包含亚氨基脂质的两性脂质体的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请日为2010年7月2日、发明名称为"包含亚氨基脂质的两性脂质体" 的第201080031041. 7号中国专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及能够克服脂蛋白介导的摄取阻滞的脂质装配体（assembly)或脂质 体。更具体地，本发明涉及脂质体或其衍生物在各极性区域的改善，所述脂质体既包含具有 羧酸或磷酸头基的带负电荷的脂质也包含具有亚氨基或胍基的带正电荷的脂质。
【背景技术】
[0003] 脂质体作为活性成分的载体具有广泛的应用。中性的或带负电荷的脂 质体通常用于小分子药物的递送，而带正电荷的（阳离子）或近期引进的两性类 脂质体主要用于核酸例如质粒或寡核苷酸的递送。用于递送核酸"货物"的阳离 子脂质体的重要实例包括但不限于Semple等，Nat. BiotecL (2010) 28:172-176 ; Akinc 等，Nat. Biotech. (2008)26:561-569 ;Chien 等，Cancer Gene Ther. (2005) 12:321-328 ；de Fougerolles, Nat. Rev.Drug Discov. (2007)6:443-453 ；Kim 等，Mol. Ther. (2006) 14:343-350 ;Morrissey，Nat.Biotech. (2005)23:1002-1007; Peer, Science (2008) 319:627-630 和 Santel, Gene Ther. (2006) 13:1222-1234。两性脂质 体用于递送核酸的应用已在Andreakos等，Arthritis Rheum. (2009)60:994-1005中证明。
[0004] 两性脂质体属于较大一类的pH敏感性脂质体，该类还包括PH-敏感性阴离子或阳 离子脂质体，其原型已不于 Lai 等，Biochemistry (1985) 24:1654-1661 和 Budker 等，Nat. Biotech. (1996) 14:760-764中。与pH-敏感性阴离子或阳离子脂质体不同，两性脂质体为 复杂结构并且包含至少一对具有互补电荷的脂质。W002/066012公开了两性脂质体的关键 特征在于这些脂质体在低pH和中性pH下都具有稳定相。W002/066012和W007/107304描 述了自低PH下开始使此类颗粒负荷核酸的方法。
[0005] Hafez 等（Biophys. J. 2000, 79(3)，1438-1446)和 WO 02/066012 提供了 关于如 何选择具有真正两性性质的脂质混合物的指导，更具体地，提供了关于如何确定它们的等 电点和融合开始的指导。中性脂质可以为两性脂质体的额外成分。一种或多种此类中性 脂质的引入显著增加了混合物的复杂度，特别是由于所有成分的单独的量都可能变化。 脂质体的极大数量的可能组合显示出更快速地优化两性脂质体的实践障碍。就此而言， W008/043575揭示出优化两性脂质体的稳定性、融合性（fusogenicity)和细胞转染的策 略，特别是预测何种脂质体混合物在高PH和低pH下形成令人满意的稳定层状相，同时在中 间PH下形成融合性的六边形相的方法。
[0006] 根据上述参考文献的两性脂质体是有效的细胞转染子。然而，观察到通过添加某 种血清而能够阻滞这些脂质体中的一些的功能，由此可能限制了这些脂质体体内靶向某种 细胞的活性。这进一步在本文中所示的实施例（例如实施例3)中进行了说明。
[0007] 在不同血清中观察到的两性脂质体的摄取的抑制显然与近期公开的通过与脂蛋 白形成复合物而活化阳离子载体（如Akinc等，Mol. Ther. (2010)，印刷之前于5月11日 电子公开，DOI: 10. 1038/mt. 2010. 85所证明的，在此情况下脂蛋白为ApoE)相反。
[0008] 更详细的研宄揭示了脂蛋白介导此抑制作用。如本文中实施例4所述，根据 SiRNA至受刺激细胞的功能递送表明缺乏脂蛋白的人血清不能够再抑制脂质体的摄取。 目前，发明人已出人意料地发现某类阳离子脂质与在极性头基中具有羧基或磷酸根的阴 离子脂质的组合在存在血清的情况下在保持转染活性方面是特别有利的。当根据本文和 W008/043575中描述的方法配制由所述脂质混合物产生的脂质装配体或脂质体时，经常观 察到特别的益处。
[0009] 发明目的
[0010]因此，发明的目的是提供可以在存在各种血清的情况下转染细胞的脂质装配体或 脂质体。
[0011] 发明的另一个目的是提供包含此类脂质体的药物组合物，所述脂质体作为用于将 活性剂或活性成分递送至细胞或组织的载体，所述活性剂或活性成分包括药物例如核酸药 物，如寡核苷酸或质粒。
[0012] 发明概述
[0013] 本发明提供了脂质装配体、脂质体及其用于细胞转染的应用，其中所述脂质装配 体包含阴离子和阳离子两性分子并且其中阳离子两性分子的至少一部分是在PH 7. 5下基 本上（substantially)带电荷的亚氨基脂质，其中阴离子两性分子是羧基脂质或磷酸脂质 (phosphate lipid)，并且此外其中阳离子和阴离子两性分子之间的电荷比例是1. 5或更 低。
[0014] 在本发明的各实施方案中，提供了包含阴离子和阳离子两性分子的脂质装配体， 其中阳离子两性分子的至少一部分是在生理条件下基本上带电荷的亚氨基脂质，此外其中 阴离子两性分子的至少一部分是羧基脂质，并且其中阳离子和阴离子两性分子之间的比例 小于或等于1. 5。
[0015] 在本发明的更具体的方面中，提供了包含脂质的组合的脂质装配体，其中所述组 合的阳离子脂质包含胍基部分且所述组合的阴离子脂质包含羧基基团，进一步的特征在于 胍基部分和羧基基团的比例小于或等于1. 5。
[0016] 在本发明的其他实施方案中，提供了包含阴离子和阳离子两性分子的脂质装配 体，其中阳离子两性分子的至少一部分是在生理条件下基本上带电荷的亚氨基脂质，此外 其中阴离子两性分子的至少一部分是磷酸脂质，并且其中阳离子两性分子和阴离子两性分 子之间的比例小于或等于1. 5。在这样的实施方案的进一步优选的方面，亚氨基脂质为胍基 脂质。
[0017] 本发明的阳离子两性分子的带电荷的亚氨基基团的PK大于7. 5,并且选自亚胺、 脒、吡啶、2-氨基吡啶、杂环氮基、胍基部分、异脲或硫代异脲。在优选的实施方案中，阳离子 脂质选自 PONA、CHOLGUA、GUADACA、MPDACA 或 SAINT-18。
[0018] 在优选的实施方案中，所述阴离子脂质选自0^1^、01^^、0065、00?4或？0?八。
[0019] 在许多实施方案中，本发明的脂质装配体是脂质体。
[0020] 在进一步的实施方案中，脂质装配体还包括中性脂质例如胆固醇、磷脂酰胆碱、磷 脂酰乙醇胺或鞘磷脂或其混合物。
[0021] 在优选的实施方案中，中性脂质是胆固醇并且脂质混合物中的胆固醇的摩尔分数 在10摩尔％和50摩尔％之间。