NA，其诱导转录基因沉默以减少感兴趣的靶基因的表达。
[0060] 根据本发明，编码单链沉默物或IR沉默物并且被插入植物的核酸分子（感兴趣的 核酸分子）对于转化方法并不是关键的。通常，引入植物的感兴趣的核酸分子是本文所述 的构建体的一部分。所述构建体通常包含可操作地连接至感兴趣的核酸分子的5'侧和/ 或感兴趣的核酸分子的3'侧的调节区域。包含所有这些元件的盒在本文中又称为表达盒。 在表达盒构建体中，表达盒可以另外含有5'前导序列。所述调节区域（即启动子、转录调 节区域和转录终止区域）可以对宿主细胞或对彼此而言是原生/同功的。或者，所述调节 区域对于宿主细胞或对彼此而言是异源的。参见美国专利号7, 205, 453和7, 763, 773以及 美国专利申请公开号2006/0218670、2006/0248616和20090100536及其引用的参考文献。
[0061] 植物可操作的启动子控制之下的感兴趣的核酸分子可以是本文所定义的任何核 酸分子，并且可以用于通过转录基因沉默以下调靶基因的机制来改变引入所述感兴趣的核 酸分子的植物物种的任何特征或性状。靶基因可以编码调控蛋白如转录因子等、结合或相 互作用蛋白或者改变转基因植物细胞或转基因植物的表型性状的蛋白质。靶基因的下调可 以增强、改变或修饰植物的性状，如农艺性状。所述农艺性状可以涉及植物形态学、生理学、 生长和发育、产量、营养、疾病或害虫抗性或者环境或化学品耐受性。在一些方面，所述性状 选自水利用效率、温度耐受性、产量、氮利用效率、种子蛋白、种子油和生物量。产量可以包 括在非胁迫条件下增加的产量和环境胁迫条件下增强的产量。胁迫条件可以包括例如干 旱、阴暗、真菌病、病毒病、细菌病、昆虫感染、线虫感染、极端温度暴露（冷或热）、渗透性胁 迫、减少的氮营养可用性、减少的磷营养可用性以及高植物密度。在一些实施方案中，所述 感兴趣的核酸分子可以用于修饰代谢途径，如种子中的脂肪酸生物合成或脂质生物合成途 径，或者用于修饰植物中对病原体的抗性。
[0062] 通常，所述表达盒可以额外地包含可选择的标记物基因用于选择转化的细胞。可 选择的标记物基因用于选择转化的细胞或组织。通常，植物可选择的标记物基因会编码抗 生素抗性，合适的基因包括编码对抗生素壮观霉素的抗性的至少一组基因、编码链霉素抗 性的链霉素磷酸转移酶（spt)基因、编码卡那霉素或遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶 (nptll)基因、编码潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶（hpt或aphiv)基因、乙酰乳酸合酶 (als)基因。或者，植物可选择的标记物基因编码除草剂抗性，例如对磺酰脲型除草剂、草铵 膦、草甘膦、铵、溴苯腈、咪唑啉酮和2, 4-二氯苯氧乙酸（2, 4-D)的抗性，包括编码对抑制谷 氨酰胺合酶的作用的除草剂如草丁膦或basta的抗性的基因（例如bar基因）。一般地，参 见国际公开号W0 02/36782、美国专利号7, 205, 453和7, 763, 773以及美国专利申请公开号 2006/0218670、2006/0248616、2007/0143880 和 20090100536 及其引用的参考文献。还参见 Jefferson et al. (1991) ；De Wet et al. (1987) ；Goff et al. (1990) ；Kain et al. (1995) 和Chiu et al. (1996)。所列的可选择的标记物基因并不是限制性的。可以使用任何可选 择的标记物基因。所述可选择的标记物基因也在要转化的植物物种中可操作的启动子的控 制之下。这样的启动子包括国际公开号W0 2008/094127及其引用的参考文献中描述的启 动子。还参见，美国专利申请公开号2008/0313773和2010/0199371，其示例了可以用于本 发明的其他标记物。
[0063] 一些启动子可以用于实施本发明。所述启动子可以基于想要的结果加以选择。 也就是说，所述核酸可以与组成型、组织偏爱或其他启动子组合以在感兴趣的宿主细胞中 进行表达。这样的组成型启动子包括例如，Rsyn7的核心启动子（WO 99/48338和美国专 利号 6,072,050);核心0&]\^355启动子（0(16116七&1.，1985);稻肌动蛋白（]^￡11'〇7 6七 al.，1990);泛素（Christensen and Quail, 1989 ;Christensen et al.，1992) ;pEMU(Last et al.，1991) ;MAS(Velten et al.，1984) ;ALS 启动子（U.S. Patent No. 5, 659, 026)等。 其他组成型启动子包括例如美国专利号5,608, 149、5,608, 144、5,604, 121、5, 569, 597、 5, 466, 785、5, 399, 680、5, 268, 463 和 5, 608, 142 中公开的启动子。
[0064] 其他启动子包括诱导型启动子。诱导型启动子响应内源或外源刺激的存在，例如 通过化合物（化学诱导物），或者响应环境、激素、化学和/或发育信号，选择性地表达可 操作地连接的DNA序列。诱导型或调节的启动子包括例如由光、热、胁迫、水淹或干旱、植 物激素、创伤或化学物如乙醇、茉莉酸、水杨酸或安全剂。病原体诱导型启动子包括来自发 病机理相关蛋白（PR蛋白）的启动子，其在病原体感染后被诱导，例如PR蛋白、SAR蛋白、 0 -1，3-葡聚糖酶、几丁质酶等。其他启动子包括在病原体感染位点处或附近局部表达的 启动子。在其他实施方案中，启动子可以是伤害诱导型启动子。在其他实施方案中，化学 物调节的启动子可以用于通过施用外源化学调节剂来调节植物中基因的表达。所述启动子 可以是化学物诱导型启动子，其中所述化学物的施用诱导基因表达，或者可以是化学物抑 制型启动子，其中所述化学物的施用抑制基因表达。此外，组织偏爱型启动子可以用于靶向 特定的植物组织中感兴趣的多核苷酸的增强的表达。每一个这些启动子描述于美国专利号 6, 506, 962、6, 575, 814、6, 972, 349和 7, 301，069 以及美国专利申请公开号 2007/0061917和 2007/0143880。还参见，美国专利申请公开号2008/0313773和2010/0199371，示例了可以 用于本发明的其他启动子。本领域技术人员已知的可用于植物的其他启动子也可以用于本 发明。
[0065]用于本发明的启动子可以包括：RIP2、mLIP15、ZmCORl、Rabl7、CaMV 35S、RD29A、 B22E、Zag2、SAM合成酶、泛素、CaMV 19S、nos、Adh、蔗糖合酶、R-等位基因、维管组织偏 爱型启动子S2A(Genbank登录号ER)30816)和S2B(Genbank登录号EF030817)以及来自 玉米的组成型启动子G0S2。其他启动子包括根偏爱型启动子，如玉米NAS2启动子、玉米 Cyclo启动子（美国专利申请公开号2006/0156439)、玉米R00TMET2启动子（国际公开号 W005/063998)、CR1BI0启动子（国际公开号W006/055487)、CRWAQ81启动子（国际公开号 W005/035770)和玉米 ZRP2. 47 启动子（NCBI 登录号：U38790 ;GI No. 1063664)。在一些实 施方案中，所用的启动子为双启动子，例如双CaMV 35S启动子。本文公开的任何启动子的 双启动子以及本领域技术人员已知的可用于植物的其他启动子可以用于本发明。
[0066] 在制备表达盒时，可以操作各种DNA片段，从而提供正确的方向，以及若合适，正 确的读框的DNA序列。为了这个目的，可以使用适配头或接头以连接DNA片段，或者可以进 行其他操作以提供适当的限制性位点、除去多于的DNA、除去限制性位点等。为此目的，可以 使用体外诱变、引物修复、限制、退火、重取代如转换和颠换。
[0067] 将核酸克隆入表达载体后，则可以将其利用常规转化（或转染）方法引入植物细 胞。术语"植物细胞"意图涵盖源自植物的任何细胞，包括未分化的组织如胼胝和悬浮培养 物，以及植物种子、花粉或植物胚。适合于转化的植物组织包括叶组织、根组织、分生组织、 原生质体、下胚轴、子叶、盾片、茎尖、根、幼胚、花粉和花药。"转化"表示通过外部施用来自 不同基因型的其他细胞的重组DNA来直接修饰细胞的基因组，从而导致该重组DNA的摄取 和整合入对象细胞的基因组。通过这种方式，可以获得遗传修饰的植物、植物细胞、植物组 织、种子等。
[0068] 本发明的DNA构建体可以用于转化任何植物。所述构建体可以通过各种常规技术 引入想要的植物宿主的基因组。用于转化许多高等植物物种的技术是熟知的并且描述于技 术和科学文献。如本领域人员熟知的，转化方法可以根据转化的目标植物或植物细胞的类 型而变化，即单子叶或双子叶植物，。例如，DNA构建体可以利用诸如电穿孔和植物细胞原 生质体的微注射的技术直接引入植物细胞的基因组DNA ;或者DNA构建体可以利用诸如DNA 颗粒轰击的基因枪方法直接引入植物组织。或者，DNA构建体可以与合适的T-DNA侧翼区域 组合并引入常规根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)宿主载体。当细胞被细菌感染 时，根瘤农杆菌宿主的病毒性功能会引起构建体和相邻标记物插入植物细胞DNA中。因此， 可以使用提供有效的转化/转染的任何方法。参见，例如美国专利号7, 241，937、7, 273, 966 和7, 291，765以及美国专利申请公开号2007/0231905和2008/0010704及其引用的参考文 献援。还参见国际公开的申请号W0 2005/103271和W0 2008/094127及其引用的参考文献。 还参见美国专利申请公开号2008/0313773和2010/0199371示例的可用于本发明的各种植 物物种的转化方法。
[0069] 通过任何上述转化技术获得的转化的植物细胞可以进行培养以再生具有转化的 基因型并由此产生期望表型的完整植物，例如转基因植物。"转基因植物"是引入了外源 DNA的植物。"转基因植物"涵盖所有的后代、杂种及其杂交品种（cross)，无论是有性或 无性繁殖的，并且其继续带有外源DNA。再生技术取决于组织培养生长培养基中某些植物 激素的操作，通常取决于与期望的核苷酸序列一起引入的杀生物剂和/或除草剂标记物。 参见，例如国际公开申请号W0 2008/094127及其引用的参考文献和美国专利申请公开号 2010/0199371。
[0070] 用于转化的前述方法通常用于产生其中稳定整合表达盒的转基因品种。当表达盒 稳定地整合入转基因植物后，其可以通过有性杂交转移至其他植物。在一实施方案中，可以 使转基因品种与其他（未转化或转化）品种杂交，以产生新的转基因品种。或者，已经利用 前述转化技术工程化引入特定的棉花株系的遗传形状可以利用植物育种领域熟知的传统 回交技术转移入其他株系中。例如，回交方法可以用于将改造的性状从公开的非优良品种 转移入优良品种中，或者从基因组中含有外源基因的品种转移入不包含该基因的一个或多 个品种中。如本文所用，本文所用的"杂交"可以指简单的X与Y杂交，或者回交的过程。根 据要进行杂交的物种，可以使用任何标准育种技术。
[0071] 产生这种类型的转基因植物后，植物自身可以根据常规方法进行培养。当然，转基 因种子可以从转基因植物回收。然后可以将这些种子种植在土壤中并根据常规方法培