体的重链可变区及恒定区或轻链可变区及恒定区 序列的氨基酸序列。
[0024] 其中，本发明还提供了一种转染上述重组DNA表达载体的宿主细胞，所述宿主细 胞包含大肠杆菌等原核细胞、酵母或哺乳动物细胞。
[0025] 优选地，所述宿主细胞包含HEK293E细胞、CHO细胞或NSO细胞。
[0026] 其中，本发明还提供了一种含有上述轻链或上述重链的抗体，用于全抗、单链抗 体、单域抗体、双特异抗体、抗体药物偶联物或嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。
[0027] 其中，本发明还提供了一种含有上述轻链或上述重链的单克隆抗体、人工载体、药 物或药物组合物
[0028] 其中，本发明还提供了一种含有上述轻链或上述重链的检测试剂或试剂盒。
[0029] 其中，所述抗ro-i的单克隆抗体包含全长抗体和抗ro-i单克隆抗体的片段，所述 片段包含但不限于？ &13、？&13'、？(&13'）2、？￥或3〇卩￥。
[0030] 其中，所述全长抗体是全人源的。
[0031] 其中，所述抗ro-i的单克隆抗体的重链恒定区包含IgGU IgG2、IgG3和IgG4 ;所 述轻链恒定区包含Ck或Cp
[0032] 优选地：所述恒定区为IgG4。
[0033] 优选地，所述轻链恒定区为C κ。
[0034] 其中，所述 CDR 为互补决定区（complementarity-determining region);所述 ScFv为单链抗体（single-chain fragment variable);所述ADCs为抗体药物偶联物 (antibody-drug conjugates);所述CAR-T为嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy);所述HEK293E细胞为人胚肾293E细胞（human embryonic kidney293E cell) ;CH0 细胞为中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cell) ;NS0细胞为小鼠 NSO胸腺瘤细胞。
[0035] 本发明相对于现有技术而言，具备的有益效果是：
[0036] 本发明提供的单克隆抗体可以通过消除、抑制ro-i活性来预防或治疗疾病，其中 所述疾病选自癌症、感染性疾病或免疫系统疾病。所述癌症包括但不限于肺癌、肾癌、黑色 素瘤、乳腺癌、肝癌、头颈癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、卵巢癌、骨癌、结直肠癌、膀胱癌、胃癌、胰 腺癌、前列腺癌、霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性或急性白血病、实体瘤。所述感染性疾 病包括不限于HIV病毒感染、肝炎病毒（A型、B型和C型）感染、疱疹病毒感染、流感病毒感 染。所述免疫系统疾病包括不限于红斑狼疮、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、重症肌无力、多 发性硬化症、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、硬皮病、结节性多动脉炎、Wegener 肉芽肿病。
[0037] 说明书附图
[0038] 图 1、pScFvDisb-s 质粒图谱；
[0039] 图2、轻链突变库构建中以DFPDl-I为模板扩增的重链及linker区电泳图；
[0040]图3、轻链突变库构建中以合成的轻链突变库为模板扩增的轻链库基因电泳图；
[0041] 图4、轻链突变库构建中通过扩增获得的VIXDR123M-DFPD1-1突变库的电泳图；
[0042] 图5、轻链突变库构建中通过NcoI-HF和NotI对质粒pScFvDisb-s进行双酶切的 酶切产物的电泳图；
[0043] 图6、单克隆phage ELISA鉴定phage-Abs的相对亲和力；
[0044] 图7、梯度稀释phage ELISA鉴定phage-Abs的相对亲和力；
[0045] 图8、重链突变库构建中以合成的重链突变库为模板扩增的重链库基因的电泳 图；
[0046] 图9、重链突变库构建中以DFPD1-3和DFPD1-7质粒为模板扩增的轻链及linker 区的电泳图；
[0047] 图10、重链突变库构建中通过扩增获得的VHCDR123M-DFPD1-3突变库的电泳图；
[0048] 图11、重链突变库构建中通过扩增获得的VHCDR123M-DFPD1-7突变库的电泳图；
[0049] 图12、单克隆phage ELISA鉴定phage-Abs的相对亲和力；
[0050] 图13、梯度稀释phage ELISA鉴定phage-Abs的相对亲和力；
[0051] 图14、pTSE质粒载体图；
[0052] 图15、全抗体与ro-i在分子水平上结合试验；
[0053] 图16、全抗体与PD-Ll的竞争抑制试验；
[0054] 图17、全抗体与细胞表面的ro-i结合试验；
【具体实施方式】
[0055] 本发明详细的实施方法参见实施例，实施例中所述的实验方法和试剂，若无特殊 说明均为常规实验方法和试剂。以下实施例仅用于说明和解释本发明，而不是以任何方式 限制本发明。
[0056] 本发明提供了一种特异性结合ro-i的单克隆抗体，所述重链可变区序列包含SEQ NO. 1、2、3、4,所述轻链可变区序列包含SEQ NO. 5、6、7、8、9、10、11。
[0057] 优选地，所述特异性结合ro-i的单克隆抗体的重链可变区序列包含SEQ NO. 2、3、 4,所述轻链可变区序列选自SEQ NO. 7、11。
[0058] 通过轻链噬菌体库筛选，所述抗体轻链或其功能性片段的轻链互补决定区LCDR1、 IXDR2和IXDR3的氨基酸序列选自以下各氨基酸序列中的一组（如表1所示）。
[0059] 表1、轻链各个⑶R区的氨基酸序列
[0060]
[0061] 通过重链噬菌体库筛选，所述抗体重链或其功能性片段重链的互补决定区 CDRl，CDR2 和 CDR3 分别用 HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 表示：HCDRl 为 SNNGMH 或 SNYGMH ; HCDR2 为 VIWYDGSKK、VIWYDSSRK 或 VIWYDSTKK 中的任一种；HCDR3 为 TAVYYCATNNDYW 或 TAVYYCATNTDYffo
[0062] 优选地，通过重链噬菌体库筛选，所述特异性结合Η)-1的单克隆抗体包含HCDRl、 HCDR2和HCDR3序列的重链可变区及含IXDRl、IXDR2和IXDR3序列的轻链可变区。其中，所 述重链可变区HCDRl序列为选自SNNGMH、SNYGMH的氨基酸；所述轻链可变区LCDRl序列为 选自RASQSIHNYLD、RASQSVSNYLD的氨基酸；所述重链可变区HCDR2序列为选自VIWYDGSKK、 VIWYDSSRK的氨基酸；所述轻链可变区LCDR2序列为选自NASTRAT、DASTRAT的氨基酸；所述 重链可变区HCDR3序列为选自TAVYYCATNNDYW、TAVYYCATNTDYW的氨基酸；所述轻链可变区 LCDR3序列为选自QQELHLPLT、QQNMQLPLT的氨基酸。
[0063] 本发明利用全合成ScFv单链噬菌抗体库获得特异性抗体的方法，所述全人源的 特异性结合ro-i的单克隆抗体是利用噬菌体抗体库技术筛选而得，其步骤在于：
[0064] (1)、抗ro-i单链抗体的生物淘选，通过三轮抗体库的富集筛选，获得了一种亲和 力较高的抗体序列DFPDl-I。
[0065] (2)、以DFPDl-I为基础，通过计算机辅助设计，构建轻链⑶RU2、3突变库并对该 抗体库进行生物淘选和阳性克隆的筛选及鉴定，获得了 6种不同轻链的抗体序列DFPD1-2、 DFPD1-3、DFPD1-4、DFPD1-5、DFPD1-6、DFPD1_7。将上述7种单链抗体在噬菌体水平进行亲 和力比较。
[0066] (3)、选出两株亲和力较高的克隆DFPD1 -3和DFPD1 -7，构建重链CDRl、2、3库 并对该库进行生物淘选和阳性克隆的筛选，获得了五种不同序列的单链抗体DFPD1-9， DFPD1-10, DFPD1-11，DFPD1-12, DFPD1-13。将上述单链抗体在噬菌体水平上进行亲和力比 较。
[0067] (4)、将（3)中所述单克隆重链可变区基因和轻链可变基因及轻重链恒定区基因 克隆到真核表达载体，转染宿主细胞，获得单克隆抗体的全抗，再进行亲和力和其他生物学 功能比较。
[0068] 具体实施例：
[0069] 以下结合附图和实施例详述本发明。
[0070] 实施例1、抗ro-i单链抗体的生物淘选
[0071] 采用一系列基因克隆的方法对载体pCom3载体（购自中国质粒载体菌株细胞株基 因保藏中心）进行改造，使之用于噬菌体单链抗体库的构建和表达。改造后的载体命名为 pScFvDisb-s，其质粒图谱如图1所示，并以此载体为基础，构建全合成噬菌体抗体库。
[0072] 以I3D-I-His为抗原包被免疫管，抗原包被量为5ug/500ul/管，4°C包被过夜。再 用4%脱脂奶粉/PBST分别封闭免疫管和全合成噬菌体抗体库，室温封闭lh。封闭后的 噬菌体抗体库加入免疫管中进行抗原抗体结合，噬菌体投入量约为IO9-IO12个，室温反应 lh。PBST-PBS洗去未结合的噬菌体，0.1 M PH2. 2的Glycine-HCl洗脱，用I. 5M PH8. 8的 Tris-HCl中和洗脱下来的噬菌体抗体溶液至PH7. 0左右。
[0073] 将上述中和后的噬菌体感染IOml生长至对数期的TGl菌液，37°C培养箱中静置 30min，取出部分菌液进行梯度稀释，涂布于2YTAG平板上，用于计算噬菌体产出量。剩余的 菌液离心弃上清，将菌体沉淀重悬于少量培养基，吸出后涂布于2YTAG大平板，为下一轮