养以 产生转基因植物。培养的转基因植物会表达本文所述的核酸并且其会被切割以产生SRNA。
[0072] 在第五方面，本发明提供核酸构建体和方法以从内源基因的启动子区鉴定和获得 其他TGS沉默物。根据这一方面，所述核酸构建体是适合于转化想要从其鉴定TGS沉默物 的植物物种的核酸构建体。在一实施方案中，所述核酸构建体可以包含在载体中。在一些 实施方案中，所述载体适合于农杆菌介导的转化。在其他实施方案中，所述载体可以适合于 基因枪介导的转化。其他适合于植物转化的载体是本领域技术人员熟知的。在另一实施 方案中，所述核酸构建体可以用于根据本领域技术人员熟知的技术直接转化植物。所述核 酸构建体包含植物可操作的启动子，所述启动子可操作地连接至推定的核酸沉默物分子， 所述沉默物分子可操作地连接至植物可操作的3'调节区域。在一实施方案中，所述推定的 核酸沉默物分子包含植物内源基因靶标的启动子区，所述内源基因靶标要被测试转录基因 沉默。在一些实施方案中，所述推定的核酸沉默物分子相对于本文所述的植物可操作启动 子处于正义方向。在其他实施方案中，所述推定的核酸沉默物分子相对于植物可操作启动 子处于反义方向。在进一步的实施方案中，所述核酸沉默物分子可以含有本文所述的反向 重复序列或反向重复结构。在一实施方案中，所述植物可操作启动子为单启动子、双同源 启动子或双异源启动子。在一实施方案中，所述植物可操作启动子为单或双35S CMV启动 子。在一实施方案中，所述3'序列为TRV23'序列。在另一实施方案中，所述3'调节区域 为polyA添加序列。在一实施方案中，所述polyA序列为NOS poly A序列。沉默的测试可 以根据本领域熟知的方法进行。这些方法包括但不限于RT-PCR、PCR、RNA印迹分析、免疫测 定和酶测定。在一实施方案中，可以分析靶启动子的甲基化状况。在另一实施方案中，可以 通过McrBc酶促消化分析靶启动子的甲基化状况。在另一实施方案中，通过使用针对组蛋 白甲基化或乙酰化位点的抗体的免疫测定来测试染色质修饰的状态。
[0073] 根据这一方面，进一步通过包括以下步骤的方法鉴定合适的TGS沉默物：制备核 酸构建体，其包含如本文所述的感兴趣的内源基因的推定核酸沉默物分子，用所述核酸构 建体转化感兴趣的植物物种的细胞或组织，以及确定所述推定的核酸沉默物分子是否被所 述植物物种转化的细胞或组织加工产生感兴趣的内源基因的沉默。如果内源基因被沉默， 则所述感兴趣的内源基因的推定核酸沉默物分子被鉴定为TGS沉默物。在一实施方案中， 所述确定通过以下步骤进行：培养转化的植物细胞以表达所述推定的核酸沉默物分子，以 及测试培养的转化植物细胞或组织中的转录基因沉默。在另一实施方案中，所述确定通过 以下步骤进行：从转化的植物细胞或组织再生转化的植物，以及测试转化的植物的转录基 因沉默。转化的植物的再生通过本领域技术人员熟知的技术进行。沉默的测试可以根据本 领域熟知的方法进行。这些方法包括但不限于RT_PCR、PCR、RNA印迹分析、免疫测定和酶测 定。在一实施方案中，可以分析靶启动子的甲基化状况。在另一实施方案中，可以通过McrBc 酶促消化分析靶启动子的甲基化状况。在另一实施方案中，通过使用针对组蛋白甲基化或 乙酰化位点的抗体的免疫测定来测试染色质修饰的状态。
[0074] 除非另外指明，本发明的实施使用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、 遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养和转基因生物学的常规技术，这些在本领域技 术人员的水平之内。参见，例如 Maniatis et al.，1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) ；Sambrook et al.,1989, Molecular Cloning, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) ；Sambrook and Russell, 2001, Molecular Cloning, 3rd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)； Green and Sambrook, 2012, Molecular Cloning,4th Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) ；Ausubel et al. , 1992), Current Protocols in Molecular Biology (John ffiley&Sons, including periodic updates)； Glover,1985, DNA Cloning(IRL Press,Oxford) ；Russel1,1984, Molecular biology of plants:a laboratory course manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) ;Anand，Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press,New York,1992) ；Guthrie and Fink,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology(Academic Press, New York, 1991)； Harlow and Lane， 1988,Antibodies， （Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, New York) ；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames&S. J. Higgins eds. 1984) transcription And Translation (B. D. Hames&S. J. Higgins eds. 1984)； Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc. , 1987) immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986) ；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning(1984) ；the treatise, Methods In Enzymology(Academic Press,Inc. , N. Y. ) ；Methods In Enzymology, Vols. 154and 155 (Wu et al.eds.),Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker, eds. , Academic Press,London, 1987) ；Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M.Weir and C.C.Blackwell, eds. , 1986) ;Riott，Essential Immunology, 6th Edition, Blackwell Scientific Publications,Oxford, 1988 ；Fire et al. , RNA Interference Technology:From Basic Science to Drug Development, Cambridge University Press, Cambridge, 2005 ；Schepers,RNA Interference in Practice, Wiley-VCH, 2005 ；Engelke, RNA Interference(RNAi):The Nuts&Bolts of siRNA Technology, DNA Press，2003 ;Gott，RNA Interference,Editing,and Modification:Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology)，Human Press，Totowa，NJ，2004 ;Sohail，Gene Silencing by RNA Interference:Technology and Application，CRC，2004〇 实施例
[0075] 本发明参照以下实施例进行描述，其仅为示例目的而提供，并非意图以任何方式 限制本发明。使用本领域中公知的标准技术或者下文特别描述的技术。
[0076] 实施例1
[0077] 材料和方法
[0078] 构建体：利用标准PCR和克隆技术，将来自AT1G80080(TMM)的启动子区的475bp 基因组DNA片段（-483t〇-9,转录起始位点为+1) (SEQ ID N0:1)克隆入二元质粒pBAV3。后 一种质粒源自pBA002(Kost et al.，1998)，通过用来自pTRV2的片段代替T-DNA的右边界 附近的NOS polyA添加序列，并且用来自pBC〇-DC-CFP的重复的35S启动子代替35S启动 子（Wu et al.，2010)。以相对于TMM编码序列的正义（S沉默物）或反义（AS沉默物）方 向，将TMM启动子片段插入双35S启动子的下游。为了获得反向重复结构，首先将TMM启动 子DNA片段克隆入载体pSRS，其通过用大豆启动子序列代替内含子（Mette et al.，2000) 从pSK-int(Guo et al.，2003)获得。将反向重复结构（IR沉默物）克隆入pBAV3,在双35S 启动子的控制下。还将靶向TMM启动子的S-、AS-和IR-沉默物克隆入常规pBA002mRNA表 达载体（Kost et al.，1998)以产生另一系列具有NOS polyA添加序列的沉默物。通过类 似的策略，产生用于？册1(-449至-1)(5￡〇10勵:2)、册1?1 (-1025至-1)(5￡〇10勵:3)和 PhyB(-945 至+112)(SEQ ID N0:4)的沉默物构建体。
[0079] 植物材料和转化：我们在这个研宄中使用拟南芥（Arabidopsis thaliana) C〇lumbia(C〇l-0)生态型作为野生型（WT)。所有的拟南芥突变体已经进行了描述： rdr2-2(SALK_059661, (Herr et al. , 2005))> sgs2-l/rdr6(Elmayan et al.,1998)> dcl3-l(SALK_005512， （Xie et al.，2004))、 ago4-2(Agorio and Vera,2007)、 nrpdla-3(SALK_128428, （Herr et al.，2005))、nrpdlb-l/nrpel-l(SALK_029919, （Pontier et al.，2005))、ddc(drml/crm2/cmt3 三突变体，（Zhang et al.，2006b))、PhyB_9(Reed