图谱进行分离的独特类型的前列腺 癌（Glinsky 等，J. Clin. Invest. 113:913-23,2004 ;Hsieh 等，Nature doi:10.1038/ nature. 10912, 2012 ;Lapointe 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:811-6,2004; LaTulippe 等，Cancer Res. 62:4499-506,2002 ;Markert 等，Proc.Natl.Acad.Sci. doi:10.1073/pnas. 1117029108,2012 ;Rhodes 等，Cancer Res. 62:4427-33,2002 ;Singh 等，Cancer Cell 1:203-9,2002 ;Yu 等，J. Clin. Oncol. 22:2790-9,2004 ;Varambally 等，Nature 419:624-9,2002)。此外，这些方法已经用来进行包括跨膜蛋白酶、成红细 胞转化特异性（ETS)DNA转录因子家族成员的丝氨酸2 (TMPRSS2) (Tomlins等，Science 310:644-8, 2005, Toml ins, Nature 448:595 - 599, 2007)的雄激素-调苄基因的基因融 合的检测。这些融合在前列腺癌中常见并且已经显示出在侵袭性更强的癌症中普遍存在 (Attard 等，Oncogene 27:253-63, 2008 ;Barwick 等 Br.J. Cancer 102:570-576,2010; Demichelis 等，Oncogene 26:4596-9,2007 ;Nam 等，Br.J. Cancer 97:1690-5,2007)。已经 显示出TMPRSS2-ERG融合的转录性调节与前列腺癌生物标志物和TGF-0信号有关（Brase 等，BMC Cancer 11:507doi: 10. 1186/1471,2011)。除了特异性基因融合，包括拷贝数变 体的大范围突变性变化也与前列腺癌肿瘤有关（Berger等，Nature 470:214-220,2011 ; Demichellis 等，Proc.Natl.Acad.Sci.doi:10. 1073/pnas. 117405109, 2012 ;Kumar 等，Proc. Natl. Acad. Sci. 108:17087-17092, 2011)。已经发现了存在肿瘤内异质性，其指示 能够导致对肿瘤的异质性程度的低估（Gerlinger等，New Eng, J. Med. 66:883-892, 2012)。 特别是在6-15 %的前列腺肿瘤中发现的涉及SP0P底物结合槽的突变，其缺失了 EST家 族基因重排，这显示出具有SP0P突变的肿瘤定义了一个新的类型的前列腺肿瘤。而且， 具有SP0P突变的肿瘤在原发癌中而非在转移癌中缺少PTEN缺失（Barbieri等，Nature Gen.44:685-689, 2012)。
[0027] 基因表达是DNA通过RNA聚合酶转录为信使RNA。上调形容在一个样品（例如， 肿瘤组织）中，观察到一个基因与另一个基因（通常是对照样品中的健康组织）相比，其具 有更高的表达（更高的RNA水平）。下调形容在一个样品（例如，肿瘤组织）中，观察到一 个基因与另一个基因（通常是对照样品中的健康组织）相比，其具有更低的表达（更低的 RNA水平）。
[0028] 用来测量RNA丰度的常规技术是RT-qPCR，其在实时定量PCR(qPCR)之后进行逆 转录（RT)。逆转录首先从RNA生成DNA模板。这个单链模板称为cDNA。然后将该cDNA模 板在定量步骤中进行扩增，在扩增期间，由标记的杂交探针或嵌入染料发出的荧光随着DNA 扩增步骤的进程而变化。定量PCR产生了对原始RNA拷贝的增加或减少进行测量的方法， 并且其已经用于试图界定与可比较的正常组织相比，肿瘤组织中的基因表达的变化（Nolan T，等Nat Protoc 1:1559-1582,2006 ;Paik S.The 0ncologistl2:631_635,2007 ;Costa C， 等 Transl Lung Cancer Research 2:87_91，2013)〇
[0029] 通过下一代测序（NGS)技术而变为可能的大规模平行测序是对组织样品中RNA 转录本进行计算的另一条途径，并且RNA-seq也是利用了该技术的方法。目前它是用来对 转录组进行分析的最有力的分析工具，该分析包括在不同生理条件之间基因表达水平的差 异、或在发育期间或疾病进程期间发生的变化。具体地，RNA-seq能够用来研宄例如基因表 达改变、选择性剪切事件、等位基因-特异性基因表达、以及包括基因融合事件、新转录本 和RNA编辑在内的嵌合转录本等现象。但是，目前在诊断领域尚没有方法能够使用RNA-seq 对多种特异性RNAs进行精确和可重复的定量的可信赖的操作。
[0030] 为什么检测多种生物标志物是重要的？
[0031] 在诊断或预断的检测中，使用多种生物标志物比使用单一生物标志物更优，其原 因如下：
[0032] 每一个个体肿瘤在关于其基因组、转录组和蛋白组的所有的不同方面均是异质性 的；
[0033] 在组织中通常能够发现多种肿瘤病灶；
[0034] 一种单一生物标志物不能使得对不同致死现象、侵袭性或特异性的肿瘤进行区 分；
[0035] -种单一生物标志物可能受治疗方案或其他的环境性作用的影响；
[0036] -种单一生物标志物可能受作为疾病进程一部分的场效应或肿瘤自己的场效应 的影响；以及
[0037] -种单一生物标记物可能在特定族群中效果欠佳。
[0038] 为什么RT-qPCR不能进行多种生物标志物的精确检测？
[0039] RT-qPCR是一项耗时的技术，因为其只能每次对单个基因进行表达差异测定，其不 能在同一时间对多种生物标志物同时进行对比/评估。
[0040] 在不同实验中比较基因的表达水平往往是困难的，并且这可能需要不适用于整合 到诊断中的复杂的标准化方法。
[0041] RT-qPCR不能对下调的基因进行精确的检测，因为与基于NGS的方法相比，该方法 受其荧光检测范围的限制。这就造成对低和/或高丰度的基因进行检测存在问题。通常这 些很难测量其差异表达的转录本，才是最具有诊断和/或预测价值的。RT-PCR不能进行多 路复用（multiplexing)，这造成每一个RNA生物标记物的费用增加，并且因此造成诊断检 测的总费用也增加。
[0042] 因此，在本领域中，仍存在能够精确检测前列腺癌的方法的需求。
【发明内容】
[0043] 本发明提供了一种用于检测客体中病症的存在和发展进程的方法。该方法使用修 饰的RNA-seq技术，以确定与健康对照相比，客体中病症特异性的一种或多种RNA生物标志 物（也称为基因转录本生物标志物）的相对频率。使用本发明的方法进行的特异性组合的 RNA生物标志物的表达水平的相对频率的测定，其也可以用于确定病症的类型和/或分期， 以及用于监视病症的发展进程和/或治疗效果。能够使用本发明的方法进行诊断和监视的 病症包括，但不仅限于例如前列腺和乳腺癌等的癌症。
[0044] 利用本发明的方法，能够使用称为多路复用的过程对多种RNA生物标志物的频率 进行同时测定。多路复用是对多种生物标志物具有特异性的寡核苷酸进行一起扩增，以生 成一组扩增子的过程。多路复用的优点是它能够在一或少量试管中，对多种RNA生物标志 物进行同时检测，由此实现如下情况：
[0045] 减少了费用；
[0046] 减少了所需的组织的量；
[0047] 由于更少的亲手操作从而增加了可重复性水平；
[0048] 减少了与设置相关的时间；以及
[0049] 增加了通量。
[0050] 更具体地，本发明的方法在RNA-seq操作的特定步骤中，使用了对已知与例如前 列腺癌的病症的存在和/或进程相关的RNA生物标志物具有特异性的寡核苷酸，从而选择 性地鉴定RNA生物标志物的cDNA，并且将在前列腺癌供体和健康的供体之间的表达的相对 频率进行比较，以及对该病症不同分期之间的表达差异进行界定。
[0051] 在常规的RNA-seq方法中，每一个转录本的实际表达频率针对了整个基因组进行 确定。这些频率可能由于cDNA生成的效率的差异和后续对每一个转录本的PCR扩增步骤 的差异而存在偏差。发明人相信本发明方法通过确定相对的、而不是实际的RNA生物标志 物的表达频率，从而避免了这些偏差。只要这些偏差相对于所做的对比是中性的，则它们是 不相关的。前列腺癌特异性的RNA生物标志物的表达频率的相对变化使得能够进行前列腺 癌检测、将前列腺癌与中度前列腺肥大（BPH)和前列腺炎进行区分、以及在可能产生低水 平PSA的前列腺癌的无症状男性中高敏感度和特异性地进行前列腺癌检测。在某些实施方 案中，本发明方法测定RNA生物标志物表达频率的改变，从而将较不可能发展为致命疾病 的发展进程缓慢的癌症，与危及生命且需要治疗的更具侵袭性的前列腺癌形式之间进行区 分。
[0052] 在一个方面中，本发明提供了一种用于检测客体中的病症的存在的方法，该方法 包括以下步骤：(a)使用RNA测序确定从客体中取得的生物样品中的至少一种RNA生物标 志物的表达的相对频率；和（b)将所述生物样品中的至少一种RNA生物标志物的表达的相 对频率与规定的阈值进行比较，其中，增加的或减少的生物样品中的至少一种RNA生物标 志物的表达的相对频率，其指示客体中病症的存在。在一个相关的方面中，本发明方法包括 如下步骤：(a)确定生物样品中多种RNA生物标志物的表达的相对频率；和（b)将所述生物 样品中多种RNA生物标志物的表达的相对频率与规定的阈值进行比较，其中，增加的或减 少的生物样品中的至少两种过更多种RNA生物标志物的表达的相对频率，其指示客体中病 症的存在。
[0053] 在一个实施方案中，所述至少一种RNA生物标志物的表达的相对频率通过以下步 骤进行确定：(a)从生物样品中分离总RNA ; (b)使用对该至少一种RNA生物标志物具有特 异性的第一寡核苷酸引物，从总RNA中生成第一 cDNA链；（c)合成第二cDNA链以提供双链 cDNA(dsDNA) ; (d)在所述双链cDNA中添加至少一种测序衔接子；（e)扩增所述双链cDNA以 从所述双链cDNA中提供cDNA文库；以及（f)对所述cDNA文库进行测序，并确定所述至少 一种RNA生物标志物的表达的相对频率。任选地，该方法还包括以下步骤：（i)在步骤（b) 之前从总RNA中去除rRNA ; (ii)在步骤（c)之后和步骤（d)之前，末端修复所述双链cDNA， 并且在该双链cDNA的3'末端添加突出的（overhanging)腺嗓呤（A)碱基；和/或（iii) 在步骤（e)之后和步骤（f)之前，在所述cDNA文库中对所述cDNA进行纯化和，任选地，进 行尺寸筛选。
[0054] 在一个相关的实施方案中，该方法在步骤（b)之后和步骤（d)之前进一步包括以 下选择步骤：通过使用对该至少一种RNA生物标志物具有特异性的寡核苷酸引物对的聚合 酶链式反应（PCR)，或通过标准方法，来合成cDNA。在一些实施方案中，引物对中的其中一 个寡核苷酸与用于生成第一 cDNA链的寡核苷酸引物相同。
[0055] 在进一步的实施方案中，所述至少一种RNA生物标志物的表达的相对频率通过以 下步骤进行确定：（a)从生物样品中分离总RNA ; (b)从总RNA中生成第一 cDNA链；（c)通过 使用了对所述至少一种RNA生物标志物具有特异性的寡核苷酸引物对的聚合酶链式反应， 来扩增cDNA，以提供经过扩增的双链cDNA ; (d)在所述经过扩增的双链cDNA中添加至少一 种测序衔接子；（e)使用对所述至少一种测序衔接子具有特异性的引物对所述经过扩增的 双链cDNA进一步扩增，以提供cDNA文库；以及（f)对所述cDNA文库进行测序，并确定所述 至少一种RNA生物标志物的表达的相对频率。任选地，该方法还包括以下步骤：（i)在步骤 (b)之前从总RNA中去除rRNA ; (ii)在步骤（c)之后和步骤（d)之前，末端修复所述双链 cDNA，并且在该双链cDNA的3'末端添加突出的腺嘌呤（A)碱基；和/或（iii)在步骤（e) 之后和步骤（f)之前，在所述cDNA文库中对所述cDNA进行纯化和，任选地，进行尺