嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域。利用基因工程技术获得编码嵌合抗原受体 h⑶19scFv-⑶8a-⑶28-⑶3e的融合基因，将该基因片段插入慢病毒表达载体，包装成慢 病毒，感染人T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体。这种嵌合抗原受体T细胞能够识别肿 瘤细胞表面的CD19,特异性杀伤CD19阳性的肿瘤细胞，用于肿瘤的治疗。
【背景技术】
[0002] 肿瘤特异性T细胞介导的免疫反应是机体清除肿瘤细胞的主要手段，在正常的免 疫反应中，抗原特异性T细胞需要至少两个信号的刺激才能进行增殖并对抗原产生免疫应 答。第一个信号是T细胞受体（TCR)及MHC-I或II类分子识别肿瘤特异性抗原，第二个信 号是由T细胞与抗原提呈细胞（APC)或其它细胞表面的共刺激分子对所介导。肿瘤细胞通 过下调参与T细胞识别及抗原反应的分子表达、降低免疫原性等途径产生免疫逃逸，从而 使机体的免疫系统不能很好的清除肿瘤。
[0003] 研宄发现，以肿瘤特异性单克隆抗体的单链可变区（SCFv)取代TCR的a，0链可 变区，并将scFv直接和共刺激分子（如⑶28、4_1BB等）以及T细胞信号传导区域⑶3G连 接，形成嵌合抗原受体（CAR)表达于T细胞表面，可通过scFv识别肿瘤特异性抗原，直接产 生T细胞活化的第一、第二信号，促进T细胞活化、增殖，特异性杀伤肿瘤细胞。该过程主要 依赖CAR-T细胞表面的scFv对肿瘤抗原的特异性识别，免疫反应的特异性和杀伤性较强。
[0004] 急性淋巴细胞白血病（ALL)、慢性淋巴细胞白血病（CLL)以及B细胞淋巴瘤的 临床治疗，目前以化疗、干细胞移植及生物治疗等为主，虽然可以取得一定的疗效，但复发 难治仍然是难以攻克的重点，肿瘤的细胞免疫治疗作为一种新的治疗策略，成为当今研宄 的热点。CD19几乎表达于所有的B细胞肿瘤细胞表面，而其他实质细胞和造血干细胞几 乎不表达，因此作为B细胞肿瘤抗原的特异性高。利用抗CD19scFv构建的嵌合抗原受体 h⑶19scFv-⑶8a-⑶28-⑶3G表达于T细胞表面，可使T细胞特异性杀伤⑶19阳性的肿瘤 细胞，国外已经有临床实验报道抗CD19-CAR-T细胞在B细胞肿瘤中的应用取得了较好的疗 效。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是，提供一种应用抗⑶19scFv构建出的抗⑶19嵌合 抗原受体（h⑶19scFv-⑶8a-⑶28-⑶3 〇，表达该嵌合抗原受体的T细胞也具有其独特 性，初步研宄其肿瘤特异性杀伤功能，以进一步探讨其在临床治疗中的应用。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种嵌合抗原受体 h⑶19scFv-⑶8a-⑶28-⑶3e，所述嵌合抗原受体由抗人⑶19单克隆抗体HI19a轻链和重 链可变区h⑶19scFv、人⑶8a铰链区、人⑶28跨膜区和胞内区、以及人⑶3G胞内区结构 串联构成；所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO. 1所示。
[0007] 所述嵌合抗原受体的核酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0008] 所述嵌合抗原受体含有针对人CD19抗原的单链抗体hCD19scFv，其氨基酸序列如 SEQIDNO. 3所示，该单链抗体的轻链和重链之间有个GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGly GlySerGlyGlyGlyGlySer连接肽。
[0009] 所述嵌合抗原受体含有针对人CD19抗原的单链抗体hCD19scFv，其核酸序列如 SEQIDNO. 4 所示。
[0010] 所述嵌合抗原受体以人CD8a铰链区、人CD28跨膜区和胞内区、以及人CD3G胞 内区串联而成的结构为信号传导结构域，其氨基酸序列如SEQIDNO. 5所示。
[0011] 所述嵌合抗原受体以人CD8a铰链区、人CD28跨膜区和胞内区、以及人CD3G胞 内区串联而成的结构为信号传导结构域，其核酸序列如SEQIDNO. 6所示。
[0012] 所述嵌合抗原受体的氨基末端含有一个CD8a信号肽，其氨基酸序列如序列表中 的SEQIDNO. 7 所示。
[0013] 所述嵌合抗原受体的氨基末端含有一个⑶8a信号肽，其核酸序列如SEQIDNO. 8 所示。
[0014] 所述的嵌合抗原受体h⑶19scFv-⑶8a-⑶28-⑶3G在制备嵌合抗原受体T细胞 及其在肿瘤治疗药物中的应用。
[0015] 本发明的有益效果是：本发明采用抗人CD19scFv基因序列（参考本发明人的专 利，专利号：ZL200610015650. 9)，将其进行密码子优化，从NCBIGenBank数据库中搜索到 人⑶8a信号肽基因、人⑶8a铰链区基因、人⑶28跨膜区和胞内区基因、以及人⑶3G胞 内区基因序列信息，全基因合成嵌合抗原受体h⑶19scFv_⑶8a-⑶28-⑶3G(h⑶19-CAR) 基因片段，插入到慢病毒表达载体P⑶H-EFl-MCS-T2A-copGFP(p⑶H-空载体）中，构成抗人 ⑶19-CAR表达质粒（p⑶H-CAR质粒），利用该质粒与慢病毒的包装质粒psPAX2和pMD2.G在 293T细胞中包装病毒，感染T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体。获得的CAR-T细胞在体 外与CD19阳性的肿瘤细胞Nalm-6共培养，通过流式细胞术检测肿瘤细胞残留水平、ELISA 方法检测共培养上清中的细胞因子水平以及CytoTox%K非放射性细胞毒性法检测CAR-T 细胞对Nalm-6细胞的杀伤活性，以证实该嵌合抗原受体修饰的T细胞对肿瘤细胞的特异性 杀伤作用。因此本发明所述的嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8a-CD28-CD3G可在肿瘤治疗 中得到应用。
【附图说明】
[0016] 图1为p⑶H-CAR慢病毒表达载体示意图。
[0017] 图2为p⑶H-CAR慢病毒表达质粒的部分测序结果峰值图。
[0018] 图3为荧光显微镜下观察慢病毒感染96h后T细胞的绿色荧光（GFP)表达情况。
[0019] 图4为流式细胞仪显示慢病毒感染96h后T细胞的GFP阳性率。
[0020] 图5A为流式细胞仪显示感染后⑶3阳性T细胞所占的比例。
[0021] 图5B为流式细胞仪检测感染后T细胞表面CAR蛋白表达情况。
[0022] 图6A为高效靶比例共培养条件下，靶细胞比例随时间的变化图。
[0023] 图6B为低效靶比例共培养条件下，靶细胞比例随时间的变化图。
[0024] 图6C为实验组靶细胞比例随时间变化的流式示意图。
[0025]图7A为实验组、对照组和单细胞组上清中TNF-a浓度比较。
[0026] 图7B为实验组、对照组和单细胞组上清中IL-2浓度比较。
[0027] 图7C为实验组、对照组和单细胞组上清中IFN-y浓度比较。
[0028] 图8为在不同效靶比例情况下，实验组和对照组的细胞毒性比较。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明：
[0030] 实施例I:h⑶19scFv_⑶8a-⑶28-⑶3G基因序列的确定
[0031] Ll从美国国立医学图书馆网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez) GenBank数据库中搜索到人⑶8a信号肽基因、人⑶8a铰链区基因、人⑶28跨膜区和胞内 区基因、以及人⑶3G胞内区基因序列。抗⑶19单链抗体（抗⑶19scFv)基因序列来自专 利（专利号：ZL200610015650. 9)，将其进行密码子优化，以保证在编码氨基酸序列不变的 情况下更适合人类细胞表达。
[0032] 各基因序列信息见SEQUENCELISTING(序列表SEQIDNO. 1-8)。
[0033] 1. 2将上述基因序列依次按人⑶8a信号肽基因、抗⑶19scFv、人⑶8a铰链区基 因、人CD28跨膜区和胞内区基因、以及人CD3G胞内区基因序列进行连接，并在头端引入 Kozac序列，在各序列连接处引入不同的酶切位点，形成最终完整的h⑶19-CAR基因序列信 息。
[0034] 实施例 2 :hCD19scFv-CD8a-CD28-CD3G表达质粒的构建
[0035] 2. 1全基因合成：
[0036] 全基因合成优化后的完整的hCD19-CAR序列，克隆到pCDH-EFl-MCS-T2A-copGFP 慢病毒表达载体（P⑶H-空载体）中，获得抗人⑶19-CAR表达质粒（p⑶H-CAR质粒）和含 有该质粒的DH5a菌液。质粒信息见图1。
[0037] 2. 2重组质粒的测序：
[0038] 将重组质粒送上海英骏生物技术有限公司进行测序，将测序结果与拟合成的 h⑶19-CAR序列比对以证实序列正确。测序引物为p⑶H-EFl-MCS-T2A-copGFP载体上的通 用测序引物：
[0039] Sense:5'ctccacgctttgcctgaccctgctt3'
[004