p53寡聚化结构域、功能蛋白结构域和谍捕手； (iii)从N端至C端依次为谍标签、第一功能蛋白结构域、肿瘤抑制因子p53寡聚化结构 域、第二功能蛋白结构域和谍捕手，其中第一功能蛋白结构域和第二功能蛋白结构域可以 相同，也可以不同。所述功能蛋白结构域也不限于是一个结构域，也可以是多个结构域。对 于（b)结构，同样可以进行这样的功能蛋白插入。
[0020] 此外，功能蛋白还可以位于索烃环外，在（a)或（b)结构基础上，于N端和/或C端 添加任意的一个或者多个相同或不同的功能蛋白结构域。这样的蛋白质索烃单体结构包括 但不限于以下几种情况：（I)从N端至C端依次为功能蛋白结构域、谍标签、肿瘤抑制因子 P53寡聚化结构域和谍捕手；（II)从N端至C端依次为谍标签、肿瘤抑制因子p53寡聚化结 构域、谍捕手和功能蛋白结构域；（III)从N端至C端依次为第一功能蛋白结构域、谍标签、 肿瘤抑制因子P53寡聚化结构域、谍标签和第二功能蛋白结构域，其中第一功能蛋白结构 域和第二功能蛋白结构域可以相同，也可以不同。在上述（I)至（III)任意一个结构中，谍 标签和谍捕手的位置可以互换，并且在谍标签与肿瘤抑制因子P53寡聚化结构域之间，和/ 或，谍捕手与肿瘤抑制因子P53寡聚化结构域之间还可以插入任意的一个或者多个功能蛋 白质结构域。也就是说，在索烃环中和索烃环外可以同时具有功能蛋白结构域。
[0021] 上述蛋白质索烃单体的结构设计是以谍标签-谍捕手反应对和肿瘤抑制因子p53 寡聚化结构域为例进行说明的，但这并不意味着只能以谍捕手和谍标签作为蛋白质反应对 和以肿瘤抑制因子P53寡聚化结构域作为蛋白互锁结构单元，本领域技术人员可以选择任 何可基因编码的蛋白质反应对来实现单体分子的环化，以及选择任意可基因编码的蛋白互 锁结构单元来实现单体分子的相互缠绕。
[0022] 上述步骤2)通过重组DNA技术构建蛋白质索烃单体对应的基因，并引入到合适的 载体质粒中。原核表达系统适用的载体例如PQE以及pET系列质粒。为后续的纯化方便， 可以在蛋白质索烃单体的N端或C端加上His标签。
[0023] 上述步骤3)通常是将构建的质粒导入大肠杆菌工程菌中表达所述蛋白质索烃单 体，表达温度可以是16°C _37°C间的任意温度。根据实际需要，也可以利用真核表达系统来 表达所述蛋白质索烃单体。
[0024] 上述步骤4)中，常用的纯化方法是对于添加了 His标签的蛋白质索烃单体进行镍 亲和层析。
[0025] 本发明的蛋白质索烃制备方法的技术优势在于可以利用基因编码的形式，在细胞 体内较为高效地获得具有索烃结构的蛋白质，能够最大程度地降低蛋白质索烃制备的难 度，获得功能稳定的活性蛋白质。
【附图说明】
[0026] 图1显示了实施例3测定的AEXEB在不同温度下的表达情况。
[0027] 图2显示了 AEXEB镍柱纯化后粗产品的凝胶过滤色谱数据。
[0028] 图3显示了 AEXEB蛋白质索烃的飞行时间质谱数据。
[0029] 图4显示了 AEXEB蛋白质索烃酶切的数据。
[0030] 图5显示了实施例3测定的EAXEB在不同温度下的表达情况。
[0031] 图6显示了 EAXEB镍柱纯化后粗产品的凝胶过滤色谱数据。
[0032] 图7显示了 EAXEB蛋白质索烃的飞行时间质谱数据。
[0033] 图8显示了 EAXEB蛋白质索烃酶切的数据。
[0034] 图9显示了 AXB与BXA的酶切图。
[0035] 图10显示了 AXB(a)与BXA(b)的飞行时间质谱数据。
【具体实施方式】
[0036] 下面通过实施例进一步对本发明进行详细说明，但不以任何方式限制本发明的范 围。
[0037] 制备蛋白质索烃的具体步骤为，通过重组基因工程技术构建含有His6标签、谍捕 手（A)、肿瘤抑制因子p53寡聚化结构域（X)、弹性蛋白类似物（E)(或者是BLA、DHFR和 mCherry等其他蛋白）以及谍捕手（B)融合蛋白的序列的质粒，然后通过分子克隆方法将 质粒转化到大肠杆菌中表达融合蛋白，再通过亲和层析等蛋白提纯方法获得纯化的目标 融合蛋白。所述目标融合蛋白包括：AEXEB、EAXEB、AXB、BXA、AX-mCherry-B、AX-BLA-B、 AX-DHFR-B0
[0038] 利用尺寸排阻色谱，烟草蚀纹病毒蛋白酶（TEV)酶切，基质辅助激光解吸电离飞 行时间质谱等手段表征了 AEXEB、EAXEB的分子量，拓扑结构等性质。
[0039] 所涉及到的检测手段如下：
[0040] 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)进行样品分析。
[0041] 尺寸排阻色谱（SEC)使用的是GE Healthcare公司的快速蛋白液相色谱（FPLC)。 使用的色谱柱为Superdex 200increase 10/300GL。流动相为PBS (IOmM磷酸氢二钠，2mM 磷酸二氢钾，137mM氯化钠，2. 7mM氯化钾，pH = 7. 4)。
[0042] 实施例1 :构建AEXEB以及EAXEB融合蛋白质粒并在大肠杆菌中表达
[0043] 本实施例所构建的AEXEB序列如序列表中SEQ ID No :7所示，其中第14~26位 是A，第29~108位以及151~230是E，第111~148位是X，第233~359是B，第237~ 243位是TEV酶切位点。
[0044] 本实施例所构建的EAXEB序列如序列表中SEQ ID No :8所示，其中第96~108位 是A，第14~93位以及154~233是E，第114~151位是X，第238~364是B，第242~ 248位是TEV酶切位点。
[0045] 将上述融合蛋白的基因序列导入载体PQE-80L中，随后转化大肠杆菌。
[0046] 在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。在大规模表达之前，先将转化得到的单克隆菌接 种在IOmL 2XYT培养基中（含lOOyg/mL氨苄青霉素），在37°C、250rpm条件下震荡培养 过夜。第二天转接入IL新鲜2XYT培养基中（3L摇瓶中，含lOOyg/mL氨苄青霉素）进行 大规模培养并诱导表达。具体步骤如下：37°C、200rpm条件下震荡培养约2h，0D 6。。约为0. 5 到0.8,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG)，终浓度为ImM，随后在180rpm，16°C培养 24h或37°C培养4h后收集菌体。
[0047] 实施例2 :构建AXB以及BXA融合蛋白质粒并在大肠杆菌中表达
[0048] 本实施例所构建的AXB序列如序列表中SEQ ID No :9所示，其中第16~28位是 A，第33~70位是X，第77~203是B，第81~87位是TEV酶切位点。
[0049] 本实施例所构建的BXA序列如序列表中SEQ ID No : 10所示，其中第17~143是 B，第21~27位是TEV酶切位点，第156~193位是X，第199~211位是A。
[0050] 以上蛋白序列是构建在PQE-80L表达载体中。随后在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。 在大规模表达之前，先将转化得到的单克隆菌接种在5mL 2XYT培养基中（含有lOOyg/mL 氨苄青霉素），在37°C，250rpm条件下震荡培养过夜，第二天将其转入IL新鲜的2 X YT培养 基中（盛在3L的三角瓶中，含100 μ g/mL氨苄青霉素），在37°C，250rpm条件下进行大规模 的培养，待其OD6。。长到0. 6-1. 0之间，加入异丙基-β -D-硫代半乳糖苷（IPTG)诱导，终浓 度为0.1 mM，然后培养温度设为16°C，220rpm，培养20h后收集菌体。
[0051 ] 实施例3 :镍亲和层析柱纯化AEXEB以及EAXEB索烃蛋白质
[0052] 将IL大肠杆菌培养液收集于离心瓶，以5000g离心力离心收集菌体，去除上层培 养液。用含2 %吐温20与ImM苯甲基磺酰氟的40mL变性缓冲溶液A (20mM磷酸氢二钠，500mM 氯化钠，25mM咪唑，8M尿素 ，pH = 8. 0)重悬菌体，再用超声仪在4°C条件下破碎细胞，然后 将大肠杆菌破碎产物在4°C，28000g离心力下离心20分钟。得到的上清液与被变性缓冲溶 液A平衡的镍亲和树脂混合，在4°C下搅拌lh。混合物置于空柱中，进行重力流洗脱，洗脱 液为变性缓冲溶液B (20mM磷酸氢二钠，500mM氯化钠，8M尿素，250mM咪