用于cdr移植的受体框架的制作方法
【专利说明】用于CDR移植的受体框架
[0001] 【发明背景】
[0002] 单克隆抗体、其缀合物和衍生物在商业上大量地作为重要的治疗剂和诊断 剂。非人抗体通常在单次低剂量注射后引发患者强烈的免疫反应（SchrofT，1985Cancer Res45:879-85,Shawler.JImmunol1985135:1530-5 ;Dillman，CancerBiother 19949:17-28)。因此，研发了几种用于减小鼠类和其它啮齿动物抗体的免疫原性的方法以 及使用例如转基因小鼠或噬菌体展示来制造全人抗体的技术。工程设计将啮齿动物可变 区与人恒定区合并的嵌合抗体（例如BoulianneNature1984312:643-6)相当程度上减 少了免疫原性问题（例如LoBuglio，ProcNatlAcadSci198986:4220-4 ;Clark,Immunol Today200021:397-402)。也工程设计人源化抗体，其中可变区本身的啮齿动物序列被工程 设计为尽可能接近人序列，同时至少保留初始的CDR，或其中将来自啮齿动物抗体的CDR移 植到人抗体的框架中（例如把6(*1^1111，似加代1988332:323-7山55,693,761)。兔多克隆 抗体广泛用于诸如ELISA或蛋白质印迹的生物学分析中。多克隆兔抗体因其通常更高的亲 和力而常优于多克隆啮齿动物抗体。此外，兔时常能够对在小鼠中具有不良免疫原性和/ 或在用于噬菌体展示时不产生良好结合剂的抗原引发良好的抗体反应。由于兔抗体的这些 熟知的优势，它们将理想地用于发现和研发治疗性抗体。这通常未进行的原因主要是由于 在产生单克隆兔抗体中的技术挑战。由于骨髓瘤样的肿瘤在兔体内未知，因此常规用于产 生单克隆抗体的杂交瘤技术不适用于兔抗体。Knight和同事们已经进行了为表达兔抗体 的细胞提供融合细胞系配偶体的创始工作（Spieker-Polet等人，PNAS1995,92:9348-52) 而且Pytela等人在2005年已描述了一种改善的融合配偶体细胞系（参考例如美国专利 No. 7429487)。然而，此技术并未广泛传播，因为相应的专门技能基本上由单个研宄团队控 制。文献中有描述用于产生单克隆抗体的替代方法，涉及通过RT-PCR从选定的抗体表达细 胞中克隆抗体，但对于兔抗体而言从未有过成功报道。
[0003] 兔抗体如同小鼠抗体一样期望在用于人治疗时引发强烈的免疫反应，因此兔抗体 在可临床使用之前需要人源化。然而，由于兔和小鼠之间以及兔与人抗体之间各自的结构 差异，因此用于制造人源化啮齿动物抗体的方法无法容易地外推用于兔抗体。举例来说，轻 链⑶R3(⑶RL3)常常比人或小鼠抗体先前已知的⑶RL3更长。
[0004] 现有技术中极少描述兔抗体的人源化方法，然而这些方法并非经典的移植方法， 其中在人受体抗体上移植非人供体的⑶R。W004/016740描述一种所谓的"表面重塑"策略。 "表面重塑"策略的目标在于重塑非人框架的溶剂可及残基以使其更类似人。本领域中已知 如TO04/016740中所述用于兔抗体的相似的人源化技术。W008/144757和W005/016950公 开用于使兔单克隆抗体人源化的方法，其涉及对亲本兔抗体的氨基酸序列和相似的人抗体 的氨基酸序列进行比较。接着改变亲本兔抗体的氨基酸序列以使其框架区的序列与相似的 人抗体的等效框架区更为相似。为了获得良好的结合能力，对于每种免疫结合剂需要个别 地进行艰难的研发努力。
[0005] 上述方法的潜在问题在于并非使用人框架，而是对兔框架进行工程设计以使其看 起来更类似人。这种方法存在风险，即埋在蛋白核心中的氨基酸延伸仍可能包含免疫原性 的T细胞表位。
[0006] 迄今为止，申请人尚未确认一种通过应用最先进的移植方法进行人源化的兔抗 体。这可以由兔CDR可能与人或啮齿动物CDR大相径庭的事实来解释。如本领域中已知， 许多兔VH链相对于鼠类和人类对应物而言具有额外配对的半胱氨酸。除了在cys22与 cys92之间形成的保守二硫桥以外，在某些兔链中，在⑶RH1的最后一个残基与⑶RH2的 第一个残基之间也形成有cys21-cys79桥以及⑶R间的S-S桥。除此之外，在⑶R-L3中 常见半胱氨酸残基对。此外，许多兔抗体CDR不属于任何先前已知的规范结构（canonical structure)。尤其是⑶R-L3常比人类或鼠类对应物的⑶R-L3更长。
[0007] 因此，将非人⑶R抗体移植至人框架中是一项重大的蛋白工程设计任务。必须进 行抗原结合环从自然进化的框架转移至经过不同人工选择的人框架，以便保留天然的环构 造用于抗原结合。抗原结合亲和力在环移植后常大幅减小或消除。在移植抗原结合环中使 用谨慎选择的人框架将最大化在人源化分子中保留结合亲和力的可能性（Roguzka等人， 1996)。尽管文献中可用的许多移植实验为CDR移植提供粗略指导，但不可能概括成一个模 式。典型的问题在于在CDR环移植后，特异性、稳定性或可生产性放松。
[0008] 因此，急需改善的方法来可靠且快速地使兔抗体人源化以用作治疗剂和诊断剂。 此外，需要人受体框架来可靠地使兔抗体人源化，提供具有类似药物的生物物理学特性的 功能抗体和/或抗体片段。
[0009] 【发明概述】
[0010] 已惊讶地发现，由质量控制（QC)分析确认的高度可溶性和稳定性人抗体框架（如 W0 0148017 和AufderMaur等人（2001)，FEBSLett508,第 407 至 412 页中所公开）尤其 适合适应来自其它非人动物物种的CDR，例如兔CDR。因此，在第一方面，本发明提供特定人 抗体的重链可变区（所谓的"a72"VH框架序列），其尤其适合作为来自具有不同结合特异 性的各种抗体，尤其是来自兔抗体的CDR的受体，而与CDR中是否存在二硫桥无关。
[0011] 通过将兔CDR移植到此高度相容性的可变链框架中产生的人源化免疫结合剂一 贯地且可靠地保持供体CDR所源自的兔抗体的空间取向。因此，无供体免疫结合剂的结构 相关位置需要引入受体框架中。由于这些优势，可实现对兔抗体的高通量人源化，而不优化 或几乎不优化结合能力。
[0012] 因此，在另一方面，本发明提供用于将兔和其它非人CDR移植至本文公开的可溶 性和稳定性轻链和/或重链人抗体框架序列中的方法，由此产生具有优良生物物理学特性 的人源化抗体。具体来说，由本发明的方法产生的免疫结合剂展现优良的功能特性，诸如溶 解性和稳定性。 【【附图说明】】
[0013] 图1描绘本文所用的用于将抗原结合位点从兔单克隆抗体移植到高度可溶性和 稳定性的人抗体框架中的CDRH1定义。
[0014] 图2:对从Kabat数据库提取的兔抗体序列的分析证实可变重链的⑶R3通常比它 的鼠类对应物长三个氨基酸。
[0015]【发明详述】
[0016]【定义】
[0017] 为使本发明可更易于理解，将如下定义某些术语。其它定义在【具体实施方式】中列 出。
[0018] 术语"抗体"是指完整抗体和任何抗原结合片段。术语"抗原结合多肽"和"免疫结 合剂"在本文中同时使用。"抗体"是指任选地经过糖基化的蛋白，其包含由二硫键互连的至 少两个重链（H)和两个轻链（L)或其抗原结合部分。每个重链包含重链可变区（本文中缩 写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每个轻链包含轻链 可变区（本文中缩写为')和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。区可进 一步再分成高变区，称为互补决定区（CDR)，其间穿插有更保守的区，称为框架区（FR)。每 个Vt由三个⑶R和四个FR组成，从氨基末端至羧基末端以下列次序排列：FR1、⑶R1、 FR2、⑶R2、FR3、⑶R3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体 的恒定区可调节免疫球蛋白与宿主组织或因子结合，包括免疫系统的各种细胞（例如，效 应细胞）和经典补体系统的第一组分（Clq)。
[0019] 术语抗体的"抗原结合部分"（或简称为"抗体部分"）是指保持与抗原（例如，TNF) 特异性结合的能力的一个或多个抗体片段。已证实抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片 段来执行。术语抗体的"抗原结合部分"中所涵盖的结合片段的实例包括（i)Fab片段，一种 由\、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；（ii)F(ab'）2片段，一种包含在铰链区由二硫桥 连接的两个Fab片段的二价片段；（iii)由V#PCH1结构域组成的Fd片段；（iv)由抗体单 臂的'和VH结构域组成的Fv片段，（v) *VH结构域组成的单一结构域或dAb片段（Ward 等人，（1989)Nature341:544-546);和（vi)分离的互补决定区（Q)R)或（vii)可任选地由 合成的接头连接的两个或两个以上分离的CDR的组合。此外，尽管Fv片段的两个结构域' 和VH由独立的基因编码，但它们可使用重组方法通过合成接头连接，使其能够形成八和VH 区在其中配对形成单价分子的蛋白单链（称为单链Fv(scFv);参考例如Bird等人（1988) Science242:423-426 ;和Huston等人（1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。这 类单链抗体也打算涵盖在术语抗体的"抗原结合部分"中。这些抗体片段是使用本领域技 术人员已知的常规技术来获得，且以与完整抗体相同的方式来筛选片段以供使用。抗原结 合部分可由重组DNA技术产生，或通过酶促裂解或化学裂解完整的免疫球蛋白来产生。抗 体可具有不同的同种型，例如IgG(例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亚型）、IgAl、IgA2、IgD、 IgE或IgM抗体。
[0020] 术语"免疫结合剂"是指含有抗体的全部或一部分抗原结合位点，例如全部或部 分的重链和/或轻链可变结构域的分子，以使得免疫结合剂特异性地鉴定靶标抗原。免 疫结合剂的非限制性实例包括全长免疫球蛋白分子和scFv，以及抗体片段，包括（但 不限于）（i)Fab片段，一种由VH、C#CH1结构域组成的单价片段；（ii)F(ab'）2片 段，一种包含在铰链区由二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；（iii)Fab'片段，它 基本上是具有部分铰链区的Fab(参考FUNDAMENTALIMMUNOLOGY(Pau1编，第3增刊版 本1993) ;(iv) *V#PCH1结构域组成的Fd片段；（v)由抗体单臂的八和VHg构域组 成的Fv片段，（vi)由\^或V^结构域组成的单一结构域抗体，诸如Dab片段（Ward等 人，（1989)Nature341:544-546), 一种骆蛇科动物（参考Hamers-Casterman等人，Nature 363:446-448(1993)和Dumoulin等人，ProteinScience11:500-515(2002))或鲨鱼抗体 (例如，sharkig-NARsNanobodies?);和（vii)纳米抗体，一种含有单一可变结构域 和两个恒定结构域的重链可变区。
[0021] 术语"单链抗体"、"单链Fv"或"scFv"是指包含由接头连接的抗体重链可变结构 域（或区；VH)和抗体轻链可变结构域（或区；VJ的分子。这类scFv分子可具有通用结构： NH2_V接头-Vh-COOH或NH2-Vh-接头-VCOOH。合适的现有技术的接头由重复的GGGGS氨 基酸序列或其变异体组成。在本发明的优选实施方案中，使用SEQIDNO:8中所列的氨基 酸序列的（GGGGS)4接头，但也可能是1至3个重复的变异体（Holli