寸筛选。
[0056] 在一些实施方案中，本发明方法包括确定对应于从表1、2和3列举的生物标志物 所组成的组中选择的寡核苷酸生物标志物的多种RNA生物标志物的表达水平。能够用于本 发明方法的寡核苷酸引物包括，但不仅限于SEQ ID N0 :76-232和293-326序列中提供的引 物。在一些实施方案中，本发明方法包括对包含了对应于本文所示的SEQ ID N0 :1-75和 235-287的DNA序列的RNA序列或其变体的RNA生物标志物的表达的相对频率进行检测。 本领域技术人员能够理解本发明所述的RNA生物标志物的RNA序列除了其胸腺嘧啶（T)残 基替换为尿嘧啶（U)残基，其序列与本文所述的cDNA序列相同。
[0057] 在另一个方面中，本发明提供了一种寡核苷酸引物，该引物包含、或由从SEQ ID NO :76-232和293-326构成的组中选择的序列或其变体所组成。在一些实施方案中，该寡 核苷酸引物的长度少于或等于30个核苷酸。本发明所述的寡核苷酸引物能够有效地用于 使用本领域技术人员公知的包括实时定量PCR或小规模寡核苷酸微阵列的方法，以诊断前 列腺癌的存在、和/或监视其发展进程的方法中。
[0058] 能够有效地用于本发明方法的生物样品包括但不仅限于尿液、血液、血清、细胞 系、外周血单核细胞（PBMCs)、活体检测组织（biopsy tissue)以及前列腺切除组织。
[0059] 简要【附图说明】
[0060] 图1示出本发明方法中所使用的常规RNA-seq技术的四种改进技术。
[0061]
[0062] 本文所使用的术语"生物标志物"，指的是与生物学变化定量地或定性地相关的分 子。生物标志物的实例包括多肽、蛋白质、多肽或蛋白质的片段；例如基因产物、RNA或RNA 片段等的多核苷酸；以及其它身体代谢物。
[0063] 本文中所使用的术语"RNA生物标志物"或"基因转录本生物标志物"，指的是与生 物学改变定量地或定性地相关的基因转录所生成的RNA分子。
[0064] 本文中所使用的术语"对应于DNA序列的RNA序列"，指的是除了其所有的胸腺嘧 啶（T)残基均替换为尿嘧啶（U)残基之外，与该DNA序列相同的一个序列。
[0065] 本文中所使用的术语"对生物标志物具有特异性的寡核苷酸"，指的是与多核苷酸 生物标志物或多核苷酸编码的多肽生物标志物特异性地杂交的寡核苷酸，并且该寡核苷酸 不与非相关的多核苷酸显著地杂交。在一些实施方案中，该寡核苷酸与基因、基因片段或基 因转录本杂交。在具体的实施方案中，该寡核苷酸在严格条件下与感兴趣的多核苷酸杂交， 该严格条件为例如在6X SSC，0. 2% SDS的溶液中预洗；在65°C下，6X SSC，0. 2% SDS溶液 中过夜杂交；然后在65°C下，IX SSC，0. 1 % SDS溶液中洗涤两次，每次30分钟，以及在65°C 下，0. 2X SSC，0. 1% SDS溶液中洗涤两次，每次30分钟，但该严格条件不仅限于此。
[0066] 本文所使用的术语"寡核苷酸引物对"，指的是在同源RNA生物标志物上跨内含子 的一对寡核苷酸引物。
[0067] 本文所使用的术语"多核苷酸"，指的是脱氧核糖核酸或核糖核酸碱基的单链或双 链聚合物，并且其包含DNA和对应的包括hnRNA、mRNA、和非编码RNA的RNA分子、分子、有 义链和反义链、并且包括cDNA、基因组DNA和重组DNA、以及全部地或部分地合成的多核苷 酸。hnRNA分子包含内含子和与DNA分子以大致一对一的方式相对应。mRNA分子与切除了 内含子的hnRNA和DNA分子相对应。非编码RNA是不翻译成蛋白质的功能性RNA分子，尽 管某些情况下非编码RNA也能够编码，反之亦然。
[0068] 在本文使用的术语"客体"，指的是动物、优选地指人类，其可能患有或不患有例如 前列腺癌的病症。特别地，术语"客体"和"患者"在指人类客体的情况下在本文中可以互 换使用。
[0069] 在本文中使用的术语"健康客体"指的是不患有感兴趣的病症的客体。
[0070] 在本文中使用的与前列腺癌相关的术语"健康男性"，指的是血清中具有不可检测 的PSA水平或非-上升的达lng/ml的PSA水平，在进行DRE检测之后没有显示前列腺异常 的证据，以及没有前列腺病症临床症状的男性。
[0071] 在本文中使用的与前列腺癌相关的术语"无症状男性"，指的是具有认为能够指示 前列腺癌的高于4ng/ml的血清PSA水平，但是其DRE检测结果不确定，并且没有临床疾病 症状的男性。
[0072] 术语"中度前列腺肥大"(BPH)指其前列腺的表皮细胞非-恶性生长的一种前列腺 疾病，以及术语"前列腺炎"指前列腺的另一种前列腺性疾病，通常其由于前列腺的细菌感 染所引起。BPH和前列腺炎均能够导致增加的PSA水平。
[0073] 本文中使用的术语"转移性前列腺癌"，指的是扩散到前列腺之外的例如淋巴结或 骨等特定位点的前列腺癌。
[0074] 本文中所使用的术语"活体检测组织（biopsy tissue)"，指的是为了确定样品是 否包含癌化组织，而从客体中取出的组织（如，前列腺组织）样品。然后对该活体检测组织 进行癌症存在或不存在的检查（如，通过显微镜检查）。
[0075] 本文中所述的术语"前列腺切除（prostatectomy) "，指的是手术去除前列腺。
[0076] 本文中所述的术语"样品"是取其最广义的解释，从而包括了从任何来源获得的样 品、样本或培养物。生物样品包括血液产物（如血小板、血清和全血）、尿液、唾液等。生物 样品还包括例如活体检测组织或病理学组织等的组织样品，该样品之前已经固定处理（如 福尔马林、急冻、细胞系处理等处理）。
[0077] 本文中所使用的术语、RNA生物标志物的"表达规定的阈值"指的是在对应的对照 /正常样品中，或从例如不患有前列腺癌的男性的正常的、或健康的客体中所获得的对照/ 正常的样品的组中，相同的RNA生物标志物的表达水平。
[0078] 本文中所使用的术语、在检测的生物样品中的RNA生物标志物的"改变的表达频 率"，指的是低于或高于对照样品中相同的RNA生物标志物的表达规定的阈值的频率，并且 因此涉及较高的（增加的）或较低的（减少的）表达水平。
[0079] 在本文中所使用的术语"表达的相对频率"，指的是相对于对应的对照/正常样品 中，或从（正常的、或健康的客体例如不患有前列腺癌的男性）中获得的对照/正常的样品 的组中的相同的RNA生物标志物的表达频率，在检测的生物样品中的RNA生物标志物的表 达频率。在优选的实施方案中，该RNA生物标志物的表达频率以内源参考转录本的频率为 基准进行标准化。
[0080] 本文所使用的术语用于例如前列腺癌的病症的"预测"或"提供预测"，指的是提供 在客体的将来健康（如转移的风险）中，与前列腺癌的存在（如，通过诊断方法确定）的可 能的影响相关的信息。
[0081] 详细说明
[0082] 根据以上概述，本发明涉及用于检测客体中例如前列腺癌的病症的存在或缺失、 确定该病症的分期和/或该病症的表型、监视该病症的发展进程、和/或通过确定从该客体 获取的生物样品中的特异性RNA生物标志物的表达频率从而监视该病症的治疗的方法。本 发明方法使用一种或多种标准RNA-seq操作的改进技术。RNA-seq是一个相对较新的技术， 其已经用于全转录组的大规模测序，并且该技术具有比例如微阵列方法等的其它用于转录 组测序的方法更为显著的优点，该优点包括低水平的背景噪音、能够检测低表达水平的能 力、能够检测新突变和转录本的能力、以及使用相对较小剂量RNA的能力（关于RNA-seq的 综述，见 Wang 等 Nat Rev Genet (2009) 10:57-63)。
[0083] 本发明方法使用了对一种或多种RNA生物标志物具有特异性的寡核苷酸与 RNA-seq技术相结合，来进行定向测序，并且从而确定RNA生物标志物的表达的相对频率。 该方法具有比其它典型地用来确定多核苷酸生物标志物的表达水平的技术更为显著的优 点，该优点包括改进的精确度、可重复性、速度、以相对较低的费用轻松地确定大量样品中 的多种RNA生物标志物的表达频率的能力、以及鉴定新突变和转录本的能力。
[0084] 在具体的实施方案中，该方法使用了对从表1、2、3中所示的生物标志物中选择的 一种或多种生物标志物具有特异性的寡核苷酸。
[0085] 在一个实施方案中，本发明方法包含确定选自从客体中获取的生物样品中的SEQ ID NO :76-223和293-326序列组成的组的至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九 种、十种或更多种的RNA生物标志物的表达水平的相对频率，并且将该表达水平的相对频 率与规定的阈值进行比较。
[0086] 本发明方法能够用来诊断患有早期前列腺癌的客体、已经接受手术治疗（根治性 前列腺切除）以去除前列腺的客体、已经接受针对前列腺癌的放射治疗的客体、正在进行 或已经完成雄激素消除治疗的客体、已经对激素消除治疗产生抗性的客体、和/或正在进 行或已经完成化疗的客体中前列腺癌的存在。
[0087] 在具体的实施方案中，本发明所述的该RNA生物标志物在患有前列腺癌的客体中 以比正常的、健康的个体中的平均水平高或低至少两倍、或比正常的、健康的个体中的平均 水平高或低至少两个标准偏差，或者比表达规定的阈值高或低至少两倍、或比表达规定的 阈值高或低至少两个标准偏差的水平存在。
[0088] 本发明公开的所有生物标志物和寡核苷酸均是经分离和纯化的，这些术语是本领 域的常用术语。优选地，该生物标志物和寡核苷酸的纯度至少为80%、更优选地为纯度至少 为90 %、并且最优选地纯度至少为99 %。
[0089] 在具体实施方案中，本发明方法中使用的寡核苷酸与本文所述的多核苷酸生物标 志物的变体特异性地杂交。本文所使用的，术语"变体"理解为是与特异性鉴定的序列所 不同的核苷酸或氨基酸序列，其中，删除了、替换了、或添加了一或多个核苷酸或氨基酸残 基。变体可能是天然产生的等位基因变体，或是非天然产生的变体。变体序列（多核苷 酸或多肽）优选地表现为与本文所述的序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、 98%、99%的序列同一性。同一性百分比通过以下步骤进行确定：比对下文所述的待对比 的两个序列、确定比对部分中的相同残基的数量、将该数量除以生成的序列（inventive sequence)中的总残基数，并且将结果乘以100。
[0090] 除了呈现列举的序列同一性水平之外，本发明的生物标志物的变体优选的是，其 本身在患有前列腺癌的客体中以比在正常的、健康的个体中的表达水平更高或更低的频率 进行表达。
[0091]多肽或多核苷酸序列可以进行比对、并且在特定的区域内的相同的氨基酸或核 苷酸的百分比可以针对其它多肽或多核苷酸序列使用公众可获得的计算机算法进行确 定。多核苷酸或多肽序列的同一性百分比通过以下方法进行确定：使用合适的例如分别是 BLASTN或BLASTP的算法，设置默认参数，将多核苷酸和多肽序列进行比对；将比对部分的 相同核苷酸或氨基酸的数量进行鉴定；将该相同核苷酸或氨基酸的数量除以本发明的多核 苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸总数量；并且然后乘以100,从而确定同一性百分比。
[0092] 用于比对和鉴定多核苷酸序列同一性的两个实例性算法是BLASTN和FASTA算 法。多肽序列的比对和同一性可以使用BLASTP算法进行检测。BLASTX和FASTX算法将 翻译为全部阅读框架（reading frame)的核苷酸查询序列与多肽序列进行对比。Pearson 和 Lipman，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448,1998;和 Pearson, Methods in Enzymol. 183 :63-98, 1990中对FASTA和FASTX算法进行了阐述。FASTA软件包可以从 University of Virginia, Charlottesville, Va 22906-9025 获得。FASTA 算法，设为文档 中所述的默认参数并由算法进行分布，其可用于多核苷酸变体的确定。由算法分布的FASTA 和FASTX Version 2. Ox的说明文档（readme files)描述了该算法的使用以及默认参数。 [0093] BLASTN软