检测细胞外基质mmp13的bret探针、基因、表达载体和构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种检测细胞外基质MMP13的BRET探 针、基因、表达载体和构建方法。
【背景技术】
[0002] 基质金属蛋白酶（Matrixmetalloproteinases，MMPs)是一组依赖Zn2+依赖的 细胞外酶，广泛存在于各结缔组织中，在细胞外基质的降解中起重要作用。其中，MMP13又 称为胶原酶-3,它是基质金属蛋白酶（MMPs)家族中重要的降解酶，能够特异性地降解胶原 分子中三维螺旋结构的酶，其对于H型胶原的降解效率是所有基质蛋白酶中最高的。
[0003]MMP13主要由滑膜细胞、软骨细胞、中性粒细胞等产生，主要通过破坏H型胶原之 间的肽链而达到裂解软骨的目的，因此在软骨中MMP13表达水平升高是导致骨关节炎（OA) 节软骨退变的主要因素之一。并且进一步在反复的验证之后，骨关节炎患者中MMP13蛋白 比正常人高十倍，且表达量随着骨性关节炎的进展而逐渐增加，MMP13逐渐成为OA诊断和 治疗的一项生理性指标，并且可能为OA的治疗提供一个新的靶点。
[0004] 而现有的MMP13的检测方法，最常用的是双抗体夹心法测定，受限于抗体的特异 结合性以及检测灵敏度的限制，且操作步骤过程繁琐，并且无法检测到活性MMP13的含量； 并且检测的过程中都需要损伤细胞，不适用于活体的蛋白酶的实时动态监测。
【发明内容】
[0005] 本发明实施例的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种能够在真核细胞膜 表面表达的用于检测细胞外基质MMP13的BRET探针、基因、表达载体和构建方法。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：
[0007] 一种检测细胞外基质MMP13的BRET探针，包括BRET生物发光供体和BRET受体荧 光蛋白，所述BRET生物发光供体和BRET受体荧光蛋白之间通过MMP13特异性识别降解的 多肽底物连接；
[0008] 其中，所述BRET生物发光供体为具有序列表SEQ.ID.No. 1的氨基酸序列的Rluc8 蛋白，所述BRET受体荧光蛋白为黄色荧光蛋白。
[0009] 本发明构建的上述探针，探针自身的供体和受体荧光蛋白之间通过一可被MMP13 特异性识别降解多肽底物连接产生BRET，当多肽底物被MMP13特异性识别降解之后，BRET 现象消失，只能检测到供体蛋白底物发出的发射光产生荧光信号变化，从而实现检测目的； 并且RlucS蛋白的C端融合了含有血小板源生长因子受体（PDGFR)的跨膜区域，因此能锚 定在细胞膜的表面，从而可以在不损伤细胞的情况下进行活体检测，同时还具有更高的灵 敏度。
[0010] 本发明进一步还提出编码上述检测细胞外基质MMP13的BRET探针的基因，以及该 编码基因在真核细胞内进行表达的表达载体；其中，
[0011] 编码基因包括顺次连接的BRET生物发光供体编码基因、MMP13特异性识别降解的 多肽底物编码基因和BRET受体荧光蛋白编码基因；所述BRET生物发光供体编码基因为具 有序列表SEQ.ID.No. 3碱基序列的Rluc8蛋白编码基因。
[0012] 针对本发明中真核表达载体的实施，本发明进一步还提出上述表达载体的构建方 法，包括如下步骤：
[0013] 将具有序列表SEQ.ID.No. 3的碱基序列的Rluc8蛋白编码基因克隆至质粒 pDisplay的多克隆位点，得到Rluc8表达质粒；
[0014] 将黄色荧光蛋白的编码基因克隆至所述Rluc8表达质粒中与Rluc8蛋白编码基因 末端衔接，形成荧光融合体表达质粒；
[0015] 将具有序列表SEQ.ID.No. 4碱基序列的多肽底物编码基因插入至所述融合体表 达质粒中RlucS蛋白编码基因和黄色荧光蛋白的编码基因之间。
【附图说明】
[0016] 下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[0017] 图1为本发明实施例用于检测细胞外基质的MMP13的BRET探针示意图；
[0018] 图2为图1的BRET探针中多肽底物被MMP13特异性识别降解BRET小时示意图；
[0019] 图3为本发明实施例质粒pDisplay克隆Rluc8蛋白编码基因后的质粒图谱；
[0020] 图4为图3中质粒进一步克隆黄色荧光蛋白编码基因后的质粒图谱；
[0021] 图5为图4中质粒进一步插入多肽底物编码基因后的质粒图谱；
[0022] 图6为激光共聚焦显微镜下的细胞膜表面、单独的BRET探针和BRET探针结合表 达定位于细胞膜上的荧光对照图；
[0023] 图7为BRET探针转染后，加入不同MMP13浓度处理后软骨细胞后荧光结果对照 图；
[0024] 图8为采用FACS流式细胞仪用BRET探针检测MMP13活性中荧光位移发生改变产 生的荧光强度发生的位移改变。
【具体实施方式】
[0025] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不 用于限定本发明。
[0026] 本发明实施例提供一种用于检测细胞外基质的MMP13的BRET探针，其示意图可以 参见图1所示；包括BRET生物发光供体1和BRET受体荧光蛋白2,且BRET生物发光供体1 和BRET受体荧光蛋白2之间通过MMP13特异性识别降解多肽底物3连接；
[0027] 其中BRET生物发光供体为具有序列表SEQ.ID.No. 1的氨基酸序列的Rluc8蛋白； BRET受体荧光蛋白为黄色荧光蛋白。
[0028] 本发明构建的上述探针，基于生物发光共振能量转移（BRET)机理进行，BRET本身 是一种非辐射的能量从供体传递到受体的转移过程；BRET需要由两个融合蛋白组成，一个 融合是提供能量的荧光素酶，另外一个融合能量接受能量的受体荧光蛋白，荧光素酶可以 由具有疏水性和膜渗透性的腔肠素来激活产生；当两个融合蛋白发生相互作用，并且距离 小于10nm，供体便会将自身发出能量转移到受体；如果这两种整合蛋白被剪切分离至距离 超过上述lOnm，如图2所示，则相互之间的BRET现象消失，不会发生作用，就仅仅只能检测 到供体蛋白底物发出的发射光。
[0029] 在本发明中，利用BRET的构建探针，将改造后的Rluc8蛋白（海肾荧光素酶突变 体）作为供体，同时以黄色荧光蛋白作为受体，使供体荧光素酶的发射光谱和受体蛋白激 发光谱间的重叠，增强BRET信号强度；同时采用MMP13特异性识别降解多肽底物将供体和 受体连接，使其产生BRET;并且当多肽底物被MMP13特异性识别降解后，BRET消失产生荧光 变化，根据荧光的变化情况即可计算得到MMP13的表达水平。
[0030] 同时在上述采用真核细胞表面展示荧光素酶BRET作为检测蛋白酶所引起BRET信 号构建的BRET探针，本发明中采用的上述RlucS蛋白的C端融合了含有血小板源生长因子 受体（PDGFR)的跨膜区域，因此它真核表达的蛋白能锚定在细胞膜的表面，从而可以在不 损伤细胞的情况下进行活体的检测。
[0031] 并且本发明中构建的上述BRET探针和FRET不同，其供体不需要外源光的活化，直 接加入底物便可以激活，这样可以避免了供体的光漂白和细胞自发荧光的问题，因此在测 定中不需要进行BRET的背景扣除；相比具有更高的灵敏度以及极低的内源背景。
[0032] 进一步在上述实施方式中，本申请中的MMP13特异性识别降解多肽底物，基于上 述供体和受体距离小于IOnm的要求，因此通常采用长度较小的寡肽链，并且基于特异针 对MMP13的作用的识别降解序列位点进行设计，多肽底物采用具有序列表SEQ.ID.No. 2氨 基酸序列的多肽序列，从序列表中可以看出，多肽底物的氨基酸序列为GPLGMRGL，具有8 个氨基酸的残基长度；使用中，相比其他的类型可降解寡肽在特异性的识别的灵敏度和被 MMP13降解的可降解性上，能有较高的保障。
[0033]同时进一步，基于供体和受体发出的荧光波长的重叠范围，受体的黄色荧光蛋白 选择选择黄色荧光蛋白YFP、cpYFP、cpVenus这三种荧光蛋白中的一种。由于探针中的 供体、受体和连接的底物多肽之间的连接，可以按照N端、C端衔接的方式进行，其中由于 RlucS蛋白的C端融合了含有血小板源生长因子受体（PDGFR)的跨膜区域用于锚定细胞膜， 因此可以从RlucS蛋白的N端开始与多肽底物氨基酸序列的C端衔接的顺序进行。
[0034] 采用本发明的上述BRET探针通过真核细胞表面展示荧光素酶BRET作为检测蛋白 酶所引起BRET信号构建BRET探针，该探针可以在细胞水平上检测基质金属蛋白酶-13的 活性，提高了检测细胞外基质中蛋白质酶的准确性，作为检测真核细胞外基质中基质金属 蛋白酶-13的较为理想系统，可以为MMP13的生物学功能研宄奠定基础。
[0035] 基于上述构造的BRET探针，其本身的各个组成均为蛋白质或者肽段，因此实现其 蛋白的表达和制备，因此本发明还给出上述