说明】
[0019] 图la-ld示出单链沉默物和IR沉默物可以在TMM基因座处诱导转录沉默。图la: 示出沉默物构建体的示意图。TMM启动子区的475bp(-483至-9)片段用作沉默物。al :没 有polyA添加序列的沉默物。TMM启动子区的TMM转录起始位点（TSS)用作沉默物，其由双 35S以正义（S，正义沉默物）或反义（AS，反义沉默物）方向驱动。还制备了反向重复沉默 物（IR)作为对照。a2 :具有NOS polyA添加序列的沉默物。沉默物（S，AS和IR)转录自 35S启动子。所有构建体的3'端均携带NOS polyA添加序列。图lb:示出在正义沉默物 株系（S21)、反义沉默物株系（AS10)和反向重复沉默物株系（IR8)中观察到的典型的聚集 气孔形态。WT，野生型Col-0。标尺=10 ym。图lc和图Id:示出通过pTMM沉默物减少的 TMM转录物水平。图lc :示出T1转化的植物中降低的TMM转录物水平。对于每个沉默物构 建体，汇集并分析50-100株T1转化的植物。图Id :示出代表性S沉默物株系（S21、S26)、 AS沉默物株系（AS4、AS10)和IR沉默物株系（IR8、IR44)中的TMM mRNA减少。AS10NI和 IR8NI分别表示不带来自AS10和IR8的T2分离群体的任何转基因的子代植物株系。Vect : 载体对照。示出的数据为3个技术重复的平均值土SD(标准差）。在另一独立实验中获得 相似的结果。
[0020] 图2示出转基因植物中单链沉默物的T-DNA插入位置。在每个株系中，箭头指示 T-DNA插入位置。示意图示出破坏的拟南芥基因。白色的框，UTR;黑色的框，外显子区；黑 线，内含子区。假基因At5G54045以灰色表示。At5G09730和At5G54045之间的虚线表示非 常大的基因组距离。
[0021] 图3a和3b示出定位至TMM启动子区的sRNA的克隆数和大小分布。图3a:归一 化的定位至TMM启动子的sRNA的克隆数。将TMM启动子相关sRNA归一化至可以定位至拟 南芥基因组的21-24nt sRNA的总数。正和负分别指正义链和反义链，rpm表示每百万次读 取的读取数。图3b :定位至TMM启动子的sRNA的大小分布。
[0022] 图4a_4e示出在内源TMM启动子和转基因沉默物区的DNA甲基化谱。图4a:示出 所靶向的内源TMM启动子的重亚硫酸盐测序区。图4b、图4c和图4d:分别示出在CG、CHG(H =A、C或T)和CHH类型的胞嘧啶处的DNA甲基化水平。图4e :示出在转基因沉默物区的 DNA甲基化。携带转基因沉默物而没有TGS的株系AS2用作对照。
[0023] 图5a和5b示出在TMM启动子区的DNA甲基化是沉默物依赖性的。核酸内切酶 McrBc切割含有（G/A) mC(N4Q_3_) (G/A)mC的DNA。图5a:示出测试DNA甲基化的TMM启动子 的5'和3'区。图5b :有或无McrBc消化的qPCR结果。WT，野生型Col-0 ;AS4、AS10,反义 沉默物株系。AS10NI，植物源自杂合AS10且不含沉默物。U，无McrBc处理。D，有McrBc处 理。
[0024] 图6a_6d示出在通过AS或IR沉默物沉默的植物中的TMM启动子和编码区的组蛋 白H3修饰模式。图6a :为扩增DNA片段（约100bp)设计的Q-PCR引物，所述DNA片段对应 于如图所示的TMM启动子和编码序列的3个不同区域。图6b:在TMM启动子5'区的组蛋 白H3修饰模式。图6c:在TMM启动子3'区的组蛋白H3修饰模式。图6d:在TMM编码区的 组蛋白H3修饰模式。Ace :H3K9/K14乙酰化。K4me3 :组蛋白H3Lys 4三甲基化（H3K4)形 式。K9me3:组蛋白H3Lys 9(H3K9)三甲基化形式。K27me3:组蛋白H3Lys 27(H3K27)三甲 基化形式。
[0025] 图7a_7d示出靶向FHY1启动子的单链FHY1沉默物可以诱导fhyl-表型。图7a : 在5ym〇l/m2/s远红光（FR)下处理4天，与野生型（WT，Col-〇)相比，下胚轴S沉默物株系 (S3、S4)和反义沉默物株系（AS8、AS11)下胚轴长度较长。fhyl-3，FHYl功能丧失突变体。 标尺=5mm。图7b :为图7a的定量，数据显示为20个个体的平均下胚轴长度土SD(标准 差）。图7c :利用基因特异性引物通过q-RT-PCR检测的相对FHY1信使RNA转录物水平。 图7d :FHY1DNA甲基化。柱状图为一式三份测定平均值，并且棒（bar)表示SD。
[0026] 图8a_8d示出tmm-突变体表型的分类。图8a :WT，Col-〇。图8b:弱表型。图8c: 中等表型。图8d:强表型。
[0027] 图9a_9c示出sRNA的大小分布。X-轴上的数字指sRNA的大小（nt)。（a)、（b)、 (。）、（(1)、（6)、&)、（8)和〇1)分别表示訂、521、526、八54、八510、八510见、11?8和11?8见。
[0028] 图10示出sRNA的DNA印迹分析。（a)，溴化乙锭（EtBr)染色的rRNA用作上样 对照。（b)，通过正义探针检测的负链衍生的sRNA。（c)，通过反义探针检测的正链衍生的 sRNA〇
[0029] 图lla-llf示出内源TMM启动子区的DNA甲基化模式。图10a、图10b和图10c示 出正义沉默物转基因株系的CG、CHG和CHH甲基化模式。图10d、图10e和图10f示出反义 沉默物和反向重复沉默物转基因株系的CG、CHG和CHH甲基化模式。X-轴上的数字指TMM 转录起始位点上游的核苷酸位置。
[0030] 图12a-12c示出AS沉默物转基因植物的转基因沉默物区的DNA甲基化模式。（A)、 (b)和（c)分别示出CG(图11a)、CHG(图lib)和CHH(图11c)甲基化模式。X-轴上的数 字指35S启动子转录起始位点下游的核苷酸位置。
[0031] 图13a-13b示出单链沉默物以及靶向HFR1启动子的反向重复沉默物可以诱导 hfrl-表型。图13a:1.5iimol/m 2/s远红光处理4天之后测量的下胚轴长度。图13b:通过 qPCR检测的HFR1转录物水平降低。WT，野生型，Col-0。S2、S8,携带正义沉默物的转基因 株系。452、455356，携带反义沉默物的转基因株系。11?2。11?5，11?6，携带反向重复沉默物 的转基因株系。这里使用的HFR1功能丧失突变体hfrl为hfrl-201。
[0032] 图14a和14b示出内源FHY1启动子区的DNA甲基化模式。图14a、图14b和图14c 分别示出CG、CHG和CHH甲基化模式。位置指FHY1转录起始位点。
[0033] 图15a和15b示出靶向PhyB启动子的单链PhyB沉默物可以诱导phyB-表型。图 15a :在15 ymol/m2/s红光（RL)下处理5天，S沉默物株系（Sll、S12、S13)和反义沉默物 株系（AS9、AS10、AS11)的下胚轴长度比野生型（WT，Col-〇)长。phyB-9，PhyB功能丧失突 变体。图15b :为图15a的定量，数据显示为20个个体的平均值土SD(标准差）。
[0034] 发明详沐
[0035] 本发明涉及植物、植物组织和植物细胞中内源基因的转录基因沉默（TGS)。更具体 地，本发明涉及能够引起植物、植物组织和植物细胞中内源基因的TGS的核酸构建体。本发 明还涉及利用本发明的核酸构建体通过TGS来减少植物、植物组织或植物细胞中的内源基 因表达的方法。
[0036] 除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属的技术领域的 技术人员通常理解的相同含义。
[0037] 根据相关的上下文，术语"多核苷酸"、"核苷酸序列"和"核酸"指核苷酸（A、C、 T、U、G等或者天然存在或人工的核苷酸类似物）的聚合物，例如DNA或RNA或其表示法 (representation)，如字符串等。给定的多核苷酸或互补多核苷酸可以从任何指定的核苷 酸序列确定。
[0038]当部分或完全地从通常相伴的组分（其他蛋白质、核酸、细胞、合成试剂等）分离 时，多核苷酸、多肽或其他组分是"分离的"。当其是人工或工程化的，或者源自人工或工程 化的蛋白质或核酸时，核酸或多肽是"重组的"。例如，插入载体或任何其他异源位点，例如 重组生物体的基因组中，从而其与通常在自然界中发现的多核苷酸侧翼的核苷酸序列无关 的多核苷酸是重组多核苷酸。从重组多核苷酸体外或体内表达的蛋白质是重组多肽的实 例。同样，在自然界中未出现的多核苷酸序列，例如天然存在的基因的变体，是重组的。
[0039] 术语"核酸构建体"或"多核苷酸构建体"表示单链或双链的核酸分子，其分离自 天然存在的基因或者已经被修饰以自然界中不存在的方式含有核酸区段。当核酸构建体含 有表达本发明的序列所需的控制序列时，术语核酸构建体与术语"表达盒"是同义的。
[0040] 术语"控制序列"在本文中定义为包括对于表达本发明的多核苷酸必须或有利的 所有元件。每个控制序列对于多核苷酸序列可以是天然的或外源的。最低限度而言，所述 控制序列包括启动子和转录终止信号。所述控制序列可以提供有接头，其用于引入特异性 限制位点以帮助控制序列与所述核苷酸序列的连接。
[0041] 术语"可操作地连接"在本文中定义为这样的构型，其中控制序列置于相对于核酸 构建体的核苷酸序列的合适位置，从而所述控制序列指导本发明的多核苷酸的表达。
[0042] 在本发明的上下文中，术语"表达"包括多核苷酸的转录。在本发明的上下文中， 术语"表达载体"涵盖线性或环状的DNA分子，其包含本发明的多核苷酸，并且可操作地连 接至为其表达而提供的额外片段。
[0043] 术语"植物"包括完整植物、芽营养器官/结构（如叶、茎和块茎）、根、花和花器官 (如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠）、种子（包括胚、胚乳和种皮）和果实（成熟 子房）、植物组织（如维管组织、基本组织等）和细胞（如保卫细胞、卵细胞、毛状体等）及 其子代。可以用于本发明的方法的植物类型通常和可用于转化技术的高等和低等植物类型 一样多，包括被子植物（单子叶和双子叶植物）、裸子植物、蕨类植物和多细胞藻类。其包括 各种倍性水平的植物，包括非整倍体、多倍体、二倍体、单倍体和半合子。
[0044] 本文所用的术语"异源"描述两种或更多种元件之间的关系，其表明元件通常不是 在自然界中互相邻近地发现的。因此，例如多核苷酸序列与生物体或第二多核苷酸序列是 "异源"的，如果其源自外源物种，或者如果源自相同物种，是从其来源修饰而成的。例如，可 操作地连接至异源编码序列的启动子指编码序列来自与启动子来源的物种不同的物种，或 者如果来自相同物种，编码序列与启动子不是天然相关的（例如，遗传工程化的编码序列 或者来自不同生态型或品种的等位基因）。异源多肽的实例为在转基因生物体中从重组多 核苷酸表达的多肽。异源多核苷酸和多肽为重组分子的形式。
[0045]本文所用的术语"转染"指有意地将核酸引入细胞。转染包括本领域技术人员已 知的将核酸引入细胞的任何方法，包括但不限于农杆菌感染、基因枪（ballistic)、电穿孔、 微注射等。
[0046]本文所用的术语"核酸沉默物分子"指本发明的核酸构建体的部分，其包含靶植