] 1. 1免疫及测定GP5_Cap蛋白的ELISA滴定度
[0107] ?
[0108] 动物实验的完成是根据国际动物福利标准且符合国际动物保护和实验动物使用 所规定的规程。
[0109] 1.2病毒中和试验
[0110] 猪血清中进行PRRSV和PCV2中和活性的测定，使用如前所述的荧光共焦中和试验 方法（Wang等人，2006)在初次接种后的第14和28天检测到。把血清（50 y 1)二倍稀释在 DMEM培养基（pH 7.0)中，开始以一个1 : 2的稀释倍数。加入等体积的PRRSV和PCV2 (200 TCID50)溶液至血清样品，于37°C培养lh。然后将该混合物接种到96孔板内，其含有40% 至50%汇合的PK-15细胞。在培养72h后，加入90%丙酮固定培养板，干燥并与抗PCV2多 克隆抗体孵育，然后利用FITC(异硫氰酸焚光素）标记的山羊抗猪IgG抗体（Invitrogen 公司）染色。血清滴定度的测定是根据最大血清稀释度70%的倒数或在荧光显微镜下观察 到感染细胞内较大荧光灶的减少。
[0111] 1.3.淋巴细胞增殖试验
[0112] 使用猪的外周血单核细胞（PBMCs)进行淋巴细胞增殖实验。使用淋巴细胞分离液 (TBD，上海，中国）从免疫猪的全血中分离外周血单核细胞。在用Hank氏缓冲液（pH7. 2)洗 涤3次后，用加入10%胎牛血清的1?^1-1640培养液悬浮？81?^大约5\106个细胞>1，接 种在96孔平底板上每孔100 yl。随后，每孔加入20 yg PRRSV和20 yg PCV2。刀豆蛋白 A(5μg/ml，Sigma公司）作为阳性对照。每个外周血单核细胞的样品分成三份。利用标准 的MTT法测定细胞增殖活性。在37°C 5 % C02培养68小时，每孔加入20 y 1 3- (4, 5-二甲 基吡啶-2-烃基）2, 5-二苯基四唑溴化物（MTT，5mg/ml，Sigma公司，圣圣路易斯，美国）进 一步培养4h。4h后，加入100 y 1二甲亚砜（DMS0)终止反应。在490nm处测定光密度（0D 值），刺激指数（SI)的计算如下：SI =受PCV2刺激的细胞的平均0D值/未受刺激的细胞 的0D值。
[0113] 2结果
[0114] 2. 1.重组杆状病毒的免疫应答
[0115] 本研究通过猪耳部肌肉注射BacSC-Dual-GP5_Cap，BacSC-Dual和PBS研究其免 疫应答效果。初免后第14天和28天时进行GP5-Cap特异性ELISA抗体监测。如图5所 示，在初免14天时，免疫BacSC-Dual-GP5_Cap的猪体内都可以检测到GP5_Cap特异性抗 体。加强免疫后，GP5-Cap特异性抗体水平迅速增加到1 : 17.6。正如预期的那样，免疫 BacSC-Dual与PBS的所有的猪体内均没有检出GP5和Cap特异性抗体。统计学上差异显著 (P < 0? 05)。这些数据表明，昆虫杆状病毒BacSC-Dual-GP5-Cap可成功刺激GP5和Cap特 异性ELISA抗体的产生。
[0116] 2. 2病毒中和试验结果
[0117] 米用 wang 等报道(wang X 等.Construction and immunogenicity of recombinant adenovirus expressing the capsid protein of porcine circovirus 2(PCV2) in mice. Vaccine，2006,24 :3374-3380)的 PRRSV 和 PCV2 的中和抗体检测方法，检 测血清中特异性抗PRRSV和PCV2的中和抗体水平，结果表明初次免疫BacSC-Dual-GP5-Cap 第14天的猪产生PRRSV和PCV2抗体效价分别为1 : 3. 6,在28天时进一步增加为 1 : 12. 8。该结果与报道的PRRSV和PCV2中和滴度为1 : 14(Panet人，2008年范等人， 2008)是一致的。在整个实验过程中免疫BacSC-Dual和PBS的猪血清没有中和抗体活性。 产生GP5和Cap蛋白抗体的病毒中和抗体滴度显著高于阴性对照组BacSC-Dual和PBS(P < 0. 05, t-text)。
[0118] 2. 3?淋巴细胞增殖试验结果
[0119] 将初次免疫28天后进行淋巴细胞增殖反应检查。如该图5所示，免疫 BacSC-Dual-GP5-Cap 的猪其 SI 值（3. 54±0. 37)明显高于免疫 BacSC-Dual (1. 34±0. 11) 和PBS(1.09±0.06)的猪。显著差异具有统计学意义（P<0.05)。刀豆蛋白A(阳性对 照）控制的SI值为4. 11±0. 24,刀豆蛋白A工作高效.以上结果表明，基因重组杆状病毒 BacSC-Dual-GP5-Cap同样可以诱导猪产生显著的细胞免疫应答。
[0120] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种重组表达载体，其特征在于，由具有如SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的PRRSV GP5基因片段、具有如SEQ ID No. 2所示核苷酸序列的PCV2 Cap基因片段与质粒载体重组 构建而成。2. 根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，其由表达载体BacSC-Dual在其 Kpn I和Sma I酶切位点间插入所述具有如SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的PRRSV GP5的基 因片段，以及所述表达载体BacSC-Dual在其Pst I和EcoR I酶切位点间插入SEQ ID No. 2 所示核苷酸序列的PCV2 Cap基因片段获得。 其由表达载体BacSC-Dual在其Kpn I和Sma I酶切位点间插入gp64CAD、gp64TM、如 SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的PRRSV GP5基因片段、His6、gp64ss，以及所述表达载体 BacSC-Dual 在其 BamH I 和 Hind III 酶切位点间插入 gp64ss、His6、SEQ ID No. 2 所示核 苷酸序列的PCV2 Cap基因片段、gp64TM、gp64CAD获得。3. -种如权利要求1或2所述的重组表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步 骤： 步骤1 :扩增获得如SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的PRRSV GP5基因片段； 步骤2 :扩增获得如SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的PRRSV GP5的基因片段； 步骤3:将所述表达载体BacSC-Dual经Xho I、Xba I、Pst I和EcoR分别双酶切，将如 SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的PRRSV GP5基因片段与如SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的 PRRSV GP5的基因片段转化连接，获得所述重组表达载体。4. 一种重组病毒毒株，其特征在于，由如权利要求1或2所述的重组表达载体经包装细 胞包装而成。5. 根据权利要求4所述的重组病毒毒株，其特征在于，其生物保藏编号为CGMCC No.2389 和 CGMCC No. 2657。6. 根据权利要求4或5所述的重组杆状病毒毒株在制备预防和/或治疗PRRSV感染相 关疾病和/或PCV2感染相关疾病的药物制剂的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述PRRSV感染相关疾病为猪繁殖与呼吸 综合征；所述PCV2感染相关疾病为多系统衰竭综合征。8. -种如权利要求4或5所述的重组病毒毒株表达的重组蛋白。9. 根据权利要求8所述的重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。10. -种亚单位疫苗，其特征在于，包含： (I) 如权利要求4或5所述的重组病毒毒株表达的重组蛋白或与其同源性达80%以上 的蛋白； 和/或 (II) 如权利要求8所述的重组蛋白或与其同源性达80%以上的蛋白。
【专利摘要】本发明涉及动物病毒学和基因工程学技术领域，特别涉及重组表达载体及其构建方法、重组病毒毒株及其应用、重组蛋白及亚单位疫苗。本发明成功PCR扩增PRRSV-GP5基因和PCV2-Cap基因及构建高效重组表达质粒BacSC-Dual-GP5-Cap。此外，本发明重组毒株所表达的重组蛋白，其产物表达产量很高。用研制的BacSC-Dual-GP5-Cap亚单位疫苗制品对本动物是安全的。疫苗免疫效力试验结果表明，利用基因工程方法研制的PRRSV和PCV2具有良好的免疫原性，该亚单位疫苗在猪蓝耳病和猪圆环病的防制方面将具有很广泛的应用前景。
【IPC分类】C07K14/01, C07K14/08, A61K39/12, C12N15/866
【公开号】CN105039405
【申请号】CN201510257530
【发明人】李秋菊
【申请人】吉林和元生物工程有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年5月20日