[0032] 2)处理过后的RNA样品加入400 y 1DEPC水混匀后加入200 y ITris-饱和酚，振荡 30s〇
[0033] 3)加入200 y 1 24:1的氯仿异戊醇，振荡30s。
[0034] 4) 4°C，12, OOOrpm离心15min，取上清（400 y1)到无 RNase 的离心管中。
[0035] 5)加入1/10体积3M NaAC和2. 5倍体积的无水乙醇，-20°C沉淀2h以上。
[0036] 6)取上步沉淀物，4°C，12, OOOrpm离心15min，弃上清。
[0037] 7)加入lml 75%乙醇洗涤沉淀，4°C 9,OOOrpm离心10min，弃上清。
[0038] 加入1ml无水乙醇，4°C，12, OOOrpm离心lOmin倒出液体，剩余的少量液体短暂离 心，然后用枪头吸出，室温放置晾干后，加入20 y1无DEPC水溶解RNA，并通过核酸蛋白分析 仪检测RNA的浓度。
[0039] 表1. DNA消化反应体系
[0040]
[0041] 用Real time-PCR检测样品RNA中DNA的消化情况，其反应体系为：取消化后的 RNA 样品 1 y 1，10 yM actin-primerF 1 y 1，10 yM actin-primerR 1 y 1，iQ SYBR Green Supermix lOyl，Sterile water 7yl。反应循环条件为：95°C 预变性 5min;95°C 变性 30sec，57°C 退火 45sec，72°C延伸 45sec，80°C 收集荧光 lOsec，共 45 个循环；从 55°C 到 95°C 绘制溶解曲线，每各〇. 5°C收集荧光一次，时间为lOsec。
[0042] 3?将RNA反转录为cDNA
[0043] 将经纯化后的RNA样品，按bio-rad iscripttmcdna synthesis kit说明书cDNA 合成的体系，根据表4和表5中的RNA浓度，计算所需RNA的体积，并按照表2配制反应体 系后，在Eppendorf热循环仪下进行cDNA的合成。其反应条件为：25°C 5min ;42°C 30min， 85°C 5min ;4°C保存。
[0044] 表2?反转录反应体系
[0045] Table 2.the volume of the reverse transcript
[0046]
[0047] 4. real time-PCR检测水稻该基因的表达情况
[0048] 利用标记Mg-N-1对供试水稻品种的cDNA样品进行基因型和半定量检测，PCR 的反应体系为：取反转录合成的cDNA样品lyl，10iiM actin-primerF lyl，10iiM actin-primerR lyl，iQ SYBR Green SupermixlO y 1, Sterile water 7yl〇 反应循环为： 95°C预变性5min ;95°C变性30sec，57°C退火45sec (各引物的退火温度见表1)，72°C延伸 45seC，80°C读取荧光（具体读荧光值视溶解曲线定）；从95°C到55°C之间作溶解曲线。
[0049] 将实时荧光定量PCR实验所得数据进行整理分析。比较基因在转录水平（mRNA) 的差异时，用进行相对定量，设定对照样品，将未知样品中目的基因的表达量与其 进行比较，得到基因表达的倍数关系。公式为：
[0050] 基因表达倍数=2_AAet
[0051] 其中，AACt = [Ct目的基因（未知样品）一Ct内参基因（未知样品）]一[Ct 目的基因（对照样品）一 Ct内参基因（对照样品）]
[0052] 对照样品是接种0小时取的样品为1倍基因表达量的样品。
[0053]基因表达倍数=[目的基因拷贝数（未知样品）/内参基因拷贝数（未知样品）]/ [目的基因拷贝数（对照样品）/内参基因拷贝数（对照样品）]
[0054] 对照样品是任何被选做代表1倍目的基因表达量的样品。
[0055] 如图1所示为该基因表达的电泳图。
[0056] 其中，1和2为用DNA样品进行扩增的电泳图，3和4为用cDNA样品进行扩增的 电泳图，M 为 ladder markerDL-2000,分子量标记从小到大为 100bp，250bp，500bp，750bp， lOOObp 和 2000bp。
[0057] 表达量
[0058]
[0059] 以上所述，仅为本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何 不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的 保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
[0060]
[0061]
【主权项】
1. 一种检测稻瘟病抗性与氮肥响应的表达型分子标记及其应用，其特征在于，根据与 氮诱导蛋白相关的基因0s04g0379600序列设计的一种检测稻瘟病抗性与氮肥响应的表达 型分子标记Mg-N-1，该分子标记参考的0s04g0379600基因的DNA核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。2. 根据权利要求1所述的一种检测稻瘟病抗性与氮肥响应的表达型分子标记及其应 用，其特征在于，以SEQID NO: 1序列为基础，利用Primerdesign设计的跨一个内含子的 特异分子标记Mg-N-1，Mg-N-I标记的正反引物序列为： 正向引物（5' -3' )GCTAATGGCACAACCTGACA 反向引物（5' -3'）TAGGAGTATGCTGGCCATGT。3. 根据权利要求1或2所述检测稻瘟病抗性与氮肥响应的表达型分子标记检测稻瘟病 抗性与氮肥响应的表达型方面的应用。
【专利摘要】一种检测稻瘟病抗性与氮肥响应的表达型分子标记及其应用，根据与氮诱导蛋白相关的基因Os04g0379600序列设计了一种检测稻瘟病抗性与氮肥响应的表达型分子标记Mg-N-1，该分子标记参考的Os04g0379600基因的DNA核苷酸序列如SEQ？ID？NO:1所示。以SEQ？ID？NO:1序列为基础，利用Primer？design设计的跨一个内含子的特异分子标记Mg-N-1，Mg-N-1标记的正反引物序列为：正向引物(5′-3′)GCTAATGGCACAACCTGACA；反向引物(5′-3′)TAGGAGTATGCTGGCCATGT。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105039531
【申请号】CN201510390144
【发明人】刘林, 李成云, 杨静, 赵婧, 杜云龙, 彭莞云, 杨雅婷
【申请人】云南农业大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月6日