因子或其基因的抑制剂"或"本发明抑制剂"。例 如，所述的抑制剂包括纤维素降解相关锌指转录因子的抗体、抑制性mRNA、反义RNA、 microRNA(miRNA)、siRNA、shRNA以及锌指转录因子的活性抑制剂。
[0066] 同样，在获得了本发明锌指转录因子的序列或其编码核苷酸后，本领域技术人员 可以根据常规技术手段设计、合成、鉴定并验证这些抑制剂及其效果。应理解，这些抑制 剂可以是完全抑制本发明锌指转录因子的表达和/或活性，也可以是部分抑制，从而获得 (半）纤维素酶活性增强的本发明工程菌。
[0067] 应用
[0068] 通过抑制本发明锌指蛋白，可以人为地提高丝状真菌中（半）纤维素酶的表达量 和/或活性，从而增加菌株对纤维素（尤其是木质纤维素）的利用。
[0069] 例如，当获得了本发明的工程菌后，可以通过加入纤维素原料的诱导，对所述的工 程菌进行培养。此时，所述的菌株会分泌纤维素酶和半纤维素酶，对其进行分离并提纯后， 就可以获得较纯的纤维素酶和半纤维素酶。
[0070] 由于产生纤维素酶和半纤维素酶的过程中，纤维素原料受其降解，形成降解产物。 因此当进一步对培养物进行分离时，就可以获得纤维素的多种降解产物，例如多种单体化 合物：葡萄糖、木糖等。
[0071] 本发明有益效果
[0072] 本发明通过改造丝状真菌在纤维素降解的调控因子及调控网络，增强了丝状真菌 对纤维素的利用，提高了生物质降解，从而成为能量利用中的新途径。
[0073] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照 常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否 则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0074] 本发明所采用的原始出发菌株商购于美国真菌菌种保存库（FGSC)，其余所用材料 均为商购。
[0075] 实施例1工程菌的获得
[0076] 可采用常规技术对出发菌株中的转录因子进行敲除。
[0077] 以粗糙脉胞菌出发菌株（FGSC2489)(购自FGSC)为例，根据同源重组的原理，利 用hph基因（潮霉素B抗性基因）置换待NCU05064的整个开放阅读框（open reading frame, 0RF)〇
[0078] 1)设计同源臂特异性引物
[0079] 上游同源臂特异性引物：
[0080] NCU05064-5f:GTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGGACTTGACTTGAGTGACAGG(SEQ ID NO. :11)；
[0081] NCU05064-5r:ATCCACTTAACGTTACTGAAATCTCCAACGTTAGAAGCAGGAAGGAAGG(SEQ ID NO. : 12)
[0082] 下游同源臂特异性引物：
[0083] NCU05064-3f:CTCCTTCAATATCATCTTCTGTCTCCGACTACTGCGAGGAAGATCAAGG(SEQ ID NO. : 13)；
[0084] NCU05064-3r:GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCCCTACCTACCTATCCAGACG(SEQ ID NO. : 14)
[0085] 扩增目标基因上下游同源臂；然后利用引物从质粒PCSN44中扩增hph抗性元件。 将上述扩增所得3个片段利用酵母组装的方法连接至pRS426中。引物如下所示
[0086] hph-F ：GTCGGAGACAGAAGATGATATTGAAGGAGC(SEQ ID NO. :15)
[0087] hph-R ：GTTGGAGATTTCAGTAACGTTAAGTGGAT(SEQ ID NO. :16)
[0088] 2)将上述所获得质粒作为模板，用SEQ ID NO. : 11-12所示的引物扩增NCU05064 敲除元件，凝胶纯化PCR产物。
[0089]3)将上述PCR产物10ii g电击转化至野生型菌株（FGSC2489，A)，通过含有潮霉素 的平板筛选阳性转化子。
[0090] 4)提取转化子基因组DNA，以其为模板，利用引物扩增，其中hphDC是验证基因敲 除的通用引物，如果可以扩增得到目的片段，则说明这些转化子发生了预期的同源重组。引 物如下所示：
[0091] NCU05064DC ：GCGACTTGGACCTGACCACT(SEQ ID NO. : 17)
[0092] hphDC ：GCTCCGGGCGTATATGCT (SEQ ID NO. : 18)
[0093] 5)将所获得的转化子与野生型菌株杂交（FGSC4200, a)，将杂交得到的子囊孢子 热激（60°C，45min)后，稀释涂布在平板上，萌发后挑至斜面上，生长7天后，提取基因组，利 用PCR进行鉴定。
[0094] 其余工程菌株均根据类似方法获得，所需的引物如表1所示：
[0095] 表 1
[0096]
【主权项】
1. 一种提高丝状真菌纤维素酶和/或半纤维酶的表达、和/或提高丝状真菌的纤维素 降解活性的方法，包括步骤： 抑制丝状真菌的纤维素降解相关锌指转录因子或其基因的表达和/或活性，从而提高 丝状真菌纤维素和/或半纤维酶的表达、和/或提高丝状真菌的纤维素降解活性。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的丝状真菌包括：脉孢菌 (Neurospora)、或侧抱霉（Sporotrichum)。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纤维素降解相关锌指转录因子包括： (a)SEQIDNO. :1、3、5、7、或9所示序列的一种或多种。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抑制包括敲除和/或下调所述的纤维素 降解相关锌指转录因子的表达和/或活性。
5. -种纤维素降解相关锌指转录因子或其基因的抑制剂的用途，其特征在于，（a)用 于提高丝状真菌纤维素和/或半纤维酶的表达；和/或（b)用于提高丝状真菌的纤维素降 解活性。
6. 如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的抑制剂包括所述纤维素降解相关锌 指转录因子的抗体、抑制性mRNA、反义RNA、microRNA(miRNA)、siRNA、shRNA以及锌指转录 因子的活性抑制剂。
7. -种用于降解纤维素的工程菌，其特征在于，所述工程菌中纤维素降解相关锌指转 录因子被敲除或被下调。
8. -种生产纤维素酶和/或半纤维素酶的方法，其特征在于，在纤维素原料的存在下， 培养权利要求7所述的工程菌，并从培养物中分离提纯所述的纤维素酶和/或半纤维素酶。
9. 一种降解纤维素并获得纤维素降解产物的方法，其特征在于，在木质素原料的存在 下，培养权利要求7所述的工程菌，从而降解木质素并获得木质素降解产物。
10. 权利要求7所述工程菌的用途，其特征在于，用于制备纤维素酶和/或半纤维素酶、 和/或用于提高纤维素的降解。
【专利摘要】本发明一种提高真菌降解木质纤维素或是生产纤维素酶、半纤维素酶的方法，属于基因工程领域。该方法是利用敲除或突变转录因子部分碱基或减弱转录因子的表达的微生物菌株降解木质纤维素或是生产纤维素酶、半纤维素酶，所述微生物为脉孢菌、曲霉、木霉、青霉、镰刀霉或侧孢霉，所述转录因子基因包括NCU05064、NCU03699、NCU02576、NCU06186和NCU08744，敲除其中的任意一个，或突变其中的部分碱基，或减弱任意一个表达。本发明通过敲除或是部分碱基突变或是减弱微生物转录因子基因表达得到一类出发菌，并应用其降解木质纤维素或是提高纤维素酶、半纤维素酶表达或其它蛋白的表达量。
【IPC分类】C12N1-14, C12N9-42, C12N15-87, C12R1-66, C12R1-645, C12R1-80, C12P19-14, C12R1-77, C12N1-15, C12R1-885
【公开号】CN104845954
【申请号】CN201510081685
【发明人】田朝光, 林良才, 李金根, 齐西珍, 孙文良, 李慧燕, 马延和
【申请人】中国科学院天津工业生物技术研究所
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年2月15日