的目的是研究酸磷酸二酯酶EdpX1降解第二信使环二鸟苷酸(c-di-GMP)的应用。
本发明的另一目的是提供上述酶在筛选抑制剂方面的应用。
本发明从水稻白叶枯病菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)中获得磷酸二酯酶EdpX1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：
MLTGPRNVLINPDTLADINIPPGLQLAIGTPDGQLLSSTGTAAEQLLIEPSDERAPDDRVLSQVLFGRDRRGEWTAVVTEPVAYLRGPLAAARLQLVPVGIAVALLLVGAVLWVSRRRLSPLARPEIAVQRGEFIVHYQPIIALDSGACVGAEALVRWQQPDGVLVPPDAFIPLAEESGLILPITDLVVAEVIRELGPTLAADPALHVAINVSAEDIKSSRVQSVLEHALRGTGVDSGQLWVEATERSLMDIDAARTTIMRLRGAGHTVSIDDFGTGYSSLQYLQGLPLDALKIDKSFVDTIGTHSATSAVSAHIIEMAKTLRLRTIAEGVERQEQLDYLRAHGVDLAQGWLFSRALPATGFIAYHAQARSTAH
其中，该酶包括374个氨基酸，理论分子量为40kDa，在中性pH范围内具有较高的活性。
磷酸二酯酶EdpX1的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.2：
GTGTTAACAGGCCCTAGGAACGTCCTGATCAACCCCGACACGCTGGCCGACATCAATATTCCCCCCGGCCTGCAACTTGCGATCGGTACGCCGGACGGGCAGCTTCTCAGCAGCACCGGCACCGCCGCCGAACAGTTGCTGATCGAACCCAGCGACGAACGCGCGCCGGACGACCGCGTGCTGTCGCAGGTGTTGTTCGGACGCGACCGCCGTGGCGAATGGACGGCGGTGGTCACCGAGCCGGTGGCCTACCTGCGGGGTCCGCTGGCGGCGGCACGGTTACAACTGGTGCCGGTGGGCATCGCGGTGGCGCTGCTGCTGGTCGGTGCGGTGCTATGGGTGTCGCGGCGGCGGTTGTCGCCACTGGCGCGGCCGGAAATTGCAGTGCAACGCGGCGAGTTCATCGTTCACTATCAACCGATCATTGCACTCGACAGCGGCGCCTGCGTCGGCGCCGAAGCGCTGGTGCGCTGGCAGCAACCCGACGGCGTATTGGTCCCGCCGGATGCCTTCATTCCGCTGGCCGAAGAAAGCGGCTTGATCCTGCCGATCACCGATCTGGTGGTGGCCGAAGTCATTCGCGAACTCGGCCCCACCCTGGCTGCCGACCCGGCGCTGCACGTGGCCATCAATGTCTCCGCCGAAGACATCAAAAGCAGCCGGGTGCAGAGCGTACTGGAGCATGCGTTGCGTGGCACCGGCGTGGACAGCGGCCAGCTGTGGGTGGAGGCGACCGAACGCAGCTTGATGGACATTGACGCGGCGCGTACCACCATCATGCGTCTGCGTGGCGCCGGCCACACGGTGTCGATCGACGACTTCGGTACCGGCTATTCGAGCCTGCAGTATCTGCAAGGCCTGCCGCTGGACGCGTTGAAGATCGACAAGTCGTTCGTAGATACCATCGGCACCCACTCGGCCACCAGCGCGGTGAGCGCGCACATCATCGAGATGGCAAAAACGCTGCGGCTGCGCACCATTGCCGAAGGCGTCGAGCGGCAGGAACAGCTCGATTATCTACGCGCCCATGGCGTGGACCTGGCGCAAGGCTGGCTGTTCTCGCGCGCGTTGCCGGCCACCGGTTTCATCGCCTACCACGCACAGGCGCGCAGCACGGCGCATTGA
本发明首次发现Xanthomonas细菌中EdpX1能够降解c-di-GMP，并通过体外蛋白活性测定和检测体内c-di-GMP含量证明了EdpX1的磷酸二酯酶活性。
根据本发明的具体实施方式，提供了全长蛋白的表达菌株。通过PCR的方法分离克隆了这一PDE酶基因edpX1,全长1125bp。利用pCold-SUMO构建全长蛋白表达载体pCedpX1，转入表达菌株BL21中，获得EdpX1-His6融合蛋白表达菌株。对蛋白进行表达纯化，并通过比色法检测EdpX1具有磷酸酶活性。
根据本发明的具体实施方式，研究了edpX1基因功能缺失突变体ΔedpX1及其互补菌株ΔedpX1(pB-edpX1)体内的c-di-GMP含量，与野生型相比，突变体体内c-di-GMP含量显著性升高，说明在缺失EdpX1情况下，细菌不能正常降解第二信使c-di-GMP。
根据本发明的具体实施方式，研究了突变体ΔedpX1对细菌的致病性、胞外多糖(EPS)产生、生物膜形成和III型分泌系统等的功能有显著性影响。检测到突变体ΔedpX1导致细菌的致病性显著性减弱，突变体ΔedpX1导致细菌的胞外多糖产生量(EPS production)显著性降低；检测到突变体ΔedpX1导致细菌的生物膜形成能力(Biofilm formation)显著性降低；本发明首次发现PDE酶对III型分泌系统的影响，可以利用这一作用筛选小分子抑制剂，突变体ΔedpX1导致细菌的III型分泌系统的功能显著性减弱，并通过检测在烟草上的过敏性坏死反应(HR)、在水稻上的水渍实验(water soaking)和转导实验(translocation)证明。
本发明还提供了EdpX1在筛选抑制剂方面的应用。根据本发明的技术方案，由于EdpX1能够降解c-di-GMP，还可调节III型分泌系统的功能，可以将其作为小分子抑制剂靶标，筛选出可以抑制EdpX1活性的抑制剂。
附图说明
图1比色法测定EdpX1的磷酸酶活性。
图2细胞内c-di-GMP含量。
图3突变体菌株致病性测定。
图4突变体菌株EPS产生量测定。
图5突变体菌株生物膜形成能力测定。
图6突变体菌株对细菌III型分泌系统的影响。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、大肠杆菌表达载体pCold-SUMO购于哈尔滨海基生物公司，构建突变体选用自杀载体pK18mobSacB{Schafer,1994#2245}，菌株Escherichia coli BL21(DE3)购自于天根科技有限公司，野生型Xanthomonas oryzae pv.oryzae PXO99A(水稻白叶枯病菌)。
2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自全式金生物技术有限公司，质粒提取和凝胶回收试剂盒购于填个科技有限公司，c-di-GMP(BIOLOG Life Science Institute)，蛋白纯化His标签蛋白纯化树脂(Ni-NTA Resin)填料购自哈尔滨海基生物公司，GMP、GTP、ATP、DTT、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside，IPTG)和抗生素等化学试剂(Sigma)，其它试剂均为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基：
(1)LB培养基(g/L)：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0，pH7.0。PSA培养基(g/L)
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1EdpX1编码基因的克隆和蛋白活性测定
以PXO99A基因组为模板，PC03877F、PC03877R为引物扩增edpX1基因全长与pMD18-T相连，测序鉴定。分别用BamH I和Sal I双酶切回收edpX1全长片段，利用T4DNA连接酶，与同样双酶切处理的pCold-SUMO载体相连，转化E.coli感受态细胞DH5α，获得质粒pCedpX1。将获得的质粒转入E.coli感受态BL21(DE3)菌株中，最终获得EdpX1-His6融合蛋白的表达菌株。
表1引物
将目的蛋白的表达菌株在含Amp抗性的LB平板上划线活化，挑取单菌落于试管中37℃过夜培养，第二天以1:100比例，将过夜培养物接种至含Amp的大量LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.6，加IPTG终浓度至0.1mM，15℃，100rpm震荡24h诱导蛋白表达。离心收集菌体。
纯化包涵体蛋白，采用比色法检测目的蛋白的磷酸二酯酶活性，在反应buffer(50mM Tris-HCl,1mM MnCl2,pH 8.5)中加入5mM的bis(p-nitrophenyl)phosphate substrate与20μg的目的蛋白，37℃孵育2h，紫外分光光度计410nm处的吸光值，检测降解底物，采用相同含量的BSA作对照。与阴性对照BSA相比，EdpX1有明显的颜色变化，说明EdpX1具有磷酸酶活性(图1)。
实施例2c-di-GMP的体内提取和测定
28℃条件下，在M210培养基中培养野生型和突变体菌株，1:100转接至200mL新鲜培养基中，待OD600＝2.5，离心收集菌体8,000rpm 8min，去除上清，将沉淀重悬于冰的提取液中(40％甲醇，40％乙腈，0.1N乙酸，提取液置于4℃可保存7天)。重悬液置于-20℃过夜后，置于冰上破碎1min，最高转速离心20min，上清转移至干净离心管中，冷冻干燥后加水重悬，LC-MS/MS检测c-di-GMP含量(图2)。与野生型相比，在ΔedpX1突变体中，c-di-GMP的含量显著性升高，而在互补菌株ΔedpX1(pB-edpX1)中，c-di-GMP含量恢复至野生型水平。说明在缺失edpX1基因时，细菌不能正常降解c-di-GMP。
实施例3edpX1基因功能测定
1.致病性检测
将待测菌株从-80℃中取出，在含相应抗生素的PSA平板上活化，挑取单菌落接种于M210培养基28℃震荡培养2d，以1:100比例转接新鲜M210中震荡培养，待OD600为0.6～1.0时，用2mL EP管4,000rpm，3～5min收集菌体，用等体积的ddH2O重悬菌体，而后用剪叶法将待测菌株接种至日本晴水稻叶片，剪刀使用前要灭菌，将温室环境控制在25～30℃，湿度达90％左右，接种14d后观察Xoo发病情况，测量病斑长度(图3)。与野生型相比，ΔedpX1的致病性显著性降低，而互补菌株ΔedpX1(pB-edpX1)的致病性部分恢复，说明EdpX1正调控了Xoo在水稻上的致病性。
2.胞外多糖测定
将待测PXO99A、ΔedpX1和ΔedpX1(pB-edpX1)菌株在含相应抗生素的PSA平板上划线进行活化，挑取单菌落在M210培养基中200rpm振荡培养至OD600＝0.6，取2μL点样于PSA平板上，两天后观察菌落形态；此外挑取单菌落在M210培养基中200rpm振荡培养至OD600＝2.5-3.0，12,000rpm离心5min，将上清移至另一干净离心管中，加入上清两倍体积的无水乙醇，-20℃放置2-4h，12,000rpm离心30min，管底收集到的白色沉淀便是提取得到的胞外多糖分子，于55℃干燥后，称重(图4)。与野生型菌株PXO99A相比，ΔedpX1的EPS产量显著性降低，而ΔedpX1(pB-edpX1)基本恢复野生型水平，说明EdpX1正调控了Xoo中EPS的产生。
3.生物膜形成能力的检测
将待测菌株在PSA平板上活化后，在含有相应抗生素的M210培养基中200rpm培养至OD600达到1.0，转接到新鲜的M210培养基中待OD600达到0.5后，取200μL于用于检测生物膜的无菌96孔板中，每个样品设置8个孔，用M210培养基做对照，在28℃恒温培养箱中静止培养4-5d后，用ddH2O洗涤一次，然后加入0.1％(W/V)结晶紫染色15min，再用ddH2O洗涤三次，最后加入无水乙醇将生物膜洗下来，用多功能读数仪检测OD490(图5)。与PXO99A相比，ΔedpX1的生物膜形成能力显著性减弱，ΔedpX1(pB-edpX1)基本恢复至野生型水平，说明EdpX1正调控了Xoo的生物膜形成能力。
4.对III型分泌系统影响检测
4.1在非寄主烟草上的HR
在M210中培养的菌株用无菌水重悬至OD600＝0.1，用无针注射器渗透注射进烟草叶片(Nicotiana benthamiana)，24h后观察烟草叶片(图6A)。与野生型相比，ΔedpX1在烟草上的过敏性坏死反应减弱。
4.2在寄主水稻上的水渍状病斑(water soaking)
在M210中培养的菌株用无菌水重悬至OD600＝0.6，用无针注射器渗透注射进生长两周的水稻叶片(O.sativa ssp.indica cultivar IR24)，3d后观察烟草叶片(图6B)。与野生型相比，ΔedpX1在水稻叶片水渍状的病斑显著性减弱。
4.3转导实验
将C端融合Cya的III型效应子PXO_04172和PXO_03702的质粒pHM04172和pHM03702质粒导入野生型和突变体菌株。在M210中28℃培养过夜，用无菌水重悬至OD600＝0.6，渗透注射生长两周的水稻叶片(O.sativa ssp.indica cultivar IR24)。接种3d后将接种部位剪下(1cm长)，用300μL 0.1M的HCl和无菌小磁珠震荡研磨(GRINOER,Beijing,China)(800rpm，1min)。13,000rpm离心2min，上清置于干净的EP管中-80℃待用。cAMP水平测定采取cAMP ELISA试剂盒(Enzo Life Sciences,Lausen,Switzerland)说明书方法。蛋白浓度测定采用BCA蛋白测定试剂盒(康为，中国)(图6C)。实验结果表明，与野生型相比，ΔedpX1向水稻叶片中注射III型效应子PXO_04172和PXO_03702的量显著性降低。
以上结果证明了EdpX1正调控了Xoo III型分泌系统的功能。
序列表
<110> 中国农业科学院植物保护研究所
<120> 磷酸二酯酶EdpX1用于降低细菌致病性的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 374
<212> PRT
<213> 水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae )
<400> 1
Met Leu Thr Gly Pro Arg Asn Val Leu Ile Asn Pro Asp Thr Leu Ala
1 5 10 15
Asp Ile Asn Ile Pro Pro Gly Leu Gln Leu Ala Ile Gly Thr Pro Asp
20 25 30
Gly Gln Leu Leu Ser Ser Thr Gly Thr Ala Ala Glu Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Glu Pro Ser Asp Glu Arg Ala Pro Asp Asp Arg Val Leu Ser Gln Val
50 55 60
Leu Phe Gly Arg Asp Arg Arg Gly Glu Trp Thr Ala Val Val Thr Glu
65 70 75 80
Pro Val Ala Tyr Leu Arg Gly Pro Leu Ala Ala Ala Arg Leu Gln Leu
85 90 95
Val Pro Val Gly Ile Ala Val Ala Leu Leu Leu Val Gly Ala Val Leu
100 105 110
Trp Val Ser Arg Arg Arg Leu Ser Pro Leu Ala Arg Pro Glu Ile Ala
115 120 125
Val Gln Arg Gly Glu Phe Ile Val His Tyr Gln Pro Ile Ile Ala Leu
130 135 140
Asp Ser Gly Ala Cys Val Gly Ala Glu Ala Leu Val Arg Trp Gln Gln
145 150 155 160
Pro Asp Gly Val Leu Val Pro Pro Asp Ala Phe Ile Pro Leu Ala Glu
165 170 175
Glu Ser Gly Leu Ile Leu Pro Ile Thr Asp Leu Val Val Ala Glu Val
180 185 190
Ile Arg Glu Leu Gly Pro Thr Leu Ala Ala Asp Pro Ala Leu His Val
195 200 205
Ala Ile Asn Val Ser Ala Glu Asp Ile Lys Ser Ser Arg Val Gln Ser
210 215 220
Val Leu Glu His Ala Leu Arg Gly Thr Gly Val Asp Ser Gly Gln Leu
225 230 235 240
Trp Val Glu Ala Thr Glu Arg Ser Leu Met Asp Ile Asp Ala Ala Arg
245 250 255
Thr Thr Ile Met Arg Leu Arg Gly Ala Gly His Thr Val Ser Ile Asp
260 265 270
Asp Phe Gly Thr Gly Tyr Ser Ser Leu Gln Tyr Leu Gln Gly Leu Pro
275 280 285
Leu Asp Ala Leu Lys Ile Asp Lys Ser Phe Val Asp Thr Ile Gly Thr
290 295 300
His Ser Ala Thr Ser Ala Val Ser Ala His Ile Ile Glu Met Ala Lys
305 310 315 320
Thr Leu Arg Leu Arg Thr Ile Ala Glu Gly Val Glu Arg Gln Glu Gln
325 330 335
Leu Asp Tyr Leu Arg Ala His Gly Val Asp Leu Ala Gln Gly Trp Leu
340 345 350
Phe Ser Arg Ala Leu Pro Ala Thr Gly Phe Ile Ala Tyr His Ala Gln
355 360 365
Ala Arg Ser Thr Ala His
370
<210> 2
<211> 1125
<212> DNA
<213> 水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae )
<400> 2
gtgttaacag gccctaggaa cgtcctgatc aaccccgaca cgctggccga catcaatatt 60
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