轻链可变区的序列示意图。
[0025] 图2 :抗-人R0R11G8单抗使用ClonePixFL进行半固体培养基单克隆筛选时的 荧光图片。
[0026] 图3与图4 :1G8_5C3流加培养工艺数据图表。
[0027] 图5与图6 :3F4_2C7流加培养工艺数据图表。
[0028] 图 7 :Anti-HumanRORlmAb 1G8 的SEC-HPLC分析谱图。
[0029] 图 8 :Anti-HumanRORlmAb 1G8 的SDS-PAGE电泳图。
[0030] 图 9 :Anti-HumanRORlmAb 3F4 的SEC-HPLC分析谱图。
[0031] 图 10 :Anti-HumanRORlmAb3F4 的SDS-PAGE电泳图。
[0032]用于专利程序的生物材料保藏：
[0033] 保藏日期：2015年04月16日；
[0034] 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC);
[0035] 保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所， 100101
[0036]保藏编号：CGMCCNo. 10583;
[0037] 分类命名：受体酪氨酸激酶样孤儿受体-1人乳腺癌细胞。
【具体实施方式】
[0038] 以下通过具体实施例详细说明本发明，旨在帮助阅读者更好地理解本发明的实质 和特点，不作为对本案可实施范围的限定。下列实施例中未注明具体条件的方法，按照所属 领域的常规操作进行。
[0039] 实施例1利用噬菌体展示技术从抗体库中筛选抗人R0R1单克隆抗体的可变区基 因
[0040]1. 1人源抗体库构建
[0041]人源抗体库构建按照Marks等人J.Mol.Biol.，222, 581-597;Hoogenboom和 Winte，J.Mol.Biol.，227,381-388;HaidarisCG等，JImmunolMethods. 2001Nov1； 257(1-2) :185-202;Griffiths，A.D?等EMB0J.，13,3245-3260(1994) ;Nissim，A?等EMB0 J.，13,692-698 (1994)中描述的方法构建人源抗体库。
[0042] 简而言之，从外周血淋巴细胞制备免疫球蛋白重链和轻链的基因，用PCR方法进 行体外扩增，并将其克隆到噬菌体载体，利用抗体分子片段在噬菌体表面呈现的特点，以人 R0R1蛋白（Cat#R01-H522y，ACR0BiosystemsInc)为抗原，筛选到相应的特异性抗体。
[0043] 1.2人源抗体库的筛选
[0044] 将复苏的抗体库菌液1. 5毫升加入新鲜LB培养基13毫升，在50毫升三角瓶中于 37°C恒温220RPM震荡培养14-18小时。收获菌液，并测定0D600值，此时0D600应为2-4之 间。将菌液转移至50ml离心管中，在高速低温离心机中（Eppendorf，5418R) 10000rpm、4°C 高速离心10min，转移上清至一个无菌的50毫升离心管中，此时检测噬菌体滴度，在2X1011 以上。
[0045]人R0R1 蛋白（Cat#R01_H522y，ACR0BiosystemsInc)为抗原，包被 25 毫升细胞培 养瓶，包被后的细胞瓶中加入不少于3X101(I噬菌体颗粒，37°C温育1小时。
[0046] 倒掉瓶中的液体，使用10毫升PBS(含1 %Tween-20)洗涤培养瓶10次。在培养 瓶中加入1毫升对数期的TG1细胞，37°C震荡培养16小时。重复进行4个循环。
[0047] 将上述获得的细胞稀释至100000细胞/毫升，然后在加入0. 1 %氨苄青霉素的 1. 5%琼脂平板上进行培养以获得单克隆。
[0048] 取上述平板上的克隆在96孔深孔板上进行培养，每孔一个克隆，共作480个克隆 (5块96孔板）。将上述深孔板在96孔板离心机上5000rpm离心20分钟，将上清转移到新 的无菌深孔板，封口后保藏于4°C备用。
[0049] 取96孔板5块，每孔中加入人R0R1蛋白（10微克/毫升）10微升常规包被后，分 别加入上述保存的上清10微升，37°C温育1小时后用含有1 %Tween-20的PBS洗涤20次。
[0050] 然后加入lylHRP标记的小鼠抗M13单抗（Abeamab50370)，37°C温育30分钟后 用 1 %Tween-20 的PBS洗涤 10 次。
[0051] 加入含有0. 025%DAB显色剂的PBS溶液200微升和1微升1 %的H202, 37°C温育 显色20分钟后在读板机上（ThermofisherMK3)读取595纳米处的光吸收。根据光吸收读 数确定显色反应强的孔，这些孔相对应的克隆即为亲和力较强的抗体可变区克隆。
[0052] 通过上述过程筛选出了 100个阳性克隆，ToplO最强的克隆的亲和力测定结果见 表1。根据读数确定其中亲和力最强两个克隆（克隆编号分别为1G8、3F4)，用于后续实施 例的研宄。
[0053]表1
【主权项】
1. 一种抗RORl的人源化单克隆抗体，该抗体具有重链可变区和轻链可变区，所述重链 可变区和轻链可变区各自具有3个互补决定区（CDR)，其中： 所述重链可变区的CDRl的氨基酸序列为SEQIDN0:21或SEQIDN0:27， 所述重链可变区的CDR2的氨基酸序列为SEQIDN0:22或SEQIDN0:28， 所述重链可变区的CDR3的氨基酸序列为SEQIDN0:23或SEQIDN0:29， 所述轻链可变区的CDRl的氨基酸序列为SEQIDN0:24或SEQIDN0:30， 所述轻链可变区的CDR2的氨基酸序列为SEQIDN0:25或SEQIDN0:31， 所述轻链可变区的CDR3的氨基酸序列为SEQIDN0:26或SEQIDN0:32。
2. 根据权利要求1所述的抗体，其中： 所述重链可变区的CDRl~CDR3的氨基酸序列分别为SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO: 23,或者分别为SEQIDNO: 27、SEQIDNO: 28、SEQIDNO: 29; 所述轻链可变区的CDRl~CDR3的氨基酸序列分别为SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO: 26,或者分别为SEQIDNO: 30、SEQIDNO: 31、SEQIDNO: 32。
3. 如权利要求1所述的抗体，其中，且抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO: 1或SEQIDNO:7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:2或SEQIDNO:8所示。
4. 根据权利要求1所述的抗体，该抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:1所 示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示；或者，该抗体的重链可变区的氨基酸序 列如SEQIDNO:7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。
5. 根据权利要求1或4所述的抗体，该抗体的重链恒定区为人IgGl-Fc恒定区，轻链恒 定区为人K链恒定区。
6. 根据权利要求1所述的抗体，该抗体的重链和轻链的氨基酸序列分别如SEQIDNO: 4和SEQIDNO:6所示；或者，该抗体的重链和轻链的氨基酸序列分别如SEQIDNO: 10和 SEQIDNO: 12 所示。
7. -种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1~6任一项所述的抗体的重链可变区 和/或轻链可变区，或者编码权利要求1~6任一项所述的抗体的重链和/或轻链。
8. -种分泌表达权利要求1~6任一项所述的抗RORl的人源化单克隆抗体的细胞株。
9. 根据权利要求8所述的分泌表达抗RORl的人源化单克隆抗体的细胞株，其是按照以 下方法制备得到的： 将带有编码权利要求1~6任一项所述的抗体的重链的抗体基因的表达载体、带有 编码权利要求1~6任一项所述的抗体的轻链的抗体基因的表达载体分别转入大肠杆菌 DH5a菌株，进行扩增培养，抽提纯化质粒DNA; 将所得纯化的质粒DNA转染CHO细胞； 转化的CHO细胞使用嘌呤霉素进行筛选，并在半固体选择培养基上进行稀释，使用ClonePixFL进行克隆挑选；优选地，挑出多个单克隆细胞系在FreeStyle?CH0培养基中进 行悬浮化扩大培养，对上清进行ELISA检测抗体表达量，从中挑选培养过程中抗体最高表 达量在200mg/L以上的克隆，即为所述的细胞株； 更优选地，所述分泌抗ROR1的人源化单克隆抗体的细胞株为保藏编号为CGMCC No. 10583的细胞株。
10. 权利要求1~6任一项所述的抗体的制备方法，该方法包括：
【专利摘要】本发明提供了一种抗人ROR1单克隆抗体及其制备方法与应用，所述抗体具有重链可变区和轻链可变区，重链可变区和轻链可变区各具有3个CDR，重链可变区的CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:21或NO:27，CDR2为SEQ ID NO:22或NO:28，CDR3为SEQ ID NO:23或NO:29；轻链可变区的CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:24或NO:30，CDR2为SEQ ID NO:25或NO:31，CDR3为SEQ ID NO:26或NO:32。本发明的单体稳定性好，特异性强，通过的对特定细胞的监控就可以提前检测到白血病特异性标记，还可以结合乳腺癌细胞中的ROR1靶点，有利于沉默实验完成。CGMCC No.1058320150416
【IPC分类】C12R1-91, C12N15-13, C07K16-28, C12N5-10, C12P21-08
【公开号】CN104817642
【申请号】CN201510218770
【发明人】康平, 苗景赟, 陈宜顶
【申请人】北京百普赛斯生物科技有限公司
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年5月4日