et al.，1993)、hfrl-201(Soh et al.，2000)和 fhyl-3(Zeidler et al.，2004)。所有的突变 体都是Columbia(Col-〇)生态型背景。
[0080] 使植物在长日照条件下（16小时光照/8小时黑暗）于生长室中生长，通过冷白荧 光灯进行照明，直至开花。根据Zhang et al. (Zhang et al.，2006a)进行标准浸花法转化。
[0081] tmm-表型观察：收获后，将T1幼苗在BASTA平板上进行筛选。形态学表型在显微 镜下进行评分。对于每个独立的转基因系，从40-80个随机选取的3周龄幼苗计算穿透率。 根据簇集气孔的频率和数目，我们将tmm-表型大体上分为3类：弱、中等和强（图8a-8d)。 当来自一个转化事件的植物主要表现出二簇集气孔和偶尔地三簇集气孔时，我们将其评分 为弱表型。如果频繁地观察到三簇集气孔时，转基因植物表现出中等tmm-表型。具有强 tmm-表型的转基因植物表现出多于四的簇集气孔并且通常无法观察到单气孔（图8a-8d)
[0082] DNA 甲基化分析：通过 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Cat. No. 69104)从 2 周龄 幼苗提取拟南芥基因组DNA。
[0083] 重硫酸盐处理的DNA样品的测序如下进行。重亚硫酸盐DNA转化利用1 y g基因 组 DNA 和 EpiTech Bisulfite Kit (Qiagen, Cat. No. 59104)按照生厂商的指导进行。PCR 利用靶区域之外的引物进行，并且所述引物为单链甲基化检测而设计。实施例中所用的 引物如表1所示。然后将PCR产物利用TA克隆试剂盒（Invitrogen，Cat.No.K2020-40) 克隆入PCR2.1。对于每个基因型，利用M13R引物测序至少20个独立的克隆。数据通过 Cymate(Hetzl et al，2007)进行分析。
[0084] 表1引物
[0085]
【主权项】
1. 一种核酸构建体，其包含可操作地连接至核酸沉默物分子的植物可操作启动子，所 述核酸沉默物分子可操作地连接至植物可操作的3 '调节区，其中所述核酸沉默物分子包含 至少一个植物内源基因靶标的启动子区，其中在转基因植物中表达所述核酸沉默物分子导 致所述植物内源基因靶标的转录基因沉默。
2. 权利要求1的核酸构建体，其中所述至少一个启动子区为启动子区的单拷贝。
3. 权利要求1的构建体，其中所述核酸沉默物分子相对于所述植物可操作启动子处于 正义方向。
4. 权利要求3的构建体，其中所述核酸沉默物分子的转录产生单链正义沉默物。
5. 权利要求1的构建体，其中所述核酸沉默物分子相对于所述植物可操作启动子处于 反义方向。
6. 权利要求5的构建体，其中所述核酸沉默物分子的转录产生单链反义沉默物。
7. 权利要求1的构建体，其中所述核酸沉默物分子以反向重复构型提供。
8. 权利要求7的构建体，其中所述反向重复核酸沉默物分子的转录产生双链沉默物。
9. 权利要求7的构建体，其中所述核酸构建体在所述反向重复沉默物区之间额外地包 含间隔序列。
10. 权利要求1-9中任一项的构建体，其中所述植物可操作启动子为单启动子、双同源 启动子或双异源启动子。
11. 权利要求1-10中任一项的构建体，其中所述3'调节区为3'病毒序列。
12. 权利要求1-11中任一项的构建体，其中所述3'调节区为polyA添加序列。
13. 权利要求1-12中任一项的构建体，其中所述启动子区包含所述内源基因的约300 个连续核苷酸-约1500个连续核苷酸，所述内源基因的约400个连续核苷酸-约1200个 连续核苷酸，所述内源基因的约425个连续核苷酸-约1100个连续核苷酸或者所述内源基 因的约425个连续核苷酸-约1075个连续核苷酸。
14. 权利要求13的构建体，其中所述启动子区包含选自SEQIDNO: 1、SEQIDN0:2、 SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的核苷酸序列。
15. -种核酸构建体，其包含可操作地连接至核酸沉默物分子的植物可操作启动子，所 述核酸沉默物分子可操作地连接至植物可操作的3 '调节区，其中所述核酸沉默物分子包含 至少一个植物内源基因靶标的启动子区，其中所述至少一个启动子区不以反向重复的形式 存在，并且其中在转基因植物中表达所述核酸沉默物分子导致所述植物内源基因靶标的转 录基因沉默。
16. 权利要求15的核酸构建体，其中所述至少一个启动子区为启动子区的单拷贝。
17. 权利要求15的构建体，其中所述核酸沉默物分子的启动子区相对于所述植物可操 作启动子处于正义方向。
18. 权利要求17的构建体，其中所述核酸沉默物分子的启动子区的转录产生单链正义 沉默物。
19. 权利要求17的构建体，其中所述核酸沉默物分子相对于所述植物可操作启动子处 于反义方向。
20. 权利要求19的构建体，其中所述核酸沉默物分子的转录产生单链反义沉默物。
21. 权利要求15-20中任一项的构建体，其中所述植物可操作启动子为单启动子、双同 源启动子或双异源启动子。
22. 权利要求15-21中任一项的构建体，其中所述3'调节区为3'病毒序列。
23. 权利要求15-22中任一项的构建体，其中所述3'调节区为polyA添加序列。
24. 权利要求15-23中任一项的构建体，其中所述启动子区包含所述内源基因的约300 个连续核苷酸-约1500个连续核苷酸，所述内源基因的约400个连续核苷酸-约1200个 连续核苷酸，所述内源基因的约425个连续核苷酸-约1100个连续核苷酸或者所述内源基 因的约425个连续核苷酸-约1075个连续核苷酸。
25. 权利要求24的构建体，其中所述启动子区包含选自SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、 SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的核苷酸序列。
26. -种包含权利要求1-25中任一项的核酸构建体的植物转化载体。
27. -种转基因植物细胞，其包含稳定地整合入其基因组的权利要求1-25中任一项的 核酸构建体或者权利要求26的植物转化载体。
28. -种转基因植物，其包含稳定地整合入其基因组的权利要求1-25中任一项的核酸 构建体或者权利要求26的植物转化载体。
29. -种通过植物细胞中的转录基因沉默减少植物内源基因表达的方法，所述方法包 括在适合表达所述核酸沉默物分子的条件下培养权利要求27的转基因植物细胞，从而使 所述植物内源基因的表达减少。
30. 权利要求29的方法，其中所述核酸沉默物的表达导致产生初始单链转录物，然后 加工所述初始单链转录物以在所述转基因植物细胞中产生小RNA，然后通过所述转基因植 物细胞中的小RNA进行所述植物内源基因的转录基因沉默。
31. -种通过植物中的转录基因沉默减少植物内源基因表达的方法，所述方法包括使 权利要求28的转基因植物在适合表达所述核酸沉默物分子的条件下生长，从而使所述植 物内源基因的表达减少。
32. 权利要求31的方法，其中所述核酸沉默物的表达导致产生初始单链转录物，然后 加工所述初始单链转录物以在所述转基因植物中产生小RNA，然后通过所述小RNA进行所 述转基因植物中所述植物内源基因的转录基因沉默。
33. -种通过植物细胞中的转录基因沉默减少植物内源基因表达的方法，所述方法包 括 用权利要求1-25中任一项的核酸构建体或权利要求26的植物转化载体转化植物细胞 以产生转基因植物细胞，所述转基因植物细胞具有稳定地整合入其基因组的所述核酸构建 体或所述植物转化载体，以及 在适合表达所述核酸沉默物分子的条件下培养所述转基因植物细胞，从而使所述植物 内源基因的表达减少。
34. 权利要求33的方法，其中所述核酸沉默物的表达导致产生初始单链转录物，然后 加工所述初始单链转录物以在所述转基因植物细胞中产生小RNA，然后通过所述转基因植 物细胞中的小RNA进行所述植物内源基因的转录基因沉默。
35. -种通过植物中的转录基因沉默减少植物内源基因表达的方法，所述方法包括 用权利要求1-25中任一项的核酸构建体或权利要求26的植物转化载体转化植物细胞 以产生转基因植物细胞，所述转基因植物细胞具有稳定地整合入其基因组的所述核酸构建 体或所述植物转化载体， 从所述转基因植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物具有稳定地整合入其基 因组的所述核酸构建体或所述植物转化载体，以及 使所述转基因植物在适合表达所述核酸沉默物分子的条件下生长，从而使所述植物内 源基因的表达减少。
36. 权利要求35的方法，其中所述核酸沉默物的表达导致产生初始单链转录物，然后 加工所述初始单链转录物以在所述转基因植物中产生小RNA，然后通过所述小RNA进行所 述转基因植物中所述植物内源基因的转录基因沉默。
37. -种鉴定可用于植物内源基因的转录基因沉默的植物启动子片段的方法，所述方 法包括 (a) 用权利要求1-25中任一项的构建体或权利要求26的植物转化载体转化植物细胞， 以及 (b) 测试转化的植物细胞中的转录基因沉默。
38. 权利要求37的方法，其中所述测试包括使用一种或多种以下方法：RT-PCR、PCR、 RNA印迹、免疫测定或酶促测定。
39. 权利要求38的方法，其中所述测试包括使用免疫测定。
40. 权利要求39的方法，其中所述免疫测定包括使用针对组蛋白乙酰化或组蛋白甲基 化位点的抗体。
41. 权利要求38的方法，其中所述测试包括使用酶促测定。
42. 权利要求41的方法，其中所述酶促测定包括用McrBc消化DNA。
43. 权利要求37的方法，其进一步包括 (al)在适合表达推定的核酸沉默物分子的条件下培养所述转化的植物细胞。
44. 权利要求37的方法，其进一步包括 (al)从所述转化的植物细胞再生转化的植物，以及 (a2)使所述转化的植物在适合于转化的植物细胞中表达推定的核酸沉默物分子的条 件下生长。
45. 权利要求37-44中任一项的方法，其进一步包括如果在所述转化的植物细胞中有 转录基因沉默，则将所述推定的核酸沉默分子鉴定为靶植物内源基因的核酸沉默分子。
【专利摘要】本发明涉及植物、植物组织和植物细胞中内源基因的转录基因沉默(TGS)。更具体地，本发明涉及能够进行植物、植物组织和植物细胞中内源基因的TGS的核酸构建体。本发明进一步涉及利用本发明的核酸构建体通过TGS减少植物、植物组织或植物细胞中的内源基因表达的方法。
【IPC分类】C12N5-04, C12N15-82, C12Q1-68
【公开号】CN104781407
【申请号】CN201380058018
【发明人】N-H·蔡, S·邓, H·代, Q-W·牛, H·王, C·阿雷纳斯维尔特罗
【申请人】洛克菲勒大学
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2013年8月27日
【公告号】CA2884296A1, US20150252375, WO2014039330A1, WO2014039330A8