-GP5_Cap。此外，本发明重组毒株所表达的重组蛋白，其产物表达产量很高。 用研制的BacSC-Dual-GP5-Cap亚单位疫苗制品对本动物是安全的。疫苗免疫效力试验结 果表明，在初免14天时，免疫BacSC-Dual-GP5-Cap的猪体内都可以检测到GP5_Cap特异性 抗体。加强免疫后，GP5-Cap特异性抗体水平迅速增加到1 : 17.6。因此利用基因工程方 法研制的PRRSV和PCV2具有良好的免疫原性，该亚单位疫苗在猪蓝耳病和猪圆环病的防制 方面将具有很广泛的应用前景。
[0037] 生物保藏说明
[0038] 重组杆状病毒BacSC-Dual-GP5-Cap。本菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所， 保藏编号为CGMCC No. 2389。
【附图说明】
[0039] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0040] 图1示重组表达质粒BacSC-Dual-GP5-Cap PCR和酶切鉴定结果；M1、M2 :DNA分子 量标准（DL2000、AHindlll)山1、12、13:重组质粒？0?鉴定结果、重组质粒酶切鉴定结果、 重组质粒；
[0041] 图2示重组表达质粒BacSC-Dual-GP5-Cap的构建图谱；示PRRSV-GP5和PCV2-Cap 基因克隆至杆状病毒 BacSC-Dual (带有 gp64ss、His6、gp64TM 和 gp64CTD);
[0042] 图3示重组GP5-Cap融合蛋白在昆虫sf-9细胞中的表达结果：L1?表达72h、 L2.表达36h、L3.空载体；M.中蛋白质分子量标记物；
[0043] 图4示表达产物的Western blot分析结果；
[0044] 图5共焦显微镜检测结果；
[0045] 图6免疫金电子显微镜检查结果：A :杆状病毒的表面出现抗PRRSV金颗粒，B :杆 状病毒的表面出现抗PRRSV金颗粒，C :杆状病毒的表面上没有出现金颗粒。
【具体实施方式】
[0046] 本发明公开了重组表达载体及其构建方法、重组病毒毒株及其应用、重组蛋白及 亚单位疫苗，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的 是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本 发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和 应用本发明技术。
[0047] 本发明具体包括如下具体实施方案：
[0048] 一、PCR扩增PRRSV-GP5基因和PCV2-Cap基因及构建重组表达质粒 BacSC-Dual-GP5-Cap
[0049] 3、PRRSV-GP5基因和PCV2-Cap基因的引物设计
[0050] 根据猪繁殖与呼吸综合症GP5蛋白基因和猪圆环病毒2型的Cap基因序列设计特 异性引物P1、P2、P3和P4,引物序列如下：
[0051] GP5-P1:5' GCTGCGCGCATGAATGGCATCTTC 3'
[0052] GP5-P2:5'GGGGCATGCAAGTGGGGGGTCTTTAAG 3'，
[0053] Cap-P3:5'GCTCTCGAGAGCAACAACAGCAG 3'，
[0054] Cap-P4:5, GATCTGCAGGAGACGACCCCATTGTT 3'
[0055] 根据杆状病毒BacSC-Dual载体酶切位点，加入酶切位点Xho I、Xba I、Pst I和 EcoR，上述引物均由上海生工生物工程公司合成。以猪蓝耳T1株的GP5蛋白基因和PCV2 豫A株的全基因序列设计特异性引物，并以重组质粒pT-PCV为模板（曹胜波等.猪II型 圆环病毒豫A株的全基因组克隆与序列分析，以Pl、P2、P3和P4为引物对CP5和Cap基因 进行扩增，扩增目的片段大小分别为507bp和570bp。反应结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳 检测扩增结果。
[0056] 4、重组表达质粒BacSC-Dual-GP5_Cap的构建
[0057] 将PCR扩增的GP5和Cap蛋白基因片段纯化回收，转化至克隆质粒中，经Xho I、Xba I、Pst I和EcoR分别双酶切，后将GP5基因与Cap基因连接，将连接产物克隆至表达载体 BacSC-Dual上，获得天然表达GP5_Cap基因的重组真核质粒BacSC-Dual-GPS-CapaDHlOBac 大肠杆菌分别转化为重组质粒BacSC-Dual_GP5_Cap和非重组质粒BacSC-Dual。非重组质 粒BacSC-Dual作为阴性对照。选择经过两轮蓝/白选择菌落后，按照Invitrogen公司规定 的程序从白色菌落中分离到重组质粒。重组克隆后用P1和P4特异性引物进行PCR验证。 重组杆状病毒DNA分别命名为BacSC-Dual-GP5_Cap与BacSC-Dual。
[0058] 二、重组表达质粒转染及蚀斑试验
[0059] 按照产品手册的所有步骤进行。将消化sf-9单层细胞，转入6孔板内，待细胞铺板 密度在80%进行转染，转染细胞于27°C培养5h，而且转染的培养基替换为新鲜的培养基。
[0060] 取转染细胞培养上清做蚀斑克隆与筛选试验。蚀斑实验：采用10倍系列稀释的 病毒培养物上清，接种草地贪夜蛾9 (sf-9)细胞中，28°C感作lh，吸出接种液后用终浓度为 1 %琼脂糖-Grace氏完全培养液覆盖（内含150 y g/mLX-gal)凝固后倒置于28°C培养箱培 养4日，逐日观察深蓝色蚀斑的出现，用毛细玻璃管挑取蓝斑，置0.5mL无血清Grace氏培 养液中吹打，以此接种sf-9细胞，反复进行3次重组杆状病毒的蚀斑克隆筛选，获得病毒滴 度按蚀斑形成单位（pfu/mL)计算。
[0061] 三、重组蛋白的表达与SDS-PAGE、Western blot分析
[0062] 取新培养的sf-9细胞，接种量为0.1个感染单位，接种5~7日龄后收获病毒细 胞培养物。重组蛋白表达时，接种量为5个感染单位，按不同时间点36h和72h收取细胞培 养物。收取的细胞用PBS离心洗涤3次，加入SDS-PAGE样品缓冲液，经煮沸5min处理后， 12. 5%分离胶电泳，考马斯亮蓝R250染色。在Westrn-blot试验中用于检测GP5-Cap蛋白 的三个主要的抗体分别为：鼠抗HIS6单克隆抗体，猪抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV) 与PCV2多克隆抗体。二抗羊抗鼠和兔共辄的辣根过氧化物酶标记的IgG即HRP。利用ECL 化学发光试剂盒可见蛋白条带。
[0063] 四?共焦显微镜观察
[0064] 利用共焦显微镜可以直观的进行蛋白质定位分析。sf-9细胞在无菌盖玻片（六孔 板）培养，然后感染的M0I为10。在感染两天后于-20°C运用甲醇/丙酮（1 : 1)固定5分 钟，PBS清洗，后于37°C用2%牛血清白蛋白终止30分钟。然后将细胞与初级抗体在37°C 孵育1小时，然后用PBS洗涤三次。控制组细胞以同样的步骤进行处理。
[0065] 五.病毒提纯与免疫金电子显微镜检查
[0066] 重组杆状病毒传播感染的sf-9细胞的M0I为0. 1，然后感染后第4天，进行大规 模杆状病毒的生产回收。根据标准方法进行两次蔗糖梯度离心纯化病毒上清。由免疫金电 子显微镜进行重组杆状病毒纯化分析。免疫电子显微镜按照说明进行操作。简单地说，纯 碳膜漂浮于10 y 1纯化的杆状病毒溶液中1小时，1 % BSA封闭1小时后用PBS洗涤3次约 5min，后与猪的抗PRRSV与PCV2 polyclonal抗体培养1小时。PBS洗涤3次，标记兔抗猪 IgG抗体30分钟的10-nm的金颗粒暴露在网格上。用PBS洗涤3次，用2 %磷钨酸给网格 染色并置于透射电子显微镜下检验。
[0067] 六、仔猪断奶多系统衰竭综合症亚单位疫苗的免疫效力检验
[0068] 选择15头2个月龄体重18~20公斤的猪，通过病毒中和试验验证这些猪体内没 有对抗PRRSV和PCV2的抗体后，在耳朵周围进行基础免疫，每组6头，其中PBS对照组3头， 分别在第〇天和第14天肌肉注射免疫1 X 109 pfu的BacSC-Dual-GP5_Cap 6头猪、1 X 109 pfu(噬斑形成单位）的BacSC-Dual 6头猪及PBS 3头猪。在基础免疫后14和28天时分 别采集血清标本进行血清学试验。从基础免疫28天时的全血中采集外周血单核细胞进行 淋巴细胞增殖实验。血清用于ELISA效价测定。
[0069] 本发明获得的有益效果包括：
[0070] 1?本发明成功PCR扩增PRRSV-GP5基因和PCV2_Cap基因及构建高效重组表达质 粒BacSC-Dual-GP5_Cap ;