用于检测pcv2的融合蛋白、制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及PCV2病毒防治诊断领域，具体涉及用于检测PCV2的融合蛋白、制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是作为一种猪肾细胞系PK-15培养污染物而被发现的，其基因组为共价闭合的单股环状DNA分子，基因组全长约1.7kb。PCV是迄今为止人们发现的最小动物病毒，病毒粒子表面无囊膜，呈二十面体对称，粒子直径在17-20nm之间。根据PCV的致病性、血清型和基因型特点，将其分为非致病性的PCVl和致病性的PCV2(猪圆环病毒2型)两种类型。其中，PCV2是引起猪圆环病毒病(PCVD)的主要病原。PCV2主要侵害免疫系统，降低机体的抵抗力和免疫应答反应，导致被感染猪产生免疫抑制和其他病原微生物的继发感染，从而使死亡率明显上升。该病除能引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)之外，还是猪皮炎与肾病综合征(porcine dermatitis nephropathy syndrome, F1DNS)、猪呼吸道综合征(porcine respiratory disease complex, PRDC)、增生性坏死性肺炎(proliferativenecrotizing pneumonia, PRDC)、新生仔猪先天性震颤、怀孕母猪繁殖障碍等疾病的重要病原。
[0003]猪圆环病毒病一年四季均可发生，无严格的季节性，猪是PCV2的天然宿主，各种品种的猪，不论大小均可发病，主要感染5-12周龄猪。病猪和带毒猪是猪圆环病毒病的主要传染源，可以水平传播，也可通过感染的怀孕母猪通过垂直传播的方式传染仔猪。自1991年在加拿大首次报道猪群中存在PMWS以来，相继在美国、欧洲、东南亚等地发现猪群中有PMWS存在，并分离到PCV2。我国为养猪大国，PCV2感染也相当严重，自2000年郎洪武等报道在国内猪群中存在PCV2感染以来，PCV2引起的疾病在我国流行一直处于上升趋势。有研宄显示，从2008年以来中国大部分省市PCV2抗体阳性率在25.9%到63.38%之间。血清学调查结果说明PCV2在我国猪群中广泛的流行。正因为PCV2能使感染猪机体免疫功能受到损害，机体抵抗力明显下降，易造成并发或继发感染而使病情加重，造成极大的经济损失。PCV2已成为严重威胁我国及世界其他国家和地区猪群健康的重要致病因素之一，阻碍了养猪业的健康发展，严重影响了世界各国的养猪生产水平。
[0004]及时、准确的对PCV2进行检测，是诊断、预防和控制PCVD的前提。目前PCV2的检测技术包括病毒的分离、电子显微镜观察、聚合酶链式反应(PCR)、免疫过氧化物单层培养法、酶联免疫法、间接免疫荧光法、原位杂交及核酸探针杂交实验等方法。迄今为止，尽管有多种检测PCV2的方法，但是这些检测方法要求较高，需要配备专门的仪器和专业技术人员，检测成本昂贵，而且耗时相对较长，这极大地限制了其在基层单位的应用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供用于检测PCV2的融合蛋白，该融合蛋白在与人O型血红细胞和PCV2病毒同时作用时，会发生肉眼可观察到的凝集现象，因此可以用于快速检测PCV2。
[0006]本发明的另一目的是提供所述融合蛋白的制备方法，由于该融合蛋白分子量较小、且易于原核系统的表达，所以产量较高。
[0007]本发明的再一目的是提供上述融合蛋白在制备检测PCV2试剂盒方面的应用，操作简单、灵敏度高且特异性强，能够满足基层现场使用快速、简便的要求。
[0008]本发明的目的采用如下技术方案实现。
[0009]一种用于检测PCV2的融合蛋白，是将抗人红细胞H抗原纳米抗体和抗PCV2纳米抗体通过Linker序列连接而成。
[0010]优选的技术方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo:2所示。
[0011]本发明还要求保护所述融合蛋白的编码基因。
[0012]优选的技术方案中，所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNo:1所示。
[0013]本发明还要求保护含有所述基因的重组载体；优选的技术方案中，所述重组载体是将权利要求3或4所述基因插入表达载体所得；所述表达载体优选为pET-His。
[0014]另外，本发明还要求保护含有所述基因的重组菌，是将含有所述基因的重组载体导入宿主菌中得到的重组菌；所述重组载体是将所述基因插入表达载体PET-His所得。
[0015]本发明还要求保护制备所述融合蛋白的方法，诱导所述重组菌表达融合蛋白，收集所述融合蛋白的包涵体，复性所述融合蛋白。
[0016]最后，本发明还要求保护所述融合蛋白在制备检测PCV2试剂盒方面的应用。
[0017]本发明用于检测PCV2的融合蛋白，在与人O型血红细胞和PCV2病毒同时作用时，会发生肉眼可观察到的凝集现象，因此可以用于快速检测PCV2。本发明用于检测PCV2的融合蛋白可以单独与人O型血红细胞和PCV2病毒结合，但不会发生凝集现象。
[0018]在本发明所述融合蛋白的制备方法中，由于该融合蛋白分子量较小、且易于原核系统的表达，所以产量较高。
[0019]上述融合蛋白可以应用于制备检测PCV2的试剂盒。采用该试剂盒检测PCV2，操作简单、灵敏度高且特异性强，能够满足基层现场使用快速、简便、成本低的要求。
【附图说明】
[0020]下面结合附图所示实施例，作进一步说明，但本发明保护范围不限于此实施例。
[0021]图1融合蛋白A的诱导表达验证SDS-PAGE电泳图，M_Mark，泳道1-未诱导BL21-A全菌；泳道2-诱导后BL21-A的全菌。
[0022]图2重组融合蛋白A的双功能特性验证。
[0023]图3重组融合蛋白A的特异性验证。
[0024]图4重组融合蛋白A用于检测PCV2的灵敏性验证，其中第一、二排中，各列孔上方数字表示该孔内病毒的稀释度；第三排中均为对照。
[0025]图5重组融合蛋白B的诱导表达验证SDS-PAGE电泳图，M-Mark,泳道1-未诱导BL21-B全菌；泳道2-诱导后BL21-B的全菌。
【具体实施方式】
[0026]溶液I:IMTris-HCl (ρΗ8.5-9.0)缓冲液中含有 ImM EDTA、50mM NaCl 和0.5% (质量百分浓度)Triton X-100。
[0027]溶液II:1M Tris-HCl (pH8.5-9.0)缓冲液中含有 ImM EDTA、50mM NaCl、3M 尿素和
0.5% (质量百分浓度)Triton X-1OO0
[0028]溶液III:1M Tris-HCl (pH8.5-9.0)缓冲液中含有 ImM EDTA、50mM NaCl、6M盐酸胍、5% (质量百分浓度)甘油和5mMDTT(二硫苏糖醇)。
[0029]TGE Buffer:50mM Tris-HCl (ρΗ7.9)缓冲液中含有 0.5mM EDTA、50mM NaCl 和 5%(质量百分浓度)甘油。
[0030]0.1M、ρΗ7.4 的 PBS 缓冲液:称取 11.65g Na2HPO4,1.65g KH2PO4,9g NaCl，去离子水溶解后用0.1M氢氧化钠溶液或盐酸调pH值到7.4，定容至1000ml。
[0031]实施例1用于检测PCV2的融合蛋白的制备
[0032]1.融合蛋白基因的设计与合成
[0033]人工设计分子量较小的用于检测PCV2的融合蛋白A。该融合蛋白由抗人红细胞H抗原纳米抗体和抗PCV2纳米抗体通过Linker序列连接而成。融合蛋白A的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。设计融合蛋白A的编码基因，核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。融合蛋白A的编码基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0034]另选抗人红细胞H抗原抗体和抗PCV2抗体通过Linker序列连接，形成分子量较大的融合蛋白B。融合蛋白B的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示，编码基因如SEQ ID No:3所示。融合蛋白B的编码基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0035]2.融合蛋白原核表达载体的构建及诱导表达
[0036]将融合蛋白A的基因片段(核苷酸序列如SEQ ID No:1所示)采用Nde I和HindIII进行双酶切，酶切体系:Nde I I μ 1、Hind III I μ 1、10XK buffer 2 μ 1、融合蛋白A的基因片段6μ1、ddH20 10μ1?酶切结束后进行核酸电泳，将大小约为790bp的目的基因胶回收，克隆至原核表达载体ρΕΤ-His中，转化DH5a感受态细胞。