r>[0071] 2.本发明重组毒株所表达的重组蛋白，其产物表达产量很高。
[0072] 3.用研制的BacSC-Dual-GP5-Cap亚单位疫苗制品对本动物是安全的。疫苗免 疫效力试验结果表明，在初免14天时，免疫BacSC-Dual-GP5-Cap的猪体内都可以检测到 GP5-Cap特异性抗体。加强免疫后，GP5-Cap特异性抗体水平迅速增加到1 : 17. 6。因此 利用基因工程方法研制的PRRSV和PCV2具有良好的免疫原性，该亚单位疫苗在猪蓝耳病和 猪圆环病的防制方面将具有很广泛的应用前景。
[0073] 其中，实施例部分如未说明，则所有分子克隆、转化等生物技术方法均参照《分子 克隆实验指南》（J.萨姆布鲁克等著，科学出版社出版，第三版）
[0074] 本发明提供的重组表达载体及其构建方法、重组病毒毒株及其应用、重组蛋白及 亚单位疫苗中所用原料及试剂均可由市场购得。
[0075] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0076] 实施例1 :重组表达质粒BacSC-Dual-GP5_Cap的构建及重组质粒的表达
[0077] 1?材料与方法
[0078] 1. 1 PCR 扩增 PRRSV-GP5 和 PCV2_Cap 基因
[0079] 以猪蓝耳T1株的GP5蛋白基因和PCV2豫A株（Genebank登录号：AY035820)全 基因组的重组质粒pT-PCV为模板，P1、P2、P3和P4为引物扩增PRRSV-GP5和PCV2-0RF2基 因。
[0080] 1.2重组真核表达质粒BacSC-Dual-GP5_Cap的构建
[0081] 将PCR产物回收并纯化，经Xho I、Xba I、Pst I和EcoR分别双酶切，连接，并将连 接产物GP5-Cap克隆至具有相同酶切位点的表达载体BacSC-Dual(购自美国Invitrogen 公司）上，获得天然表达GP5-Cap基因的重组真核质粒BacSC-Dual-GP5-Cap(将PRRSV-GP5 和PCV2-Cap基因克隆至杆状病毒BacSC-Dual载体的图谱，见图2)，后经Xho I和EcoR双 酶切鉴定和PCR鉴定证实构建正确，测序证实无碱基误配。质粒BacSC-Dual-GP5_Cap的 PCR和酶切鉴定结果见图1。
[0082] 1. 3重组表达质粒转染及蚀斑试验
[0083] 按照产品手册（Invitrogen公司）的所有步骤进行。将消化sf-9单层细胞，转入 6孔板内，待细胞铺板密度在80%进行转染，转染细胞于27°C培养5h，而且转染的培养基替 换为新鲜的培养基。
[0084] 取转染细胞培养上清做蚀斑克隆与筛选试验。蚀斑实验：采用10倍系列稀释的 病毒培养物上清，接种草地贪夜蛾9 (sf-9)细胞于，28°C感作lh，吸出接种液后用终浓度为 1%琼脂糖-Grace氏完全培养液覆盖（内含150yg/mL X-gal)凝固后倒置于28°C培养箱 培养4日，逐日观察深蓝色蚀斑的出现，用毛细玻璃管挑取蓝斑，置0.5mL无血清Grace氏 培养液中吹打，以此接种sf-9细胞，反复进行3次重组杆状病毒的蚀斑克隆筛选，获得病 毒滴度按蚀斑形成单位（pfu/mL)计算。
[0085] 1.4重组蛋白的表达与SDS-PAGE、Western blot分析
[0086] 取新培养的sf-9细胞，接种量为0.1个感染单位，接种5~7日龄后收获病毒细 胞培养物。重组蛋白表达时，接种量为5个感染单位，按不同时间点36h和72h收取细胞培 养物。收取的细胞用PBS离心洗涤3次，加入SDS-PAGE样品缓冲液，经煮沸5min处理后， 12. 5%分离胶电泳，考马斯亮蓝R250染色。在Westrn-blot试验中用于检测GP5-Cap蛋白 的三个主要的抗体分别为鼠抗HIS6单克隆抗体（1 : 3000稀释，Invitrogen公司），猪抗 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)与猪圆环2型（PCV2)多克隆抗体（抗体1 : 200倍稀 释，分别由疾病控制和预防中心提供，青岛，中国）。二抗羊抗鼠和兔共辄的辣根过氧化物酶 标记的IgG即HRP(1 : 3000稀释，Invitrogen公司）。利用ECL化学发光试剂盒可见蛋白 条带（Pharmacia公司，新界，香港）结果见图3、4。
[0087] 1. 5共焦显微镜
[0088] 利用共焦显微镜可以直观的进行蛋白质定位（LSM 510 META，Zeiss，Germany)分 析。sf-9细胞在无菌盖玻片（六孔板）培养，然后感染的M0I (感染复数（M0I)是按照感染 性滴度计算的，即有感染细胞能力的病毒数与细胞数的比值，而不是总病毒数。一般M0I为 50~100即可。）为10。在感染两天后于-20°C运用甲醇/丙酮（1 : 1)固定5分钟，PBS 清洗，后于37°C用2%牛血清白蛋白终止30分钟。然后将细胞与初级抗体（猪抗PRRSV多 克隆抗体，1 : 100的稀释度和猪抗PCV2多克隆抗体，1 : 100稀释）在37°C孵育1小时， 然后用PBS洗涤三次。控制组细胞以同样的步骤进行处理。结果见图5。
[0089] 1. 6病毒提纯与免疫金电子显微镜检查
[0090] 重组杆状病毒传播感染的SF-9细胞的M0I为0. 1，然后感染后第4天，进行大规模 杆状病毒的生产回收。根据标准方法进行两次蔗糖梯度离心纯化病毒上清。由免疫金电子 显微镜进行重组杆状病毒纯化分析。免疫电子显微镜按照说明进行操作。简单地说，纯碳 膜漂浮于10 y 1纯化的杆状病毒溶液中1小时，1 % BSA封闭1小时后用PBS洗涤3次约 5min，后与猪抗PRRSV与PCV2 polyclonal抗体（1 : 100稀释）培养1小时。PBS洗涤3 次，标记兔抗猪IgG抗体30分钟的10-nm的金颗粒（1 : 50稀释，Sigma公司）暴露在网 格上。用PBS洗涤3次，用2%磷钨酸（Sigma公司，圣路易斯，美国）给网格染色并置于透 射电子显微镜下检验。（H-7500,日立）结果见图6。
[0091] 2结果
[0092] 2. 1 PRRSV-GP5 和 PCV2-0RF2 基因扩增与克隆
[0093] PCR扩增获得的DNA产物，大小与预期设计一致，用限制性内切酶和PCR对重组质 粒验证结果显示，构建的重组质粒里面含有GP5_Cap基因，连接正确。测序表明，扩增的到 的目的基因片段与已发表的基因序列同源性达96. 3%，表明该基因具有很高的保守性。
[0094] 2. 2重组表达质粒蚀斑试验结果
[0095] 经3循环蚀斑克隆，获得一株稳定、高效表达GP5_Cap基因的重组杆状病毒，病毒 滴度在1. 28X10spfU/ml，重组病毒产生的蚀斑呈蓝色反应，对照呈乳白色反应。
[0096] 本发明提供的重组病毒毒株的生物保藏编号为CGMCC No. 2389。
[0097] 2. 3重组蛋白表达与SDS-PAGE、Western blot分析结果
[0098] 重组杆状病毒接种sf-9细胞，按不同时间收取样品进行SDS-PAGE电泳鉴定。见 图3所示，在约52kDa处出现目的蛋白条带，接种72h重组蛋白表达达到高峰。
[0099] Western blot分析（图4)表明，受BacSC-Dual-GP5_Cap感染的细胞出现分子量 约为52kDa的蛋白，在其分别检测到抗His6的单克隆抗体，抗PRRSV和PCV2多克隆抗体。 结果与预测的GP5_Cap蛋白大小一致。与此相反，在对照组（BacSC-Dual)内没有检测到抗 PRRSV 和 PCV2 抗体。
[0100] 2.4 SF-9细胞表面GP5-Cap蛋白的显示
[0101] 为了确定His标记的GP5-Cap蛋白是否正确转移到Sf-9细胞表面，灭菌培养皿上 培养，分别感染杆状病毒BacSC-Dual-GP5_Cap或M0I10的BacSC-Dual，并进行免疫荧光标 记/感染后2天利用共聚焦显微镜观察。如图5所示，共焦显微镜观察结果表明，GP5-Cap 蛋白显示于受感染的SF-9细胞膜表面。
[0102] 2. 5杆状病毒表面GP5-Cap蛋白的显示
[0103] 为了验证GP5_Cap蛋白是否成功显示在杆状病毒表面上，BacSC-Dual-GP5_Cap和 BacSC-Dual重组杆状病毒通过蔗糖梯度超离心法进行纯化，并用免疫金电子显微镜观察使 用一抗（抗PRRSV和PCV2抗体）和兔抗猪IgG二抗与10-nm的金颗粒的结合。图6表明， 经纯化的BacSC-Dual-GP5_Cap重组质粒和BacSC-Dual载体，通过免疫金电子显微镜观察 具有抗PRRSV的金颗粒（A)，抗PCV2的金颗粒（B)，而空载体BacSC-Dual的表面上没有出 现金颗粒，表明GP5-Cap蛋白成功显不在杆状病毒表面。
[0104] 实施例2 :本发明的仔猪断奶多系统衰竭综合症亚单位疫苗对仔猪免疫效力的生 物学实验
[0105] 1实验材料
[0106